【摘要】背景与目的：早发性结直肠癌（EOCRC，诊断年龄<50岁）的发病率持续上升，现已成为年轻男性癌症相关死亡的首要原因。年轻成年人的筛查参与率仍然很低，但无创检测可能有所帮助。方法：早发性结直肠癌检测（ENCODER）是一项国际多中心队列研究，纳入来自4个国家（美国、意大利、西班牙和日本）的542名个体。通过小RNA测序从生物标志物发现队列（n=118）中鉴定出6种细胞游离和外泌体循环生物标志物组合。随后，基于训练队列（n=192）的逆转录定量聚合酶链反应结果训练机器学习模型（极端梯度提升），并在外部独立队列（n=191）中进行测试。最后，我们研究了手术前后生物标志物水平的动态变化（n=41）。结果：我们的液体活检在2个独立队列中检测EOCRC具有高准确性（训练队列受试者工作特征曲线下面积97.5%，测试队列95.6%）。在独立测试队列中，即使年龄在20-35岁范围内，也能很好地区分EOCRC患者与非疾病对照（受试者工作特征曲线下面积98.5%）。该液体活检的特异性为87.5%（95% CI，79.4%-92.7%），总体灵敏度为91.6%（95% CI，84.2%-95.7%）；对筛查相关的I-III期EOCRC的灵敏度为97.3%（95% CI，90.6%-99.3%），对高级别上皮内瘤变的灵敏度为61.5%（95% CI，35.5%-82.3%）。最后，我们观察到手术后液体活检值下降，术后4天达到阴性。结论：ENCODER是迄今为止针对EOCRC风险增长人群，开发、训练并外部验证液体活检的最大规模研究，提供了一种补充筛查策略。临床试验注册号：NCT06342401。
【你需要知道的内容】背景与背景：年轻成年人结直肠癌发病率在全球范围内上升，但传统内镜筛查依从性低。无创血液检测可能有所帮助。新发现：本研究开发并独立测试了一种血液检测，对筛查相关的I-III期结直肠癌灵敏度为97.3%，对高级别上皮内瘤变无创检测灵敏度为61.5%。局限性：研究需探索该检测在医疗系统中的实施以及人群依从性。需要与该检测与其他无创筛查技术的头对头试验，以评估哪种最具成本效益。临床研究相关性：本研究有望改善年轻成年人结直肠癌的早期检测。凭借对早发性结直肠癌的高灵敏度和特异性，该血液检测可能成为提高该人群筛查参与度的有价值工具。此外，检测癌前病变的能力提示了预防性干预的潜力，可能降低发病率和死亡率。基础研究相关性：本研究结果表明，新一代基于血液的检测可能是可行的，该检测基于细胞游离和外泌体结合的microRNA作为早发性结直肠癌及其他癌症的血液生物标志物。
【引言】早发性结直肠癌（EOCRC）定义为50岁前诊断的结直肠癌，占所有新诊断结直肠癌病例的15%-20%[1,2]。过去罕见，现已成为年轻男性癌症相关死亡的首要原因，女性中为第二位[3-5]，且全球发病率持续上升[6-8]。大多数EOCRC病例在进展到晚期才被诊断[5,9]，而早期诊断（理想情况下在无症状阶段）将使疾病更易治愈[10,11]。为此，多个学会降低了推荐开始结直肠癌筛查的年龄[12]。然而，筛查的持续障碍使得新筛查年龄的依从率低于20%[5]。筛查偏好倾向于微创选择，年轻成年人尤其不愿接受传统结肠镜筛查[13,14]。无创的基于生物标志物的方法提供了补充传统结肠镜筛查的几个优势[15]。基于血液的基因组生物标志物可以提高筛查参与度，并识别更可能发现异常结果的个体，从而使结肠镜资源集中于高风险患者[16-19]。目前仅有1种RNA分子检测获批用于平均风险个体的结直肠癌筛查，该检测分析粪便中的8种RNA转录本[19]。值得注意的是，我们课题组最近报告了一种用于EOCRC检测的血液检测性能，该检测评估了血浆中4种细胞游离microRNA（cf-miRNA）转录本[20]。癌细胞还会释放外泌体进入血液，其分子货物（包括RNA）来源于癌症且免受降解[21]。因此，一种同时分析cf-miRNA和外泌体包裹的miRNA（exo-miRNA）的单一血液检测，有望提高现有基于RNA的血液检测用于癌症筛查的性能[22,23]。为满足这些临床需求并改善日益增长的EOCRC风险人群的预后，我们开发、训练并独立验证了一种新型转录组血液检测。我们首先通过系统性RNA测序发现阶段，鉴定出一组cf/exo-miRNA生物标志物。随后，我们使用极端梯度提升（XGBoost，一种基于树的机器学习方法）开发、训练并独立测试了一种转录组血液检测。该基于血液的检测（早发性结直肠癌检测，ENCODER）能够以高特异性和灵敏度区分EOCRC患者与年龄和性别匹配的对照，包括I期、II期和高级别上皮内瘤变（HGD）。值得注意的是，ENCODER检测值在术后下降。
