摘要
牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是慢性牙周炎的关键病原体，在阿尔茨海默病（AD）患者的大脑中也被发现。该细菌产生的毒性蛋白酶——牙龈蛋白酶（gingipains）同样存在于AD患者大脑中，且其水平与tau蛋白和泛素病理相关。小鼠经口感染P. gingivalis后，细菌侵入大脑并导致Aβ1-42（淀粉样斑块组分）生成增加。此外，牙龈蛋白酶在体内和体外均具有神经毒性，对神经元正常功能所需的tau蛋白产生有害影响。为阻断这种神经毒性，我们设计并合成了靶向牙龈蛋白酶的小分子抑制剂。抑制牙龈蛋白酶可减少已建立的P. gingivalis脑感染中的细菌负荷，阻断Aβ1-42的产生，减轻神经炎症，并挽救海马神经元。这些数据表明，牙龈蛋白酶抑制剂可能对治疗AD中的P. gingivalis脑定植和神经退行性变具有价值。
引言
阿尔茨海默病（AD）患者表现出与感染一致的神经炎症，包括小胶质细胞活化、炎症小体活化、补体活化和细胞因子谱改变。已在脑中发现了感染性病原体，并被认为与AD有关，但尚未建立强有力的因果证据。近期对β-淀粉样蛋白（Aβ）作为抗菌肽的鉴定，重新激发了人们对寻找AD可能的感染性病因的兴趣。
慢性牙周炎（CP）及其关键病原体牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）已被确定为Aβ斑块、痴呆和AD的重要风险因素。一项前瞻性观察研究发现，伴有活动性CP的AD患者在6个月内认知能力显著下降（阿尔茨海默病评定量表-认知和简易精神状态检查量表），这引发了关于这些发现背后可能机制的问题。在Apoe−/−小鼠中，经口感染P. gingivalis（而非其他两种口腔细菌）会导致脑部感染和补体通路激活。在过表达突变人类淀粉样前体蛋白（hAPP-J20）的转基因小鼠中，经口感染P. gingivalis会损害认知功能，增加AD样斑块沉积，并导致牙槽骨丢失。已在人类AD大脑中检测到P. gingivalis脂多糖，支持了P. gingivalis脑感染在AD发病机制中起作用的假说。
P. gingivalis主要存在于牙龈和牙周感染中；然而，在25%无口腔疾病的健康个体中也可低水平检测到。刷牙、使用牙线、咀嚼等日常活动以及牙科手术过程中可能发生P. gingivalis的短暂菌血症，导致其易位至多种组织，包括冠状动脉、胎盘和肝脏。最近一项研究发现，100%的心血管疾病患者存在P. gingivalis动脉定植。
P. gingivalis是一种不发酵糖类的革兰氏阴性厌氧菌，产生称为牙龈蛋白酶的主要毒力因子，这些半胱氨酸蛋白酶包括赖氨酸牙龈蛋白酶（Kgp）、精氨酸牙龈蛋白酶A（RgpA）和精氨酸牙龈蛋白酶B（RgpB）。牙龈蛋白酶被分泌，转运至细菌外膜表面，并以可溶性和外膜囊泡（OMV）相关形式部分释放到细胞外环境中。Kgp和RgpA/B对P. gingivalis的存活和致病性至关重要，在宿主定植、宿主防御失活、铁和营养获取以及组织破坏中发挥关键作用。牙龈蛋白酶已被证明可介导P. gingivalis在内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞中的毒性。此外，由于广谱抗生素治疗很少能根除P. gingivalis，且可能导致耐药性，牙龈蛋白酶被视为窄谱毒力靶点。用短肽类似物阻断牙龈蛋白酶的蛋白水解活性可降低P. gingivalis的毒力。
我们假设P. gingivalis感染通过分泌牙龈蛋白酶促进神经元损伤，从而在AD发病机制中起作用。我们发现，AD大脑中的牙龈蛋白酶免疫反应性（IR）显著高于非AD对照个体。此外，我们在AD大脑和诊断为很可能AD的活体患者的脑脊液（CSF）中鉴定出P. gingivalis DNA，提示CSF P. gingivalis DNA可能作为差异诊断标志物。我们开发并测试了有效的、选择性的、脑渗透性的小分子牙龈蛋白酶抑制剂。我们的结果表明，小分子抑制牙龈蛋白酶具有改善AD的潜力。
