摘要
心房颤动(AF)是一种常见的心律失常，与中风、心力衰竭和死亡风险增加相关。近期研究表明，早期发病的AF会增加发展为心力衰竭和扩张型心肌病的风险。本研究旨在识别早期发病AF个体中一组34个心肌病基因中的遗传变异。我们对478名早期AF发病的丹麦队列个体进行了心肌病相关基因的靶向测序。此外，我们还分析了来自英国生物银行的375,869名个体的全外显子组测序数据，其中包括29,267名AF患者。在早期发病AF的丹麦个体中，8.8%携带心肌病相关基因的致病性或可能致病性(P/LP)变异。在英国生物银行分析中，罕见P/LP变异的流行率从早期AF发病组的3.85%到无AF诊断组的1.03%不等。在排除先前无心肌病或心力衰竭诊断的个体后，结果基本一致。这表明在部分早期AF诊断的个体中，心肌病的基因检测可能是相关的。
引言
心房颤动(AF)的终身风险高达30%，是最常见的心律失常，给患者和医疗系统带来严重负担。在AF患者中，五分之一会遭受中风，五分之二会发展为心力衰竭(HF)，导致发病率和死亡率增加。
尽管AF已被广泛研究，但它与不同年龄组后续心血管疾病和死亡率的关联尚未完全明确。最近一项研究发现，心肌病和HF的风险在早期诊断出AF的个体中最高。此外，AF的早期发病与预期寿命显著降低相关，与疾病后期发病相比更为严重。这可能是由于AF和心肌病共享遗传结构所致。心房心肌病已被认为是AF发病机制的重要组成部分，也是更严重、心室心肌病表型的潜在前兆。
支持AF与心肌病之间存在遗传联系的证据，多项研究发现大型生物样本库中AF个体的心肌病相关罕见变异流行率更高，以及临床试验人群中也是如此。最新研究表明，罕见心肌病相关变异的最高负担可能出现在AF早期发病的个体中。在一项包含1293名65岁前发生AF的队列研究中，Yoneda等人报告了与心律失常综合征、心脏结构和心肌病相关基因中潜在致病性遗传变异的流行率增加。携带此类变异的个体与非携带者相比，死亡率也更高。在此基础上，多个生物样本库人群中已确定早期发病AF个体中罕见心肌病变异的流行率更高。美国心脏病学会和美国心脏协会最新的AF指南反映了这些发现，现在建议对无明显危险因素的早期发病AF患者考虑进行基因检测。这可能有助于早期识别致病变异携带者并改变患者管理，如最近一项临床研究所示，该研究显示在早期发病AF患者中，心肌病和心律失常基因的致病变异阳性率为20%。
本研究纳入了来自丹麦队列的45岁前诊断且无已知心肌病和心力衰竭的AF患者的下一代测序数据，以及来自英国生物银行的375,869名个体的全外显子组测序数据。通过在两个不同队列中检测心肌病基因中的致病性变异，本研究旨在补充近期关于大型队列中罕见遗传变异作用的研究，并提供新的见解，了解这种情况在精心筛选的早期疾病发病个体队列中的比较，代表了最有可能成为基因筛查候选人的患者群体。
方法
本研究遵循《加强流行病学观察性研究报告规范》(STROBE)报告指南。
丹麦早期发病心房颤动队列
通过丹麦国家患者登记处识别并招募了欧洲血统、45岁前诊断为AF的个体。纳入前进行了详细的图表审查，排除了先前诊断为心肌病或心力衰竭的参与者。对于有可用超声心动图的参与者，仅纳入左心室射血分数>50%的个体。从外周血样本的白细胞中提取DNA。在使用内切酶进行DNA片段化后，使用Illumina TruSight Cardio测序试剂盒(Illumina Sequencing, USA)的基因特异性探针创建杂交分子，并使用磁珠捕获。经过PCR扩增后，使用Illumina HiSeq 2500和NextSeq技术进行测序。测序读数经过修剪并过滤掉低质量读数，使用Burrows-Wheeler Aligner软件与人类参考基因组(构建GRCh37/hg19)对齐，并根据Genome Analysis Toolkit最佳实践指南进行后处理。测序、质量控制和生物信息学后处理流程先前已由Ahlberg等人详细描述。该队列先前已用于研究TTN中截短变异的含义和RBM20在早期发病AF中的影响。
英国生物银行队列
英国生物银行(
