1928年，亚历山大·弗莱明爵士在度假归来后检查发霉的培养皿时，注意到霉菌周围没有细菌生长。他后来发现这种霉菌分泌了一种抗菌物质，即后来被称为青霉素的药物。这一药物发现彻底改变了医学。青霉素是多种偶然发现的药物之一。然而，如今弗莱明所经历的偶然性已鲜有发生。药物发现已被证明极其困难。潜在的小分子药物数量多达数千万，使得寻找有效疗法如同大海捞针。此外，即使成功进入临床试验的药物，也有90%会失败（图1）。为了应对这一瓶颈，药物首先在细胞上进行疗效筛选。大量研究投入于提高评估药物疗效的通量。一种新兴的方法是基于图像的轮廓分析，即使用相关标记物可视化细胞特征，这些特征能反映药物效果，并通过计算机视觉进行高通量分析。随着深度学习在图像分析中的应用进步，基于图像的轮廓分析正成为评估药物疗效越来越有吸引力和可行的选择，并有望加速药物发现过程。
在此，我将讨论基于图像的轮廓分析如何融入现代药物发现方法，以及它如何已被用于识别药物效果和作用机制。
目录
- 药物发现的基础
- 药物筛选与轮廓分析
- 基于图像的轮廓分析方法
- 基于图像的轮廓分析实践
- 基于图像的轮廓分析在药物发现中的未来展望
药物发现始于识别具有有利分子作用机制且具有可重复和稳健效果的分子
正如我之前提到的，大量潜在药物分子使得在哺乳动物和人类身上进行初步测试既不切实际也不道德。因此，培养的细胞更适合作为测试药物初始效果的受试对象。它们可以以相对较低的成本获取和培养，且数量众多使得对药物效果的统计分析变得可行。这也提高了待测试潜在药物的通量。此外，细胞分辨率有助于剖析药物的作用机制。这对于确定其治疗潜力并揭示潜在问题（如毒性）至关重要。
一旦候选药物在体外显示出效果，就可以在越来越接近人类的物种（如啮齿动物和非人灵长类动物）中启动动物试验。如果药物在疾病动物模型中显示出良好的治疗效果，就可以开始临床试验。这包括多个阶段，随着时间的推移，在越来越多的人类队列中评估药物的安全性和有效性（图1）。
图1：药物发现和临床试验的瓶颈
尽管许多人（包括我之前）批评临床试验的高失败率，但药物通过临床前试验构成了一个更大的瓶颈。数千种候选药物中可能只有一种能成功，这仅占极小比例。这一瓶颈凸显了开发更高效高通量方法的紧迫性。为了确定候选药物的初步疗效和分子作用机制，有两种高通量方法：筛选和轮廓分析。
筛选 vs. 轮廓分析：带着清单去超市还是空着肚子去？
你是带着精心准备的清单去超市，还是到了超市评估一下商品，然后凭感觉挑选？这两种截然不同的方式正对应了药物发现中筛选与轮廓分析的区别。
筛选是一种常用的方法。在药物筛选中，使用一种既易于分析又能紧密近似疾病相关反应的读数。这种读数可以是多种形式。在基于靶点的筛选中，该读数可以是与特定疾病相关蛋白的相互作用。一个例子是筛选与淀粉样β蛋白（一种在神经退行性疾病阿尔茨海默病中富集的蛋白质）相互作用的分子。该读数也可以是分子事件。在基于通路的筛选中，可以检测与疾病相关的生化通路中的某个过程。例如，在泰-萨克斯病中，一种参与葡萄糖代谢的酶发生突变，导致细胞毒性副产物积累。针对泰-萨克斯病的通路筛选可能包括筛选影响同一代谢通路活性的药物。尽管筛选是药物发现中高效且有针对性的工具，但它需要疾病存在明确且易于测量的分子标记。这有时可能不可行，我们也不一定总能识别和验证疾病状态的特征。这促使了药物发现中另一种方法——轮廓分析。
轮廓分析弥补了筛选的弱点，因为它可以捕获多种细胞和分子特征，从而提供更全面的视角来评估疾病状态和药物疗效。在轮廓分析中，样本（如细胞）可以通过其轮廓来表示，该轮廓包含多种可能相关的特征，这些特征可以通过常用的染色技术获得。轮廓分析得益于染色，因为可以标记多个细胞特征，并同时检查这些独立的信息流，以获取关于细胞状态的多维视角，而细胞状态可能受疾病和/或药物影响。一种常用的染色方法是Cell Painting，它是一系列六种染色剂，可以对线粒体和细胞核等离散细胞特征进行形态学轮廓分析（图2）。这是表型筛选的一个例子，其中直接观察到的形态变化能反映疾病状态和/或药物效果。借助Cell Painting，我们拥有丰富的形态学特征来探究药物疗效，并可能发现更简单的靶点和通路筛选所遗漏的未经验证的药物效果。使用染色剂从图像生成细胞轮廓进行表型筛选的方法已被广泛采用，称为基于图像的轮廓分析。
图2：Cell Painting输出通道用于离散细胞特征
将机器学习整合到基于图像的轮廓分析中，为药物发现提供了一种可行且有效的方法
基于图像的轮廓分析越来越受欢迎，自动化分析高内涵图像的方法也随之发展。为了提高基于图像的轮廓分析的通量并有效利用生成的高维轮廓，药理学家与计算机科学家合作，开发了基于机器学习的方法来发现和识别药物效果。我之前提到，Cell Painting提供了高维图像集，可用于进行表型筛选或细胞轮廓分析。需要分析的表型及其组合是巨大的。更不用说，微小的差异可能无法通过常规的手动定量方法获得。由于手动注释或批量分析无法适应待测试的大量潜在药物，因此自动化分析这些数据的方法至关重要。这些模型理论上可以执行哪些任务？
