摘要
外泌体作为一种无细胞再生生物制剂，已证明在解决盆腔重建手术后阴道网片暴露方面效果显著；然而，关于其用于预防网片相关并发症的研究数据较少。本研究评估了纯化外泌体产品(PEP)预防网片暴露的早期效果。十头约克夏杂交猪接受了网片骶骨阴道固定术，采用两种高风险暴露配置：网片向前折叠(腹侧)，阴道切开向后(背侧)。在基线时注射透明质酸(HA)中的PEP或仅HA(对照)。12周后，动物被安乐死并评估网片暴露和组织学变化。PEP治疗的组织中无一显示网片暴露(0/6)；所有对照组动物均经历了网片暴露(4/4网片折叠配置，2/4阴道切开配置)。对照组织表现出更高的纤维化(阴道切开纤维化评分：中位数(IQR)；3(3,3)对照组，2(1,2)PEP组；p = 0.03)和更大的上皮细胞凋亡(网片折叠TUNEL+面积分数：中位数18.9对照组vs 0.43 PEP组；p = 0.02)。本研究表明，PEP治疗减轻了早期网片暴露的风险。
引言
在骶骨阴道固定术中植入聚丙烯网片是治疗女性盆腔器官脱垂的公认且持久的方法，但存在阴道网片暴露的风险，通常需要通过网片切除进行治疗¹,²,³。网片骶骨阴道固定术后网片暴露的发生率在1%至10%之间，因网片相关并发症而再次手术的发生率在8%至40%之间⁴,⁵,⁶,⁷,⁸,⁹,¹⁰,¹¹,¹²。减少网片相关并发症的两种潜在策略是修改网片特性或调节宿主的组织环境和再生努力。本研究聚焦于后者。
再生医学技术在妇科和泌尿妇科领域受到越来越多的关注。此类应用的示例包括用于生育适应症的子宫内膜优化以及用于盆底疾病的肌肉和结缔组织再生¹³,¹⁴。外泌体是一种细胞外囊泡，可从各种组织和细胞(包括骨髓、血浆和尿液)中收获，已被用作无细胞再生技术。外泌体的作用机制据称是多方面的，包括通过激活自分泌和旁分泌途径引发宿主再生。外泌体已被纯化并制成临床级产品——纯化外泌体产品(PEP；Rion LLC；明尼苏达州罗切斯特)。该产品由汇集的人类血浆制成稳定的冻干粉末；因此，这些外泌体来源于血小板。PEP在临床前和临床研究中已显示出对骨骼、肌肉和结缔组织的再生能力¹⁵,¹⁶,¹⁷,¹⁸,¹⁹,²⁰。在我们的猪模型初步研究中，PEP注射诱导了组织再生并解决了网片增强盆腔重建手术后的阴道网片暴露²¹,²²。
在本研究中，我们旨在评估PEP在高风险骶骨阴道固定术网片配置中早期预防阴道网片暴露的功效，并检查局部组织的变化。我们假设，与对照组相比，注射PEP的网片-阴道复合物在术后早期会经历更少的网片暴露，并表现出更有利的组织学特征。
结果
所有动物均能耐受手术而无临床显著的不良事件。值得注意的是，由于先前研究已证明测试物品的安全性，因此未进行正式的尸体解剖和组织学安全评估。
对照组(n = 4)中的所有动物在肉眼检查中均表现出网片暴露。在对照组中，阴道切开网片配置中有两个非显著暴露(<1 cm；覆盖先前阴道切开的暴露)，而网片折叠配置中有一个非显著暴露(2 cm尾部到网片中心最突出部分)和三个显著暴露(≥1 cm；覆盖网片折叠中心扭曲部分的暴露)。PEP组(n = 6)中没有动物表现出网片暴露。图1展示了存在和不存在网片暴露的肉眼示例。
图1：按组(对照组vs PEP + HA)和条件(网片折叠vs阴道切开)比较外观的摄影：注意——为了并排拍摄两种网片条件的照片，阴道被去管化。
阴道切开的位置用虚线黄色菱形标记，折叠网片用实线蓝色矩形标记。对照组组织在网片上表现出较薄的组织和阴道网片暴露，在网片折叠条件下更为常见。实验中使用的网片是蓝色的，在对照组网片暴露(左侧)中可见。
在对照组中，无论是网片折叠还是阴道切开条件，对H&E和三色染色切片的评估都显示网片纤维收缩或间距丧失，在组织学上形成具有更多网片纤维横截面的网片聚集体。这些对照组聚集体主观上被认为包含网片周围水肿、纤维化和炎症细胞(图2a)。在具有网片折叠的对照组中，阴道上皮表现出上皮结构的破坏，且连续性较差，这与肉眼网片暴露的存在一致(图2b)。对照组和治疗组之间阴道切开网片配置的组织学评分比较显示纤维化存在显著差异(中位数(IQR)；3(3,3)对照组，2(1,2)PEP组；p = 0.03)。在任一网片条件下，治疗组之间的炎症或新生血管形成均无显著差异(图3a, b)。