AD诊断与大脑中牙龈蛋白酶负荷相关
使用包含AD患者和神经学正常个体的颞中回（MTG）脑组织芯块的性别和年龄匹配的组织微阵列（TMA）进行免疫组化（IHC）研究。使用分别靶向RgpB和Kgp的牙龈蛋白酶特异性抗体CAB101和CAB102测定脑组织芯块中的牙龈蛋白酶负荷。使用识别非磷酸化和磷酸化tau的抗体测量TMA中的tau负荷。RgpB和Kgp在AD脑组织中显示出点状神经元内染色。基于阈值分析，96%（51/53）的AD样本RgpB阳性，91%（49/54）的AD样本Kgp阳性。AD大脑中的RgpB负荷显著高于非痴呆对照大脑，同样，Kgp负荷也显著高于非痴呆对照。
我们随后对tau进行染色，发现RgpB负荷与tau负荷之间以及Kgp负荷与tau负荷之间存在高度显著的相关性。Tau病理已被证明与AD的认知障碍相关。接下来，我们对TMA进行泛素染色，泛素是一种小型蛋白标签，标记受损蛋白以供蛋白酶体降解，并在tau缠结和Aβ斑块中积累。TMA中RgpB负荷与泛素负荷之间以及Kgp负荷与泛素负荷之间存在显著相关性。值得注意的是，在非痴呆对照组织中，39%（18/46）的样本观察到RgpB染色，52%（26/50）的样本观察到Kgp染色。非痴呆对照样本中牙龈蛋白酶负荷与tau负荷之间以及牙龈蛋白酶与泛素负荷之间的相关性分析显示，对照中已存在牙龈蛋白酶和AD病理的连续谱。这些发现与临床前AD的概念一致，即疾病发病机制已经开始但临床症状尚未出现。
为进一步验证TMA中的牙龈蛋白酶IHC，我们进行了RgpB负荷与Kgp负荷之间的相关性分析，发现两种不同抗原之间存在显著相关性。作为进一步的IHC对照，使用CAB101抗体检测了几种不同非AD神经疾病的脑TMA。帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症MTG TMA上的RgpB免疫染色与对照相比无显著差异。总之，大脑中RgpB和Kgp抗原均独立显示出与AD诊断、tau负荷和泛素负荷的显著相关性。
RgpB与AD海马中的神经元、星形胶质细胞和病理共定位
在AD中，海马是首批受损的大脑区域之一。使用与CAB101不同的RgpB抗体（18E6单克隆抗体），通过明视野显微镜在AD海马的齿状回和CA3、CA2、CA1的神经元中确认了RgpB-IR。来自大学脑库的一系列大脑的IHC分析显示RgpB的染色模式相似。使用免疫荧光，RgpB-IR（CAB101）主要与神经元（微管相关蛋白2，MAP2）共定位，以及偶尔的星形胶质细胞，但不与小胶质细胞（Iba1）共定位。此外，RgpB与病理包括tau缠结和神经元内Aβ共定位。
AD大脑皮层中Kgp的检测
AD还与大脑皮层灰质萎缩有关。从三个AD大脑和六个非痴呆对照大脑的大脑皮层裂解物中，用CAB102进行免疫沉淀（IP）并跑Western blot。CAB102多克隆抗体识别Kgp的第22至400位氨基酸，覆盖前肽和催化结构域的N端区域。所有三个AD大脑的WB均显示出与P. gingivalis菌株W83、ATCC33277和FDC381细菌裂解物中Kgp条带分子量相对应的相似Kgp条带。菌株HG66（其牙龈蛋白酶在细胞表面保留存在突变）仅显示一条处于Kgp催化结构域分子量的Kgp条带。在所有AD大脑样本中均鉴定出正确分子量的Kgp催化结构域。此外，五个非痴呆对照大脑显示出与AD大脑相似的Kgp条带模式，与我们的IHC数据一致，表明非痴呆对照大脑中也存在牙龈蛋白酶和AD病理的连续谱。在第六个非痴呆对照大脑样本（C6）中，Kgp条带非常微弱，表明几乎不存在Kgp。
AD大脑皮层中P. gingivalis 16S rRNA和hmuY基因的鉴定