Cell Painting染色细胞中的遗传和结构成分以及重要的细胞器（如线粒体）。可以训练模型生成易于识别的边界（如细胞膜和细胞核）的感兴趣区域。这些ROI掩膜随后可应用于其他通道，并提取关于其他细胞区室的信息（图3）。例如，从模型预测的细胞轮廓中提取几何量，可以揭示药物如何影响细胞结构，这可以通过观察另一个通道中细胞骨架蛋白（如肌动蛋白）的强度分布进一步确认。根据疾病的不同，这可能揭示药物的假定作用机制，例如影响参与肌动蛋白聚合的分子。随后可以开始针对该药物的顺序靶点筛选。尽管这个例子说明了在Cell Painting样本的基于图像轮廓分析中，执行细胞轮廓的模型如何能顺序地推导出药物的假定作用机制，但这仅仅是理论上的。这引出了一个问题：基于图像的轮廓分析在实践中是如何使用的？
图3：使用Cell Painting技术输出的细胞膜和细胞核分割
使用机器学习的基于图像轮廓分析可准确预测化合物的药理活性
了解化合物的药理活性对于开发其作用机制并解释其潜在治疗效果至关重要。我们能否从细胞样本的生物图像中推断出化合物的活性？基于图像的轮廓分析提供了一个有吸引力的途径，因为图像的高内涵和多种染色可以预测多个细胞内靶点的活性。简而言之，一张图片胜过千次靶点筛选。一个团队对此进行了测试。Simm等人2018年旨在从图像中预测化合物的活性。为此，他们使用无监督分割方法从细胞图像中提取形态测量特征。利用糖皮质激素受体HTI测定的活性数据，他们训练了一个卷积神经网络来预测化合物的活性（图4）。他们不仅发现可以准确预测活性，而且与典型的靶点筛选方法相比，基于图像的轮廓分析使化合物命中率提高了5倍。
图4：基于图像轮廓分析评估药物活性的工作流程
用于评估活性的基于图像轮廓分析的数据集正变得可用。例如，一个团队创建了“Cell Image Library”存储库，其中积累了来自919,874个五通道视野的数据，代表了30,616种测试化合物。
除了化合物的活性，评估其毒性也是药物发现过程中的关键步骤。基于图像的轮廓分析如何用于评估潜在药物的毒性？
使用机器学习的基于图像轮廓分析可准确预测化合物的毒性
一种化合物达到了对疾病状态的预期效果，并不意味着它对人使用是安全的。事实上，17%的III期临床试验因安全问题而失败。因此，评估化合物的毒性与其疗效同样重要。基于图像轮廓分析的广泛捕获使其对检测细胞效应高度敏感，从而能够预测化合物的毒性。
一个团队利用基于图像的轮廓分析来确定异源物质对肾细胞的肾毒性。他们测试了44种参考化合物，作用于培养的人肾近端小管细胞。然后，他们使用基于随机森林算法的自动化流程，量化了129个与细胞、细胞核和细胞结构元素相关的图像特征，用于单特征和多特征检测。他们实现了超过80%的肾毒性预测准确率。此外，使用Cell Painting技术的基于图像轮廓分析已被用于高效地进行大规模环境化学物质毒性筛选。
使用机器学习的基于图像轮廓分析可推断化合物的作用机制
确定药物的作用机制对于进行临床试验至关重要，并且是美国FDA的要求。了解药物的分子靶点可以揭示其治疗潜力和潜在的脱靶效应。通常，非基于图像的测定（如检测磷酸化）被用于评估MOA。然而，最近基于图像的轮廓分析已成为推断MOA的准确工具。通过成像假定的分子和细胞靶点，可以量化和提取改变的图像特征。这一策略已在肿瘤学研究中得到应用。
例如，在结直肠癌模型中，对经受细胞周期调节药物处理的细胞图像使用自定义分类器进行分析。他们能够推断出化合物的激酶活性。另一个团队开发了一种新的基于图像的轮廓分析方法，用于测量癌症的各个方面，如线粒体凋亡、DNA损伤和细胞周期干扰。在肿瘤学之外，基于图像的轮廓分析已被用于一般靶点和通路筛选，以确定近3000种化合物的MOA。通过使用形状、强度和纹理等基于图像的读数，一个团队能够生成指纹，作为其聚类算法的基础。他们能够区分与单个细胞内靶点（如微管蛋白）和细胞内信号通路（如mTOR）相关的离散簇。尽管他们使用的化合物具有已知的MOA，但作者的聚类方法能够提取出新的化合物-靶点关联，这强调了基于图像轮廓分析在无偏确定MOA方面的强大能力。
基于计算机的自动化药物发现的未来有乐观的改进空间
随着深度学习模型和聚类算法的统计和分析能力不断增强，基于图像的轮廓分析拥有乐观的未来。尽管Cell Painting提供了高内涵的基础来提取图像特征，但迄今为止大多数研究都使用了简单的图像特征，如细胞和细胞核形态。尽管这证明了基于图像轮廓分析的潜力，但改进亚细胞区室和细胞器的分割与量化可以进一步提高其在药物发现中的预测能力和通量。这可能依赖于开发新的成像测定法和/或使用更高分辨率的成像方法。总体而言，基于图像的轮廓分析已经重塑了我们对药物发现方法的构想，并且正变得越来越广泛可用和采用。
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