表型由《国际疾病分类，第10版》(ICD-10)定义，已在补充表S1中描述。英国生物银行中AF的诊断基于医院和初级保健就诊的医疗记录。没有注册AF诊断的参与者被视为对照组。
我们从英国生物银行全外显子组测序数据集中提取遗传变异，该数据集包含404,010名欧洲血统参与者。外显子组测序方法，包括质量控制、对齐、变异调用和注释，先前已有详细描述。在此分析中，我们仅考虑基因座覆盖率达到至少90%且读深度大于十的变异位点。根据英国生物银行资源531，基于杂合性、缺失率、过度相关性和亲缘关系推断对样本进行过滤。此外，排除了自我报告性别与遗传确定性别不一致的样本。最终，374,289名个体符合纳入分析的标准。
研究队列和后续分析的参与者选择详细流程图见补充图S1。
候选基因选择
基于已发表的、基于证据的心肌病相关基因评估，我们重点关注34个心肌病基因中的遗传变异，这些基因对扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)和致心律失常性右室心肌病(ARVC)具有强或中等证据支持。
对于DCM，我们纳入了19个相关基因：ACTC1、ACTN2、BAG3、DES、DSP、FLNC、JPH2、LMNA、MYH7、NEXN、PLN、RBM20、SCN5A、TNNC1、TNNT2、TNNI3、TPM1、TTN和VCL。为了最小化TTN亚型带来的噪声(这些亚型在心脏组织中非主要表达)，我们重点关注组成型表达的外显子，即剪接率超过90%的外显子(TTN-PSI90)。
对于HCM和ARCV，我们分别检查了19个和8个基因，其中一些与DCM重叠。这包括HCM的ACTC1、ACTN2、ALPK3、CACNA1C、CSRP3、FHOD3、FLNC、JPH2、KLHL24、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、PRKAG2、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1和TRIM63。对于ARVC，我们检查了DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、PKP2、PLN和TMEM43的变异。
这些基因与上述三种心肌病亚型的关联，包括具有强和中等显著性的关联，在补充图S2中有详细说明。有关每个基因及其在心肌细胞中相关细胞位置的更深入描述，请参见图1。
变异整理
我们优先考虑被预测为致病性或可能致病性(P/LP变异)的罕见错义和预测功能丧失(pLOF)变异。在英国生物银行中，我们纳入了在队列中次要等位基因频率(MAF)<1%的变异，在ClinVar数据库中被分类为致病性或可能致病性的变异。此外，我们纳入了所有在心肌病中作为疾病机制的单倍体不足具有证据的基因中的pLOF。这些基因基于ClinGen数据库中具有"充分"或"新兴"单倍体不足证据而被选择，包括BAG3、DSP、FLNC、LMNA、MYBPC3、PKP2、DSG2和TTN中的变异。
我们将pLOF变异定义为导致终止密码子获得或丢失、移码或规范剪接位点的变异。使用dbSNP(版本4.1a)和SnpEff(版本5.0)进行变异注释。使用SpliceAI对剪接位点变异进行注释，仅纳入SpliceAI评分>0.8的高置信度变异。SpliceAI算法在注释剪接变异方面与其他算法相比表现良好。
对于丹麦早期发病AF队列，我们根据2015年ACMG/AMG标准对所有变异进行整理，基于对变异类型、人群流行率、单倍体不足证据、ClinVar和体外预测工具证据以及其他因素的详细评估，评估潜在变异致病性。
统计分析
通过计算至少有一个遗传变异的个体百分比，测量每组中遗传变异的流行率。在英国生物银行中，我们将AF参与者按AF发病年龄分为四个亚组：45岁以下、45-54岁、55-64岁和65岁或以上。在整个英国生物银行队列中以及在AF首次诊断前或30天内无心力衰竭(HF)或心肌病诊断的子集中，评估了罕见P/LP变异的流行率。