【材料与方法】研究设计：ENCODER研究是一项国际性、多机构、回顾性和前瞻性、多阶段生物标志物研究，涵盖早期检测研究网络（EDRN）I、II和III期，符合STARD[24]标准（见补充材料），包括组织和血液样本[25]。该研究获得各参与机构伦理委员会批准，并按照赫尔辛基宣言[26]进行；已在ClinicalTrials.gov注册（编号NCT06342401）。所有参与者均签署书面知情同意书。
研究人群：本研究共纳入并评估634名个体的资格。92名个体因不符合纳入标准、数据不完整或血液量不足被排除。因此，本研究共纳入542名独特患者，提供了621份生物样本（503份血浆样本和118份组织样本）（补充图1）。数据来自公开数据集（n=80）和4个独立临床队列（n=462）（补充表1）。本研究发现阶段旨在鉴定肿瘤来源的cf/exo-miRNA生物标志物。我们使用了2个独立的小RNA测序队列，一个公开可用（GSE115513），另一个来自我们自身。为将测序结果转化为廉价且更实用的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测，我们优先选择了6个cf/exo-miRNA组合，并在RT-qPCR结果（临床队列1或训练，n=192）上训练并锁定了一个基于XGBoost的机器学习模型。该模型随后在第二个外部独立前瞻性队列（临床队列2或测试，n=191）中进行测试。最后，我们评估了检测值在另一组匹配术前和术后血液样本的队列（临床队列3，n=41）中是否下降。
样本：本研究纳入年龄18-49岁的参与者，在采血前签署书面知情同意书。病例在50岁前经组织学诊断为结直肠癌（TNM恶性肿瘤分类，第8版[27]）。局限于上皮、固有层或黏膜肌层的异型增生病变统一定义为“高级别上皮内瘤变”，遵循美国多学会工作组术语建议[28]。非疾病对照（NDC）年龄<50岁，采血时无结直肠癌，至少1年阴性随访，通常按年龄（±2岁）和性别与病例匹配。主要排除标准包括癌症病史、炎症性肠病、遗传性结直肠癌易感性（通过基因检测发现）以及缺乏内镜评估。所有标本均在诊断时、任何治疗前采集。为评估治疗后检测水平，术后样本在住院期间采集。更多细节见补充方法和方案。
实验室方法（生物标志物发现，EDRN I期）：所有生物标志物发现过程均独立进行细胞游离和外泌体标志物。我们使用miRNeasy和exoRNeasy Midi试剂盒分别从200 μL血浆中分离总细胞游离RNA和外泌体RNA。组织RNA使用AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal试剂盒从约30 μg新鲜冰冻组织（肿瘤和邻近正常黏膜）中提取。使用Small RNA-Seq Kit V3构建下一代测序文库，并在NovaSeq平台上进行双端测序。候选cf/exo-miRNA通过多步选择过程筛选，包括：基于血液中EOCRC与NDC差异表达的统计优先排序（|log2(倍数变化)|>1；Benjamini-Hochberg校正P值<0.05；log2(CPM)>2.0）[25,29]，基于生物标志物AUROC值的区分能力[30]，基于与患者匹配组织表达模式一致性的内部验证[31-33]，基于与独立公开数据集（GSE115513）比较的外部验证[25,34]，以及最后基于LASSO（最小绝对收缩和选择算子）回归的机器学习优先排序[29,35,36]。更多细节见补充方法。