为进一步验证Kgp蛋白检测数据，我们对用于Kgp IP和WB分析的同一脑组织分离的DNA进行了定量PCR（qPCR）分析。使用P. gingivalis 16S rRNA引物的qPCR分析显示，AD大脑和五个非痴呆对照大脑中存在P. gingivalis 16S rRNA基因。对照大脑C6（在Kgp IP/WB中几乎无Kgp条带）的qPCR检测为阴性。为进一步验证16S rRNA qPCR结果，我们使用针对hmuY基因（P. gingivalis高度特异性基因）的引物进行PCR分析。所有三个AD大脑和五个16S rRNA阳性对照大脑也均为hmuY基因阳性，对hmuY PCR产物进行测序确认了大脑DNA中存在P. gingivalis。由于我们使用高度灵敏的PCR方法检测低拷贝数的P. gingivalis DNA，我们担心在脑DNA存在下对常见革兰氏阴性菌（如P. gingivalis）进行巢式扩增可能产生假阳性信号。因此，作为额外的阴性对照，我们使用相同巢式引物方法尝试检测另一种普遍存在的革兰氏阴性菌——幽门螺杆菌（H. pylori）。我们检测了三个AD脑DNA样本和三个P. gingivalis阳性非痴呆脑DNA样本的H. pylori。所有六个脑样本使用验证的qPCR引物和探针检测均为阴性，表明我们的P. gingivalis PCR结果不太可能是由于PCR人工产物。总之，在AD大脑和Kgp阳性非痴呆对照大脑中鉴定出P. gingivalis DNA，进一步验证了通过IP和WB在同一脑组织样本中鉴定出Kgp。
临床AD患者CSF中存在P. gingivalis DNA
脑脊液（CSF）被认为是脑部感染的“窗口”，可提供对感染性病原体神经发病机制的见解。因此，我们进行了一项前瞻性试点研究，使用从10名诊断为很可能AD且存在轻度至中度认知障碍的患者收集的CSF。收集CSF和配对的唾液样本，通过qPCR检测hmuY基因分析P. gingivalis DNA。使用了阳性和阴性对照，类似于CSF中其他脑部感染检测的标准护理。我们能够检测并定量10名临床诊断AD患者中7例CSF中的hmuY基因拷贝数，P. gingivalis负荷范围为10至50拷贝/μl CSF，琼脂糖凝胶上qPCR产物的相对荧光强度与qPCR数据一致。对CSF终点PCR产物进行测序确认了hmuY基因的存在。随后，我们定量了所有10名患者配对唾液样本中的P. gingivalis负荷。所有10份配对唾液样本通过hmuY基因的qPCR检测均为P. gingivalis阳性。与上述脑样本类似，作为PCR阴性对照，我们分析了CSF样本中H. pylori的存在，使用了与P. gingivalis相同灵敏度的方法。所有CSF样本的H. pylori检测均为阴性。CSF数据为AD患者脑部P. gingivalis感染提供了额外证据。
Tau被牙龈蛋白酶片段化
由于我们观察到AD脑中牙龈蛋白酶与tau缠结的共定位，我们感兴趣tau是否是牙龈蛋白酶水解的靶点。tau的截断和片段化被认为在AD中诱导不溶性高磷酸化tau的形成中起关键作用。为确定牙龈蛋白酶在细胞系统中是否切割tau，我们使用表达高分子量tau形式的SH-SY5Y细胞。
使用Tau-5抗体作为探针，以三种不同浓度的P. gingivalis感染SH-SY5Y细胞，并在三个不同时间点检查。结果显示，与未感染细胞相比，感染后1小时内可溶性总tau呈剂量依赖性丧失，而用牙龈蛋白酶缺陷突变体感染P. gingivalis的细胞中可溶性tau水平与未感染细胞相似，表明牙龈蛋白酶负责Tau-5表位的丢失。
为表征tau内的牙龈蛋白酶切割位点，我们将重组tau-441与纯化的Kgp和RgpB催化结构域组合孵育，并通过质谱鉴定tau切割片段。暴露于1 nM纯化牙龈蛋白酶后，我们鉴定出覆盖tau-441氨基酸序列23%的片段；在10 nM牙龈蛋白酶下，生成的片段覆盖tau序列的85%。从已鉴定的tau片段中，我们推断出tau-441蛋白内的14个RgpB切割位点和30个Kgp切割位点。大多数Kgp切割位点（30个中的21个）位于tau蛋白的第222位氨基酸之后。对于RgpB，大多数切割位点（14个中的9个）位于第222位氨基酸之前。在Tau-5抗体表位（覆盖tau-441的第210至230位残基）内，我们鉴定出两个RgpB切割位点和两个Kgp切割位点。因此，Tau-5抗体表位内的牙龈蛋白酶切割很可能是SH-SY5Y细胞感染P. gingivalis后Tau-5抗体信号丢失以及tau蛋白检测缺失的原因。