使用多变量逻辑回归估计根据AF发病年龄携带罕见P/LP变异的比值比(OR)，对性别、纳入年龄和六个第一基因型主成分进行调整。统计显著性定义为双尾p值<0.05。所有统计分析均在R版本4.1.0中进行。我们根据不同类型的心肌病绘制了流行率。在基因与多种心肌病类型相关的情况下，我们在弦图中通过在相关心肌病类别之间划分和分配来表示流行率(Circlize软件包版本0.4.16，R版本4.1.0)。
结果
本研究包括478名丹麦个体和375,869名英国生物银行参与者。队列的基线特征总结在表1中。在丹麦队列中，所有个体在纳入时都有AF诊断，中位(第1-第3四分位数)AF诊断年龄为28(23-34)岁。其中，85名参与者(17.8%)为女性。相比之下，英国生物银行包括29,267名诊断为AF的个体和346,602名无AF诊断的参与者，作为对照。英国生物银行中纳入和AF诊断的中位(第1-第3四分位数)年龄分别为58(51-63)岁和67.9(61.2-72.9)岁，201,965名参与者(53.7%)为女性。
丹麦队列中P/LP变异的高流行率
在478名45岁前诊断为AF且无已知心血管合并症的丹麦个体中，42名个体(8.8%)是34个已确立心肌病基因中13个基因的罕见P/LP变异携带者(图2A和表2)。
TTN基因是最常受影响的，44名变异携带者中有17名(38.6%)携带被分类为致病性或可能致病性的变异(见表2)。LMNA是第二常受影响的基因，检测到五个P/LP变异(携带者中的11.3%)，包括一个移码变异，如表2所示。还观察到RBM20、DSC2、PKP2、MYBPC3、MYH7、NEXN、TNNT2、CSRP3和SCN5A中的额外罕见P/LP变异。总体而言，大多数携带者携带与DCM或HCM相关的基因变异，而三名携带者携带与ARVC相关的基因变异。
将队列限制为仅具有可用超声心动图的个体(n=394[全队列的82.4%]，所有LVEF>50%)，显示了类似的罕见P/LP变异携带者比例(n=33名携带者[8.4%])。
英国生物银行中的罕见P/LP变异
在英国生物银行的AF诊断人群中，共有574名个体(2.0%)被确定为已确立心肌病基因中的罕见P/LP变异携带者。如图2B所示，我们观察到AF发病年龄与罕见pLOF变异流行率之间的反向剂量反应关系。AF诊断年龄低于45岁的个体中变异携带者的流行率最高，为3.85%。相比之下，45-54岁发病组为2.48%，55-64岁组为2.20%，65岁及以上组为1.74%，无AF诊断组为1.03%。
携带者计数的详细信息在补充表S2中提供，我们在其中报告了英国生物银行中总体AF人群和整个研究人群的变异计数。
早期发病AF的个体携带罕见P/LP变异的比值比显著更高(图2C)。与无AF的参照组相比，45岁前发生AF的个体携带心肌病相关基因中P/LP变异的OR为3.87(95% CI 2.63-5.69; P<0.0001)。其次是45-54岁发病组的OR为2.48(95% CI 1.92-3.19; P<0.0001)，55-64岁组的OR为2.23(95% CI 1.91-2.61; P<0.0001)，以及65岁及以上组的OR为1.80(95% CI 1.59-2.03; P<0.0001)。在先前无心肌病或心力衰竭的参与者子集中，结果一致(补充图S3)。
此外，我们检查了英国生物银行中34个研究心肌病基因中变异的分布(图3)，发现大多数变异位于与DCM相关的基因中，主要由TTN变异驱动。
讨论
本研究结合了精心筛选的丹麦早期AF队列数据与来自英国生物银行的人口规模数据，以阐明AF患者中已知心肌病基因中遗传变异的流行率。我们发现早期发病AF与34个与DCM、HCM或ARVC相关的基因中罕见遗传变异的更高流行率显著相关。
在早期发病AF的丹麦个体中，超过十二分之一(8.8%)携带罕见P/LP变异。这些变异大多数位于DCM相关基因中，TTN变异占所有P/LP变异携带者的38.6%。TTN编码肌联蛋白，是肌小节中的关键结构蛋白，该基因中的截短变异是DCM发展的公认原因和AF的原因。