实验室方法（诊断检测，EDRN II/III期）：cf/exo-miRNA转录本通过RT-qPCR在患者血浆样本中测量。对于所有3个队列，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒从200 μL血浆中分离总细胞游离RNA。总外泌体RNA通过标准化的2步过程分离：从200 μL血浆中离心、沉淀和重悬外泌体，然后裂解外泌体并提取RNA（总外泌体沉淀试剂，Invitrogen，随后使用miRNeasy血清/血浆试剂盒）[22,23,37-39]。合成cDNA（miRCURY LNA RT试剂盒，Qiagen），并使用高质量探针（Qiagen）和高度灵敏的SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 7 Flex实时PCR系统上测量目标cf/exo-RNA表达。目标转录本的相对丰度通过2-ΔCt方法确定，该方法将目标转录本的循环阈值（Ct）值标准化为3个参考基因（hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-23a-3p和hsa-miR-30e-5p）的平均Ct值[40-47]。ΔCt表示目标转录本的Ct值与3个标准化因子平均值的差值。
在我们之前的发表中，基于4种cf-miRNA和逻辑回归的血液检测实现了82%的灵敏度、86%的特异性和88%的AUROC[20]。这一次，考虑到决定利用cf/exo-miRNA组合和更先进的机器学习方法，样本量（训练和测试分别为192和191）足以达到AUROC值≥90%或更高（α=5%；精度95.0%），灵敏度和特异性分别超过90%和85%（细节见补充方法和方案）。
统计分析：所有分析均使用R软件计算。诊断检测（即ENCODER）采用XGBoost，这是一种流行且强大的机器学习模型，使用序列迭代提升策略将弱学习器（决策树）转化为更稳健的模型。XGBoost特别适用于复杂和高维数据，因为其计算速度快、优化选项丰富，并内置处理缺失数据的方法。ENCODER值是我们的机器学习算法生成的结果，范围从0到1，基于血浆中分析的生物标志物表达水平。关于机器学习方法和超参数微调的更多细节见补充方法。训练后，模型被锁定以防止修改。性能通过AUROC、灵敏度和特异性值评估，阳性阈值定义为ROC曲线与完美区分点之间距离最小化。比例的95% CI使用Wilson方法计算，ROC曲线的95% CI使用2000个分层bootstrap复制估计。我们通过将风险评分建模为受限三次样条（节点位于阳性阈值（近似为第50百分位数）以及样本分布的第25和第75百分位数）来估计XGBoost衍生风险评分与EOCRC风险之间的值-风险关系。所有分析定义P<0.05为统计显著性，并通过配对Wilcoxon方法进行成对比较，双样本t检验（配对或非配对，视情况），以及多组方差分析。
【结果】队列：研究参与者的特征总结于补充表1。在任何队列中，病例与NDC之间的性别和年龄分布无显著差异。总体而言，本研究包括621份患者来源标本。80份来自公开基因表达数据集，38份为新鲜冰冻组织标本，503份为血液来源（251份治疗前EOCRC，211份NDC，41份治疗后EOCRC）。
候选生物标志物的鉴定：在生物标志物发现阶段，细胞游离和外泌体生物标志物在各自的基质中独立分析。发现阶段首先鉴定出442种cf-miRNA和206种exo-miRNA作为候选生物标志物（图1A和C）。我们针对患者匹配的组织样本进行了内部验证（图1B），随后在独立公开数据集（GSE115513）中进行外部验证，以去除生物标志物特征（log2倍数变化和P值）与血液中观察到的不同的miRNA（（接上文）...（分别分析cf-miRNA和exo-miRNA；补充表3和4），因此，235种cf-miRNA和126种exo-miRNA保留。我们进一步排除了低血液平均表达（log2 CPM < 2.0，76种cf-miRNA和38种exo-miRNA）、校正P值>0.05（26种cf-miRNA和52种exo-miRNA）以及log2倍数变化<1.0（53种cf-miRNA和19种exo-miRNA）的候选者（补充表5-8）。