我们鉴定出一个中结构域RgpB生成的tau肽片段TPSLPTPPTR（残基212-221），它是Tau-5表位的一部分。该tau肽是所有tau亚型共有的，已被用作测量CSF中tau水平的分析物，并确定人类中枢神经系统中tau的周转率。据报道，AD CSF中TPSLPTPPTR片段比非AD CSF增加1.7倍。
Kgp生成了四个独特的含有六肽序列VQIVYK的tau肽片段，以及两个含有VQIINK序列的独特tau肽片段。含有这些六肽基序的tau片段已被证明通过从全长tau成核配对螺旋丝参与tau缠结形成。
小分子牙龈蛋白酶抑制剂具有神经保护作用
为确定牙龈蛋白酶在体外是否对神经元具有毒性，我们将分化的SH-SY5Y细胞暴露于RgpB或Kgp 24小时。RgpB和Kgp的联合应用显著增加了细胞聚集。用碘乙酰胺（一种不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂）预处理牙龈蛋白酶可阻止牙龈蛋白酶诱导的聚集，表明牙龈蛋白酶的蛋白水解活性是形态变化的原因。
基于P. gingivalis牙龈蛋白酶的细胞毒性活性、其在AD脑中的存在及其了基于P. gingivalis牙龈蛋白酶的细胞毒性活性、其在AD脑中的存在以及其在细菌存活和毒力中的关键作用，我们开发了一系列有效且选择性的可逆和不可逆小分子牙龈蛋白酶抑制剂。COR286和COR271分别是精氨酸特异性（RgpA和RgpB）和赖氨酸特异性（Kgp）牙龈蛋白酶的不可逆抑制剂，两者的半数抑制浓度（IC50）均小于50 pM。COR119是一种可逆的共价Kgp抑制剂，IC50为10 nM。
为量化牙龈蛋白酶抑制剂的保护作用，我们以400的感染复数（MOI）用P. gingivalis W83菌株感染SH-SY5Y细胞48小时，导致约50%的细胞死亡。COR286和COR271均能以浓度依赖的方式有效阻断P. gingivalis诱导的细胞死亡。广谱抗生素莫西沙星和多西环素，即使在体外能降低细菌存活率的浓度下，也未能保护细胞。我们还测试了γ-分泌酶抑制剂semagacestat，它能阻断Aβ1-42的形成，以确定细菌毒性是否由P. gingivalis诱导的Aβ产生介导，但它没有保护作用。
我们接下来评估了牙龈蛋白酶在体内是否具有神经毒性，以及抑制剂是否能穿透大脑并阻止牙龈蛋白酶的神经毒性。给8周龄BALB/c小鼠单次给药牙龈蛋白酶抑制剂，通过口服灌胃给予COR271，皮下注射给予COR286，或两者都用溶剂对照。1.5小时后，将Kgp和RgpB的组合立体定向注射到海马中。7天后，分析大脑的神经退行性变。注射牙龈蛋白酶的小鼠退化神经元数量显著多于注射盐水的小鼠，但这种神经退行性变可以通过预先用COR286和COR271的组合治疗来阻断。
小鼠口服感染P. gingivalis导致脑部感染并诱导Aβ1-42
我们接下来想了解口服暴露于P. gingivalis是否会导致脑部浸润并诱导典型的AD标志物Aβ1-42。给44周龄的BALB/c小鼠每隔一天口服感染P. gingivalis W83、Kgp敲除株或RgpA/RgpB双敲除株，持续6周。其中一组W83感染组在第21至42天每天三次皮下注射Kgp抑制剂COR119。对小鼠大脑进行P. gingivalis的终点PCR分析显示，所有8只小鼠在口服感染6周后，细菌均侵入大脑，而牙龈蛋白酶敲除株或COR119治疗降低了定植。与模拟感染或COR119治疗的小鼠相比，口服P. gingivalis感染后小鼠大脑Aβ1-42显著增加。感染P. gingivalis的ΔRgp或ΔKgp株的小鼠，其大脑Aβ1-42水平与模拟感染组无差异，表明两种牙龈蛋白酶（直接或间接）都是诱导体内Aβ1-42反应所必需的。