继TTN之后，LMNA是该队列中变异最多的第二基因，代表11.3%的变异。LMNA编码层粘连蛋白A/C，其变异通常与早期发病AF相关，并与DCM和猝死等严重并发症相关。此外，我们在SCN5A中鉴定出三个P/LP变异，包括一个pLOF变异。虽然这种钠通道主要易受与房室传导阻滞和DCM相关的错义变异影响，但我们鉴定的无义变异先前已被分类为致病性，因为它改变了细胞内钠和钙稳态。如先前报道，我们还在RBM20(各种心脏基因的剪接调节因子，包括TTN和TPM1)中观察到两个pLoF变异。此外，我们在包括MYBPC3、MYL2和MYH7在内的几个其他肌小节基因中鉴定出P/LP变异携带者。值得注意的是，MYBPC3和MYH7已知参与70%的肌小节基因变异阳性HCM。
此外，我们在两个与ARVC相关的桥粒基因中鉴定出三个变异，PKP2和DES中各一个。PKP2编码桥粒斑蛋白2，一种在ARVC中至关重要的桥粒蛋白，它破坏细胞内钙处理并使患者易患室性心律失常。
英国生物银行的分析为不同年龄组中遗传变异的流行率和分布提供了补充见解。具体而言，我们发现早期发病AF的个体携带P/LP变异的OR为3.87，相比参照组。先前的研究已经描述了类似的模式。TTN基因是这种关联的主要驱动因素。在我们的研究中，我们专注于TTN PSI>90的组成型外显子，并选择MAF<1%的变异。这种方法使我们能够专注于更罕见、可能更具致病性的变异，这些变异可能对疾病发展产生更大影响。
在检查的基因中，P/LP变异的最高比例出现在DCM基因如TTN、MYH7和HCM基因如MYBPC3、ALPK3中。虽然大多数变异在DCM和HCM相关基因中发现，但我们也观察到相当比例的变异在先前与ARVC相关的基因中，PKP2是最常见的。在其他ARVC相关基因如DSP和DSG2中也发现了额外变异，两者都编码桥粒蛋白。桥粒结构缺陷导致心肌细胞脱离和细胞死亡，导致纤维脂肪组织浸润和电不稳定性。
与丹麦队列的发现相比，LMNA变异在英国生物银行队列中相对罕见。一个可能的解释是LMNA变异通常导致早期发病DCM，通常在英国生物银行纳入个体的年龄范围之前表现出来，这可能导致这些变异的代表性不足。因此，丹麦早期发病队列的发现为最有可能被选为未来潜在基因检测计划的患者群体中罕见P/LP变异的流行率提供了有价值的见解。
总之，我们的发现表明，AF非常早期发病的个体在心肌病相关基因中具有高比例的潜在致病性变异。值得注意的是，当仅限于AF前无心肌病或心力衰竭的个体时，这些发现仍然一致。我们在478名AF疾病非常早期发病的精选队列中观察到最高流行率，其中8.8%携带罕见P/LP变异。这与最近的临床研究一致，这些研究显示早期发病AF患者基因检测的阳性率很高。这些个体可能受益于更彻底的临床监测，以帮助识别心肌病和后续心力衰竭风险增加的个体。虽然系统性罕见变异的基因筛查不太可能在近期实施，但将遗传数据纳入临床实践可以改善AF个体中的心肌病风险分层。
局限性
本研究的发现应结合以下局限性进行解释。首先，丹麦队列仅包括AF非常早期发病的个体，这不能代表典型的AF患者。这种选择可能部分解释了与英国生物银行中早期发病AF个体相比，丹麦队列中观察到的P/LP变异流行率更高。此外，尽管82.4%的丹麦队列有可用的超声心动图，但仅凭正常的LVEF不能排除潜在心肌病的存在。因此，未来仍需要进行深入心室表型分析的研究，以充分评估心肌病基因中P/LP变异在早期发病AF中的作用。此外，英国生物银行中的健康志愿者偏倚可能导致致病性遗传变异个体的代表性不足，这可能限制这些发现的普遍适用性。此外，丹麦队列的靶向测序不包括ALPK3、ACTC1、TNNC1和PLN，这可能会影响我们变异分析的全面性。
此外，并非所有变异都可能具有同等的致病性或渗透性。由于参与者必须存活到纳入各自队列，这可能导致某些变异的代表性不足。最后，两个队列都是欧洲白人血统，不能假设这些发现可以推广到其他人群群体。
结论
通过使用两个不同的AF队列，我们发现相当数量的早期AF发病个体在标志性的心肌病基因中携带罕见的致病性变异。在丹麦个体的表型良好的队列中，AF发病年龄低于45岁且无先前心肌病或心力衰竭，8.8%在心肌病相关基因中携带致病性或可能致病性变异。这些发现支持对早期发病AF的个体进行心肌病筛查和临床监测可能是相关的。
【全文结束】