剩余的80种cf-miRNA和17种exo-miRNA经过LASSO回归，以确定表现最佳的12种cf-miRNA和11种exo-miRNA（补充图2A和B）。这些候选生物标志物的无监督聚类显示它们能够分离EOCRC和NDC（图1D和E）。最后，我们排除了血浆或组织中表达低的候选者，排除6种cf-miRNA和1种exo-miRNA（补充图3A和B以及3C和D）。总之，发现阶段采用系统性、全基因组、无偏倚的测序工作，鉴定出与EOCRC独立相关的6种cf-miRNA和10种exo-miRNA组合（补充图4）。
训练和独立测试细胞游离外泌体microRNA血液检测
在第一个临床队列（训练队列）中通过RT-qPCR评估这些发现的cf/exo-miRNA，结果显示2种细胞游离转录本（hsa-miR-625-3p和hsa-miR-30d-5p）和4种外泌体转录本（hsa-miR-32-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-550a-3-5p和hsa-miR-625-3p）与EOCRC显著相关（补充图5A和B）。这6种cf/exo-miRNA构成了我们的正式和最终生物标志物组合（补充表2）。值得注意的是，生物标志物性能在50岁以下的白人和亚洲个体中一致（补充图6）。为探索其生物学相关性，我们使用DAVID工具对预测的miRNA靶基因进行功能注释，分析表明涉及多种细胞内和细胞外通路，包括肿瘤转化（补充图7），这与先前关于这些miRNA参与50岁前癌症发生发展作用的报道一致（补充表3）。鉴于EOCRC和晚发性CRC是生物学上不同的疾病实体，我们在4个独立临床队列（2个内部[n=581]和2个公开数据集[n=140]；总n=721）中评估了这些生物标志物对50岁以上个体的区分能力，发现这些生物标志物高度特异于EOCRC（补充图8）。
因此，利用这些标志物对EOCRC的特异性以及标准化基因的稳定性（补充图9），我们随后基于这些候选cf/exo-miRNA的RT-qPCR结果训练了一个XGBoost机器学习模型。由此产生的分类器ENCODER，其准确性主要来自exo-miR-32-5p和cf-miR-625-3p，其他分析物则用于微调（补充图10）。完成训练过程后，模型被完全锁定，并在第二个具有相似临床特征的外部独立队列中进行测试（补充表1）。以下，训练队列（n=192）和独立测试队列（n=191）的结果并列展示。
我们首先评估了cf-miRNA和exo-miRNA各自的诊断潜力。两个组合均产生稳健结果（外泌体AUROC分别为94.6%和92.3%；细胞游离AUROC分别为87.3%和82.6%）（图2A和B）。有趣的是，将2-cf-miRNA组合与4-exo-miRNA组合结合，在两组队列中都更清晰地区分了EOCRC和NDC。具体而言，在两组队列中，EOCRC患者聚集在散点密度图的右上部分，而NDC位于左下角（图2C和D）。最终血液检测（ENCODER）使用XGBoost、2-cf-miRNA和4-exo-miRNA，在训练队列中AUROC达到97.5%，在独立外部测试队列中达到95.6%（图2E和F），从而提高了单独细胞游离和外泌体检测的性能。我们还开发了LASSO和岭惩罚逻辑回归模型，以评估更简单的模型是否能达到类似性能。然而，两者均表现出比ENCODER模型更差的准确性和可重复性（补充图11）。
两组队列均显示，EOCRC个体的ENCODER风险评分高于NDC（图3A和B）。此外，血液中ENCODER风险评分相对于阳性阈值的分布在两组队列中相似（图3C和D）。有趣的是，该模型在两组队列中均建立了与EOCRC比值比的统计学显著关联（P<0.001）（图3E和F）。ENCODER风险评分越高的个体，EOCRC的比值比也相应越高。这种关系在第一个临床队列中是线性的，而第二个队列显示评分>0.6时出现拐点。第二个临床队列中EOCRC比值比达到平台期是预期的。尽管cf/exo-miRNA血液检测有效区分了大多数EOCRC患者与对照，但有2名NDC个体表现出高cf/exo-miRNA值（假阳性结果）。这导致高比值比（>10），显著大于1，但由于天花板效应而达到平台期。因此，尽管高度显著，cf/exo-miRNA水平与EOCRC比值比之间的关联表现出非线性关系。