Aβ1-42对P. gingivalis具有抗菌作用
小鼠大脑对P. gingivalis感染产生的显著Aβ1-42反应与Aβ1-42是一种抗菌肽的报道一致。因此，我们检测了Aβ1-42是否与P. gingivalis相互作用并在体外降低其活力。将Aβ1-42与P. gingivalis孵育后，Aβ1-42与细菌表面的RgpB共定位。由于已知Aβ1-42能破坏细胞膜，我们假设Aβ1-42可能破坏P. gingivalis膜的完整性导致细胞死亡。在另一项实验中，我们使用了一种能检测受损细菌膜并定量因膜损伤而死亡或濒死细菌数量的检测方法。我们发现，与Aβ1-40、乱序Aβ1-42和磷酸盐缓冲盐水相比，与Aβ1-42孵育后，死亡和濒死P. gingivalis的比例显著增加。
口服Kgp抑制剂可有效治疗P. gingivalis脑部感染并防止体内海马Gad67+中间神经元的丢失
我们接下来想测量牙龈蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠口服感染后脑部P. gingivalis负荷的影响。8周龄小鼠每隔一天口服P. gingivalis W83感染42天，并在研究完成前休息28天。治疗从脑部感染建立后开始，在第36至70天进行。在第35天，所有感染小鼠脑部均通过qPCR鉴定出P. gingivalis DNA，且P. gingivalis基因组拷贝数在第70天显著增加。Kgp抑制剂COR271具有口服生物利用度和显著的中枢神经系统穿透性，每日两次口服给药，与阳性对照感染组相比，能显著降低脑部细菌负荷，并与5周时的基线水平相比也有所降低。RgpB抑制剂COR286皮下给药，在10周时能有效降低脑部细菌负荷，但在将细菌负荷降至5周基线以下方面不如COR271有效。广谱抗生素莫西沙星也有助于防止第35天至第70天之间脑部定植的增加，但未能将P. gingivalis负荷降至5周基线以下。COR271与莫西沙星或COR286的组合并未比单独使用COR271提高疗效。
10周研究完成后的大脑组织学分析显示，与模拟感染相比，P. gingivalis感染组海马齿状回中Gad67+ GABA能中间神经元显著丢失。在AD中，脑神经影像学和尸检研究显示海马GABA能系统存在不同程度的破坏。从第36天开始，单独使用Kgp抑制剂COR271、单独使用RgpB抑制剂COR286、COR271和COR286联合、COR271加莫西沙星，以及单独使用莫西沙星治疗，均减少了Gad67+中间神经元的丢失，其中莫西沙星治疗组的保护作用似乎较弱。
COR388治疗对小鼠脑部P. gingivalis感染、Aβ1-42和肿瘤坏死因子-α水平显示剂量依赖性效应
基于上述体内小鼠研究中，高效特异性Kgp抑制剂COR271在清除P. gingivalis脑部感染和保护海马Gad67+神经元方面优于Rgp抑制剂和广谱抗生素的表现，我们开发了COR271的类似物COR388。与COR271相似，COR388是一种高效（Kgp上的皮摩尔抑制常数）且选择性的不可逆小分子Kgp抑制剂，具有优越的口服药代动力学和药物适宜特性，包括显著的中枢神经系统穿透性。