图2：按组和条件划分的上皮和网片周围组织学。
a 显微照片显示，与PEP + HA相比，对照组组织中网片周围反应性水肿伴相关纤维化(由*表示)更大。为便于识别，网片纤维由"+"表示；b, c) 10X(b)和2X(c)显微照片显示对照组和PEP + HA组织之间上皮结构的差异，特别是在具有网片折叠的对照组组织中，上皮结构破坏明显(由箭头表示，b)。Masson三色染色。
图3：通过网片配置(阴道切开或网片折叠)比较对照组和PEP+HA结果的组织学评分结果。
a 在阴道切开网片配置中，网片周围炎症和新生血管形成在对照组和PEP+HA组之间无统计学差异。与对照组组织相比，PEP+HA组织的纤维化显著减少(P < 0.05)。b 在网片折叠配置中，治疗条件之间的组织学评分无统计学显著差异。
对于网片周围细胞凋亡，对照组中有更多样本在网片纤维周围表现出高TUNEL+信号，但标本间的差异导致统计学上无显著差异(图4a)。对于上皮细胞凋亡，网片折叠条件显示对照组中的细胞凋亡多于PEP治疗组(图4b；中位数18.9 vs 0.43；p = 0.02)。
图4：使用Thermo Fisher Click-iT TUNEL染色的显微照片(TUNEL染色为绿色；细胞核的Dapi染色为蓝色)。
a 与PEP + HA相比，阴道切开条件下对照组组织中网片周围细胞凋亡更大，但按网片条件区分无显著差异。网片纤维由*表示。b 与PEP + HA组织相比，对照组上皮组织所有层的细胞凋亡更大；在对照组中，网片折叠条件下的细胞凋亡显著更高(p = 0.02)。
讨论
在本项使用可注射外泌体再生疗法的临床前大型动物研究中，在易发生暴露的网片骶骨阴道固定术模型中，使用HA载体的外泌体递送被发现可降低早期阴道网片暴露的发生率，与仅给予HA的对照组相比。实际上，网片暴露仅在对照组织中发现，在外泌体治疗的组织中均未出现。我们在每只动物中评估了两种易发生暴露的网片配置——阴道切开和网片折叠——网片折叠配置更频繁地经历延迟的网片暴露，使其成为两种评估配置中风险更高的配置。除了肉眼网片暴露发生率的差异外，在组织水平上，我们发现外泌体治疗组的纤维化和细胞凋亡低于对照组织，表明更有利的组织水平环境。
值得注意的是，即使在雌激素剥夺和高风险网片配置的情况下，外泌体组在12周终点时仍能预防网片暴露。虽然雌激素在即时再生中的作用尚未完全明确，但人们认为它对巨噬细胞浸润的第一阶段和潜在的巨噬细胞表型转换有害，这可能导致纤维化而非再生环境；然而，从临床角度看，缺乏雌激素也会导致阴道组织变薄，增加网片暴露的风险⁹,²³,²⁴。事实上，阴道雌激素乳膏通常被用作阴道网片暴露的一线治疗。总之，雌激素的作用可能根据暴露的时间而有积极和消极两面；然而，绝经后状态通常被认为会增加网片暴露的长期风险。我们的目标是创建一个高度易发生暴露的模型；因此，我们选择进行卵巢切除术，但仍展示了组织再生和网片暴露预防方面的组间差异。
许多研究已经证明了某些网片材料(如聚丙烯)和配置的有害影响²⁵,²⁶,²⁷,²⁸,²⁹。虽然新型网片材料尚未用于临床实践，但外科医生能够控制的因素主要围绕具有特定特性的网片选择(例如，网片体积、编织、孔塌陷、孔径、重量)和手术技术¹,³⁰,³¹。在我们的研究中，我们使用了具有大孔径和相对低孔塌陷的轻质聚丙烯网片，因为它在我们的专业——泌尿妇科中常用。目的是也尽量减少网片本身对再生或缺乏再生的贡献。使用的两种高风险配置之一是从Knight等人在新西兰白兔中展示的模型推导出来的，该模型表明带有折叠的网片植入物更可能与网片暴露相关²⁵。这是合理的，因为网片中的折叠或弯曲会产生机械应力的焦点和孔塌陷，这两者都已被证明会增加网片暴露的风险³²。