在建立了训练队列和独立测试队列之间结果的可重复性后，所有以下分析均来自测试队列，以真正确定模型的性能。
独立外部测试队列的分期特异性表现
由于早期检测对于降低EOCRC死亡率至关重要，我们评估了血液检测在不同分期的表现。有趣的是，我们观察到所有分期的EOCRC患者的血液检测值均显著高于NDC（图4A）。这表明该检测具有检测早期病变和癌前病变的潜力。此外，该血液检测在EOCRC所有分期均达到高AUROC值，从高级别上皮内瘤变（AUROC 93.1%）、I期（96.5%）、II期（97.4%）、III期（95.1%）到IV期（93.3%）（图4B-E）。在独立外部测试队列中，该血液检测的灵敏度为91.6%（95% CI，84.25%-95.67%），特异性为87.5%（95% CI，79.4%-92.7%）。重要的是，它对所有筛查相关的EOCRC分期（I-III期）表现出高灵敏度（97.3%；95% CI，90.6%-99.3%）。更具体地说，I期EOCRC灵敏度为94.1%（95% CI，73.02%-98.95%），II期灵敏度为100.0%（95% CI，100%-100%），III期灵敏度为96.8%（95% CI，83.81%-99.43%）。此外，对高级别上皮内瘤变的灵敏度为61.5%（95% CI，35.52%-82.29%），表明该检测具有检测适合内镜切除的浸润前病变的潜力（表1）。
分析测试队列中不同年龄组的表现，我们观察到在所有年龄，EOCRC患者的血液检测值始终高于NDC（图5A）。我们进一步评估了特定年龄组的转录组检测特征。在相同年龄范围内，EOCRC患者的血液检测值显著高于NDC，包括35岁及以下（图5B和C）、36-40岁（图5D和E）、41-45岁（图5F和G）以及46-49岁（图5H和I）。最后，我们调查了使用年龄特异性截断值是否能提高检测性能。尽管年龄特异性截断值在41-45岁年龄组中略微提高了灵敏度，在35岁及以下年龄组中提高了特异性（补充表10），但并未显著影响模型的整体准确性。
血液检测水平在根治性手术后下降
为评估该血液检测值在术后是否变化，我们比较了诊断时和术后2-7天收集的患者匹配样本。术后采集的血浆样本检测值显著低于诊断时（P<0.001）（图6A）。有趣的是，术后4天或更久采集的样本显示出更大幅度的ENCODER评分下降，表明随着时间间隔延长，术前和术后水平之间的区别更明显（图6B）。这一趋势反映在密度图中，诊断时和术后前3天采集的样本倾向于聚集在右上角（图6C和D），而术后较晚采集的样本则更靠近左下角（图6E）。最后，分析术后不同天的水平时间趋势，我们观察到仅在术后4天后采集的血液样本检测值降至阴性。
讨论
这项转化研究基于我们之前的报告，验证了一种用于检测EOCRC的cf/exo-miRNA血液检测，以应对年轻成年人中日益增长的CRC风险[2,5]。该血液检测借助机器学习，在一个大型国际多中心研究中独立开发和测试。在外部独立的前瞻性血浆标本队列中重复测试时，结果几乎无性能损失。此外，在诊断时和术后评估血液检测支持了核心生物标志物对EOCRC特异性的假设。对于日益增长的CRC风险人群，该血液检测提供了补充现有筛查策略并可能扩大筛查可及性的机会。