同时，我们还开发了基于Kgp活性的探针，以表征完整P. gingivalis细菌和生物组织样本中的COR388 Kgp靶点结合。我们通过将高效不可逆Kgp抑制剂与Cy5结合，开发了荧光活性探针COR553，并在体外验证了其对Kgp的特异性和效力。COR553结合了P. gingivalis细菌培养物中存在的Kgp，但不结合缺乏Kgp的菌株。用Kgp抗体CAB102预孵育细菌裂解物，可从裂解物中耗尽Kgp蛋白和COR553结合，而CAB102抗体结合的复合物则含有Kgp和COR553结合，这确认了COR553靶点的身份。在COR553结合前，用100 nM COR388预孵育P. gingivalis，导致COR388与Kgp活性位点结合，并阻断了COR553活性探针的结合。使用COR553探针，我们在从牙周病患者获得的离体人类口腔龈下菌斑样本中展示了COR388的Kgp靶点结合。COR553标记了5名受试者中4名菌斑中存在的Kgp。用COR388预孵育阻断了探针与活性位点的结合，而CAB102仍能检测到总Kgp蛋白。这些菌斑样本中高水平的Kgp反映了菌斑样本中检测到的P. gingivalis DNA。这4名受试者的唾液中也可检测到P. gingivalis。
使用确定的生长培养基，我们证明COR388抑制了P. gingivalis的生长，表明针对参与产生营养氨基酸以提供能量的Kgp毒力因子的抑制剂，起到了窄谱抗生素的作用。为测试对COR388产生耐药性的可能性，我们在COR388或广谱抗生素莫西沙星存在下传代P. gingivalis。如图所示，P. gingivalis对莫西沙星产生了完全耐药性，在12次传代中最低抑菌浓度增加了1000倍以上。在本研究中，两项独立试验均未发现对COR388产生耐药性。在用于上述COR271疗效测试的小鼠模型中，测试了COR388治疗已建立的P. gingivalis脑部感染的体内疗效。与COR271类似，每日两次口服COR388在对已建立的P. gingivalis脑部感染给药时显示出剂量依赖性疗效。与感染动物用溶剂治疗相比，10 mg/kg和30 mg/kg的剂量降低了脑组织中的P. gingivalis负荷、Aβ1-42和肿瘤坏死因子-α水平。最低剂量3 mg/kg的COR388显示出对脑部P. gingivalis负荷的某种降低，但未降低脑部Aβ1-42或TNFα水平。COR388已完成了新药临床试验申请支持性研究，该化合物目前正在进行临床研究。
讨论
本研究的发现提供了证据，表明大脑中的P. gingivalis和牙龈蛋白酶在AD的发病机制中起核心作用，为疾病治疗提供了新的概念框架。因此，我们证明了P. gingivalis DNA和牙龈蛋白酶抗原存在于AD大脑中，并在体内显示，口服小分子牙龈蛋白酶抑制剂可阻断牙龈蛋白酶诱导的神经退行性变，显著降低小鼠大脑中的P. gingivalis负荷，并显著降低宿主对P. gingivalis脑部感染的Aβ1-42反应。
我们在AD患者以及有AD病理但未诊断为痴呆的个体的大脑中鉴定出牙龈蛋白酶抗原，这一事实表明，P. gingivalis脑部感染并非痴呆发病后口腔护理不良的结果，也不是晚期疾病的后果，而是一个早期事件，可以解释认知能力下降之前中年个体中发现的病理。我们还证明，在临床AD患者的CSF中可检测到P. gingivalis细菌负荷，这进一步证明了P. gingivalis感染中枢神经系统。
本文报道的大脑和CSF中P. gingivalis的PCR分析不能区分P. gingivalis菌株，需要进一步研究以确定大脑和CSF中存在哪些P. gingivalis菌株，以及某些菌株是否比其他菌株更具致病性。此外，已知还有另一种能产生牙龈蛋白酶的卟啉单胞菌属物种——Porphyromonas gulae。P. gulae是狗等伴侣动物口腔的天然栖息者，最近一项研究表明，狗可以将P. gulae传播给其主人的口腔。正在进行研究以确定P. gulae是否可能对AD大脑中的牙龈蛋白酶负荷有贡献。