在我们的研究中，我们还在对照组织的网片折叠区域观察到更高的细胞凋亡。在临床实践中，当意外发生阴道切开时，外科医生可能会面临是否放置网片植入物的困境。我们在模型中复制了这一点。两种网片配置都进行了评估，网片折叠是最差的配置，导致更多的网片暴露。外泌体注射确实缓解了这一点，因为研究中外泌体治疗的组织在术后早期没有经历暴露。在外泌体治疗缺失的情况下，外科医生应谨慎防止网片折叠和弯曲，尽管这些在收缩的骨盆、多次手术的阴道或个体解剖差异中有时不可避免。如果再生技术成为主流，这些技术(如外泌体)可能能够在不可避免网片折叠或弯曲或发生阴道切开时减轻网片暴露的风险。
我们的研究有几个局限性，其中一些是大型动物临床前研究固有的，其他则是由于使用猪模型造成的。总体而言，我们的样本量适中；然而，通过在每只动物中创建两种网片条件，最大限度地利用了所获得的数据。由于样本量适中，我们可能因统计效力不足而无法对某些结果达到统计学显著性。使用大型动物模型对临床结果有利；然而，组织学分析，特别是免疫组织化学，在猪组织中具有挑战性。我们本打算表征免疫反应并通过免疫组织化学证明纤维化，但抗体在研究组织中不可靠。我们转而依靠盲法病理学家的组织学评分。最后，虽然12周对于临床前大型动物研究来说是一个重要时期，但在临床领域仍被视为短期随访，尚不清楚外泌体对组织的积极影响是否会随时间消退。
我们研究的优势包括使用解剖结构与人类阴道解剖结构相似的大型动物模型，允许植入临床上有意义大小的网片植入物。我们将研究进行到12周，这将捕捉伤口重塑和纤维化的慢性过程，以及聚丙烯网片植入时可能发生的收缩。网片也按照人类手术的方式植入和张力，以半复制网片-阴道复合物通常会经历的生物力学力——作者认识到猪行走的四足性质，而人类灵长类动物则是两足的。我们使用了一种通过自动化过程制造且稳定的再生产品PEP。这些特性使再生生物制剂易于使用，使治疗易于复制，与基于细胞移植的治疗相比具有主要优势。最后，我们完成了普遍的卵巢切除术，以创建类似绝经后的状态，以模拟绝经后妇女的较薄阴道组织。
这项临床前猪研究评估了在易发生网片暴露的骶骨阴道固定术模型中早期术后网片暴露预防的结果表明，再生技术(如外泌体)可能改善组织水平环境和再生，从而预防阴道网片暴露。当前研究代表了一个适中的样本和终点；未来研究应在更大样本中评估网片暴露风险的缓解，并通过使用更长的终点来评估测试物品效果的持久性。
方法
所有程序均获得机构动物护理和使用委员会的批准(协议22–264)。易发生暴露的模型是从兔子模型和临床经验的一般外科原则推导出来的²⁵。
实验设计
十头约克夏杂交猪(50–60公斤)在基线时接受了生存手术，以创建易发生阴道网片暴露的模型。该模型首先通过进行开放腹式子宫切除术和卵巢切除术创建；然后按照骶骨阴道固定术的典型方式进行腹侧和背侧阴道解剖。应用I型聚丙烯网片(Vertessa Lite, Caldera Medical, Westlake Village, CA)，在所有动物(n = 10)中采用两种高风险配置：1)腹侧网片弯曲(即扭曲网片)，以及2)使用间断聚乙醇酸910缝线修复1 cm阴道切开，并在背侧覆盖网片(图5a)。网片植入物尺寸为4 x 10 cm。网片的近端臂用2-0聚丙烯缝线固定到骶骨上，张力调整使得阴道从其静止位置升高2 cm。动物在骶骨阴道固定术时随机接受PEP注射(n = 6)或对照注射(n = 4)；每只动物的腹侧和背侧网片条件使用相同的测试物品处理。
纯化外泌体产品(PEP)或透明质酸(对照)的注射
通过将5 x 10¹²冻干外泌体(PEP；Rion LLC, Rochester, MN)在1 mL无菌水(Hospira Inc., Lake Forest, IL)中重新配制，然后与4 mL临床级透明质酸(HA)(12 mg/mL；Lifecore Biomedical, Chaska, MN)混合，创建20% PEP的工作溶液。总共5 mL PEP混合物由盲法外科医生注射，分配到腹侧和背侧阴道。水凝胶注射到每个网片植入物下方的纤维肌肉组织中，使用22号针头，均匀分布在九个部位(3 × 3网格模式，图5a)。