尽管EOCRC发病率持续上升[4,5]，但针对该患者人群的无创筛查检测数据匮乏[17-19]。截至本文撰写时，唯一获得美国食品药品监督管理局批准的基于细胞游离DNA的血液检测（Shield，Guardant）在45-59岁年龄组中报告了76.5%（95% CI，52.7%-90.4%）的全期CRC灵敏度[18]。该检测在同一年龄组中对癌前病变（包括HGD和Tis，与本研究定义一致）的灵敏度仅为7.9%（95% CI，5.8%-10.8%）[18]。此外，这些灵敏度值低于在老年人中观察到的值（60-69岁年龄组为88.2%）。基于DNA甲基化的检测在年轻个体中灵敏度下降的事实已有报道[19,48]，这归因于甲基化模式随年龄变化[49]。相比之下，基于RNA的检测，包括最近的多靶点粪便RNA检测，似乎对年龄相关变异不太敏感[19]。我们的血液检测显示出类似优势，其性能指标稳定，无需年龄调整阈值。此外，多项研究报告EOCRC常比晚发性CRC在更晚期就诊，这似乎是由于疾病本身的侵袭性，而非诊断延迟[9,50]。这凸显了早期检测（最好在癌症侵袭前）的迫切需求[3,6,51]。其他无创检测尚未全面报告EOCRC的分期特异性指标，但该血液检测显示出前景。该检测对I-III期EOCRC的灵敏度为97.3%，甚至对HGD的灵敏度为61.5%。这些发现表明，该血液检测可能补充现有对抗EOCRC的策略。
ENCODER组合中的6种miRNA先前均被证实参与结直肠癌的发生，作为肿瘤抑制因子（hsa-miR-30d-5p和hsa-miR-550a-3-5p）或致癌基因（hsa-miR-32-5p、hsa-miR-486-3p和hsa-miR-625-3p），在EOCRC特异性生物学、缺氧驱动的转移、凋亡和侵袭中发挥作用（补充表9）[52-56]。使用DAVID对其预测靶点的功能注释进一步证实了致癌通路（包括肿瘤转化）的富集（补充图7），强化了这些生物标志物的生物学相关性。
我们想承认我们研究的潜在局限性。尽管它是迄今为止针对该风险人群开发和测试EOCRC检测的最大队列，但样本量有限。这导致某些估计值（特别是与特定分期相关的估计值）的置信区间较宽。此外，观察到的术后时间模式可能提示潜在的微小残留病灶检测或疾病监测能力。然而，由于每位患者只有一个术后数据点，我们无法得出超出癌症特异性的确定结论。我们的研究设计基于两个关键观察。首先，已有研究强调EOCRC与晚发性CRC在分子和病理上存在内在差异[51,57-59]。其次，研究表明年龄会影响某些筛查检测（尤其是基于DNA的检测）的性能[18,19]。这些观察促使我们专门针对日益增长的EOCRC风险人群设计并开展了一项研究，以开发检测方法。因此，这些结果可能需要对老年人群进行进一步评估以推广。EOCRC的另一个关注领域是非裔美国人中的高死亡率，但我们的队列性质使我们无法评估这一特定种族群体。此外，细胞外囊泡分离方法虽然广泛使用且适合临床推广，但并非仅产生外泌体[22,23,37-39]。然而，作为一种“基于外泌体”的检测，该方法成功富集了对于EOCRC检测至关重要的生物学相关外泌体内容物，并在RNA产量和未来临床实施的可扩展性方面提供了实际优势，优先考虑有效的诊断性能而非绝对纯度。最后，尽管我们的分析表明这些生物标志物对EOCRC高度特异（补充图8），但评估这些生物标志物在老年人群中的性能的工作正在进行中，并将在未来研究中处理；然而，当前工作特意聚焦于EOCRC特异性生物标志物发现。
我们的研究具有显著优势。我们收集了迄今为止最大的EOCRC病例和对照队列，为研究结果提供了坚实基础。研究设计采用综合方法，不仅涵盖CRC，还纳入了HGD个体，展示了该血液检测通过检测（然后切除）癌前病变来预防EOCRC的潜力。此外，该研究使用了可解释的机器学习模型，使我们能够理解检测预测背后的原理，并确定影响其决策的关键因素。最后，该检测所需血浆量极少，使其高度可转化于临床环境。这一特性有望补充其他筛查选项并扩大筛查可及性，可能使个体在常规体检中接受筛查。
总之，本研究建立在我们之前工作的基础上，开发了一种更准确、更灵敏、更特异的血液检测，用于日益增长的EOCRC风险人群。通过利用生物学数据和机器学习，我们在一项大型、多中心、国际EDRN I/II/III期研究中开发和独立测试了该检测。在继续努力提高年轻个体对内镜筛查依从性的同时，该血液检测提供了一种补充策略。对于对侵入性操作犹豫不决的个体，它可能是一种更具吸引力的选择，有可能促进并鼓励年轻成年人参与结直肠癌筛查，否则他们可能会避免。
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