我们此报告的工作证据支持了Aβ是一种抗菌肽的新兴概念，而导致该功能丧失的突变可能允许更严重的P. gingivalis感染和更高的疾病风险。此外，由慢性P. gingivalis脑部感染驱动的持续高水平的抗菌性Aβ可能对宿主细胞有毒，因此，治疗P. gingivalis感染后降低Aβ水平应是有益的。此外，唐氏综合征（DS），最常见的精神残疾遗传原因，已被用来支持Aβ作为治疗靶点，因为DS患者中伴有阿尔茨海默型病理的痴呆患病率非常高（60岁后超过50%），并且产生Aβ的淀粉样前体蛋白基因位于21号染色体上，该染色体在DS中三倍体。然而，支持我们的假设的是，一种进展迅速、早在6岁即可发病的侵袭性牙周炎与DS相关，但与年龄匹配的正常对照或其他类似年龄分布的精神残疾患者无关。与年龄匹配的对照相比，DS患者大约从5岁开始，其龈下菌斑中P. gingivalis的发生率显著，表明P. gingivalis在DS患者儿童早期异常定植。DS患者为何在如此早期易感P. gingivalis感染的原因尚不清楚，但可能与其相关的免疫缺陷有关。需要研究来确定P. gingivalis和牙龈蛋白酶是否存在于DS的CSF和大脑中。
尽管本报告未具体讨论，但一旦口腔被感染，P. gingivalis可能通过多种途径进入大脑并扩散，包括：感染单核细胞随后被招募到大脑；直接感染并破坏保护血脑屏障的内皮细胞；和/或通过颅神经（例如，嗅神经或三叉神经）感染并扩散到大脑。进入大脑后，我们建议P. gingivalis可能沿着解剖学连接的通路缓慢地从一个神经元传播到另一个神经元，持续多年，类似于P. gingivalis在血管细胞间传播的情况。
Tau病理也被认为从一个神经元传播到另一个神经元，其模式类似于感染过程。我们的数据表明tau是牙龈蛋白酶水解的靶点，我们提出AD大脑中观察到的tau病理可能是由于P. gingivalis的跨神经元传播，牙龈蛋白酶直接损伤tau，以及牙龈蛋白酶激活作用于tau的人类蛋白酶。牙龈蛋白酶已被证明可直接切割procaspase-3以激活caspase-3，caspase-3与tau磷酸化和tau切割均有关。牙龈蛋白酶对tau的蛋白水解预计会增加tau的周转率，并触发代偿性增加tau产生率，以维持被P. gingivalis感染的神经元中的稳态。最近对tau在人类中枢神经系统中动力学的研究，使用tau中域TPSLPTPPTR片段作为报告分子，发现临床前和临床AD患者的CSF中tau的产生率增加。我们的数据表明Kgp和RgpB均与AD大脑中的tau负荷独立相关，这支持了牙龈蛋白酶可能是tau代偿性产生增加的驱动因素的假设。最后，需要进一步研究确定我们体外鉴定的含有六肽微管结合结构域的牙龈蛋白酶生成的C端tau片段是否能在体内驱动tau细丝形成。
在此，我们尚未探讨P. gingivalis感染如何与载脂蛋白E4（APOE4）——散发性AD的最大遗传风险因素——相关联。对缺乏APOE蛋白的小鼠的研究表明，它们对细菌病原体单核细胞增生李斯特菌的先天免疫反应受损，这表明APOE在体内正常的先天免疫功能中发挥作用。最近有报道称，人类APOE是牙龈蛋白酶水解的靶点，作者认为这种机制可能在AD大脑中产生神经毒性APOE片段。我们提出，由于存在更多精氨酸残基，APOE4可能比APOE3或APOE2更容易被牙龈蛋白酶切割，导致先天免疫功能下降和神经毒性片段的产生。APOE在P. gingivalis感染以及与牙龈蛋白酶靶向关系中的独特作用仍是未来研究的重点。
我们在中枢神经系统中鉴定出P. gingivalis，这强调了将先天免疫反应基因与AD易感性联系起来的遗传学发现的重要性，这些基因包括TREM2、TLR4、CR1和NLRP3。例如，最近的研究强调了髓系细胞2上表达的触发受体（TREM2）变异与AD之间的关联。TREM2编码一种在巨噬细胞和小胶质细胞等免疫细胞上表达的受体，杂合TREM2变异赋予与一个拷贝APOE4相似的AD风险。TREM2已被证明可调节炎症反应，并作为细菌的吞噬受体。与TREM2具有同源性的TREM1也与AD淀粉样蛋白病理和认知能力下降有关。与风险相关的TREM1等位基因被证明可降低单核细胞上TREM1的表面表达。P. gingivalis已被证明可诱导TREM1基因表达，因此，携带AD相关TREM1等位基因的个体可能对P. gingivalis感染的反应能力降低。此外，TREM1是牙龈蛋白酶水解和降解的靶点，数据显示Rgp可以从细胞表面切割可溶性TREM1，Kgp可以降解TREM1，这些作用可能诱导慢性炎症。需要进一步研究确定TREM2是否参与对P. gingivalis的先天免疫反应，以及P. gingivalis和牙龈蛋白酶对TREM2的表达和降解是否具有与TREM1相似的效果。总之，我们提出，在关键免疫通路中先天免疫系统基因的遗传多态性可能导致大脑中P. gingivalis和牙龈蛋白酶的清除缺陷，导致易感个体中慢性、低水平的感染和神经炎症。