对照组动物接受4 mL透明质酸的注射，分配到腹侧和背侧阴道，采用3 × 3注射网格模式。请注意，由于在PEP + HA组中需要无菌水来重新配制外泌体，对照组的注射体积比PEP + HA组少1 mL。
组织收获和组织学处理
基线注射后12周，所有动物使用戊巴比妥安乐死。整体切除泌尿生殖器官，去管化以使其平放，并拍照。随后，使用手术刀取样阴道-网片复合物最中心部分，放入盒中并浸入福尔马林。福尔马林固定石蜡包埋组织在切片机上以10 µm厚度切片。切片按照标准实验室方案进行苏木精和伊红(H&E)和Masson三色染色。
为了评估组织细胞凋亡，我们使用了TUNEL检测，该检测在受损DNA的3'-OH末端插入标记的核苷酸。对于该检测，样品在4%多聚甲醛中于37°C孵育15分钟。然后将载玻片放入0.25% Triton X-100 PBS混合物中，孵育15分钟。使用Click-iT Plus TUNEL检测(Thermo Fisher; C10617)及其相应程序，进行TdT反应和Click-iT Plus反应。在Click-iT Plus反应期间，Alexa Fluor® 488皮考基叠氮化物(Invitrogen)二抗稀释至1:1000，在37°C孵育30分钟。洗涤后，使用Invitrogen ProLong Gold抗褪色封固剂与DAPI®密封盖玻片。使用Motic Easy Scan Pro数字幻灯片扫描仪在4x、10x和20x物镜下对切片进行成像。
量化和统计分析
网片暴露量化
阴道-网片复合物被去管化，并评估是否存在网片暴露。网片暴露被定义为网片纤维穿透上皮全层并进入阴道腔。使用照片处理程序获取网片暴露的尺寸，并通过游标卡尺在新鲜组织上测量确认。根据尺寸将暴露分类为非显著(<0.5 cm)或显著(≥1 cm)，显著性阈值由临床经验确定。
组织学量化
组织学分析由盲法病理学家进行。研究者为靠近感兴趣区域(ROI)的炎症、远离ROI的炎症、巨细胞、新生血管形成、纤维化、坏死和矿化分配数值评分(0–4)。图5c展示了组织学评分的代表性图像。比较了PEP组与对照组的评分。
TUNEL量化
使用FIJI中的自定义半自动宏(ImageJ, version 1.54 f, National Institutes of Health)分析图像。简而言之，将包含DAPI和TUNEL信号的10倍放大叠加图像输入ImageJ。对于上皮TUNEL分析，根据组织边缘处增加的DAPI密度和上皮外观手动追踪上皮区域(上皮ROI)。将上皮ROI与TUNEL图像叠加，半自动阈值调整以排除背景荧光。TUNEL阳性报告为每个ROI的TUNEL+面积分数，定义为TUNEL+面积除以ROI总面积(无量纲)。对于含有网片的深层组织区域，手动追踪总网片纤维面积(单个网片纤维的空隙)并计算。随后，手动绘制围绕网片区域延伸的大约80–100 um(单个网片纤维的直径)的较大ROI，减去总网片纤维面积，得到网片周围纤维组织净面积(网片周围ROI)。将TUNEL图像与网片周围ROI叠加，如上所述计算网片周围ROI的TUNEL+面积分数。在所有分析中，排除明显伪影区域。
使用JMP Pro(Version 8, Cary, NC)进行统计分析。数据根据结果适当报告为中位数(四分位距(IQR))、数量(百分比)和计数。在适当的情况下，使用非参数检验、Kruskal-Wallis和Mann-Whitney检验进行Bonferroni校正分析数据。对于具有非数值比较的数据，使用数据可视化技术。显著性水平设定为α为0.05。
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