关于感染诱导的神经炎症，炎症小体——作为细胞内先天免疫防御系统的多蛋白复合物——已被证明在AD大脑中被激活。P. gingivalis已被证明可调节炎症小体活性。最近的研究表明，AD中的Aβ斑块形成与先天免疫反应有关，通过小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活和ASC斑点（驱动Aβ组装和沉积）的释放。值得注意的是，P. gingivalis是第一个被证明通过激活NLRP3炎症小体，在P. gingivalis感染的原代人单核细胞中诱导ASC聚集斑点的微生物病原体。炎症小体通过激活白细胞介素-1β和IL-18，通过细胞焦亡导致细胞死亡，从而消除病原体复制的细胞内生态位，在对抗细胞内病原体的细胞内先天免疫防御中发挥作用。此外，最近的报告显示，P. gingivalis OMV——富含牙龈蛋白酶并释放到周围组织的纳米级蛋白脂质体——能迅速被哺乳动物细胞内化，在那里它们驱动NLRP3炎症小体激活和ASC斑点形成，并通过细胞焦亡导致细胞死亡。这项研究表明，人脑中的P. gingivalis，通过释放富含牙龈蛋白酶的OMV，可能驱动N这项研究表明，人脑中的P. gingivalis，通过释放富含牙龈蛋白酶的OMV，可能驱动NLRP3炎症小体激活、ASC斑点聚集以及随后的Aβ斑块形成。此外，最新证据表明，神经元中的NLRP1炎症小体能够通过作为病原体酶的底物来检测细菌毒力因子（如蛋白酶）。我们提出，神经元内的牙龈蛋白酶因此可能驱动神经元NLRP1激活，导致神经元焦亡和caspase-1激活，从而释放神经炎症因子IL-1β和IL-18。
最后，我们已证明广谱抗生素在体外不能保护细胞免受P. gingivalis诱导的细胞死亡，而牙龈蛋白酶抑制剂可以。我们还证明，在体内，口服Kgp抑制剂在清除脑部P. gingivalis方面比高剂量皮下注射广谱抗生素更有效。最近有研究表明，一种针对艰难梭菌（Clostridium difficile）半胱氨酸蛋白酶毒力因子TcdB的小分子抑制剂，在艰难梭菌诱导的结肠炎小鼠模型中减少了疾病病理，但并未降低艰难梭菌的细菌负荷。相比之下，我们在此报告，小分子抑制半胱氨酸蛋白酶Kgp不仅减少了小鼠脑部的疾病病理，还降低了P. gingivalis的细菌负荷。Kgp抑制剂降低脑部P. gingivalis细菌负荷的机制可能是由于减少了Kgp生成的肽类营养物质（这种不发酵糖类的细菌生长所必需），以及阻断了Kgp依赖的血红素获取（对P. gingivalis能量产生至关重要）。我们已经证明，P. gingivalis对广谱抗生素莫西沙星会产生快速耐药性，但对Kgp抑制剂COR388则不会。因此，随着对广泛抗生素耐药性的日益担忧，以及使用广谱抗生素导致的严重副作用（如艰难梭菌结肠炎），采用抗毒力因子抑制的方法治疗P. gingivalis感染是最有前景的途径，同时也能降低耐药性产生的压力。
总之，我们设计了一种口服生物可利用、可穿透脑部的Kgp抑制剂，目前正在针对AD进行人体临床研究。目前的数据表明，使用有效且选择性的Kgp抑制剂进行治疗，将减少脑部的P. gingivalis感染，并减缓或阻止AD患者进一步的神经退行性变和病理积累。
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