1. 引言
由膜包裹的粒子——细胞外囊泡（EVs）广泛存在于动物、植物和微生物体内[1,2]。根据尺寸和起源，EVs被分为凋亡小体、微囊泡和外泌体（EXs）[1-3]。其中外泌体是最广泛研究的EVs类型，其由单层磷脂双分子膜包裹，所有细胞类型均可分泌[1,3-5]。外泌体通常直径在30-150纳米，通过多泡体与内体膜内陷融合形成[1,3-5]。外泌体存在于唾液、羊水、母乳、尿液和血浆等体液中[6]，其通过递送蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性物质改变受体细胞功能，从而在细胞间通讯中发挥关键作用[7,8]。
外泌体作为治疗性物质递送载体的策略日益流行，部分原因在于其克服了其他方法的诸多挑战。外泌体具有高稳定性和生物相容性且免疫原性极低[9]。相较于传统方法，外泌体的靶向递送效率更高，因其可穿透血脑屏障等生物屏障[10,11]。由于其源自特定细胞的固有趋向性，外泌体可选择性靶向组织或细胞，从而减少脱靶效应[12]。外泌体为包裹的生物活性物质提供保护环境，使其免于降解[13]。更重要的是，外泌体是干细胞发挥生物学效应的主要途径，使用干细胞来源外泌体可在避免细胞潜在危害的同时保留其治疗潜力[14,15]。值得注意的是，不同细胞来源的外泌体系统性给药后通常主要积聚于肝脏和脾脏，仅有不足1%达到预期靶标[12,16]。因此，研究者已开发多种工程化方法以提升靶向性和靶器官富集效率。
2. 细胞外囊泡和外泌体作为治疗递送系统的最新进展
2.1 外泌体的基因工程改造
通过基因工程改造外泌体表面蛋白可更精准地靶向特定组织和细胞类型，因为外泌体四跨膜蛋白复合物的微小变化会显著影响靶细胞选择。其中一种方法是将编码靶向配体的基因与外泌体膜组分共同转染至生产细胞中。通过外泌体自然生物合成过程，转染这些载体的细胞会产生表面修饰的外泌体，稳定表达靶向配体[17]。例如，Wang团队[18]通过基因工程改造干细胞来源的外泌体，负载铁死亡抑制剂以靶向M2小胶质细胞。基因工程改造的外泌体在体外和体内均表现出M2小胶质细胞特异性靶向性，抑制了铁死亡并改善了缺血性卒中小鼠的神经功能[18]。通过将狂犬病毒糖蛋白（RVG）——一种结合烟碱乙酰胆碱受体的蛋白，与溶酶体相关膜蛋白2B（外泌体膜蛋白）组成的融合蛋白转染至293T细胞中，成功获得了膜嵌入RVG的外泌体[19]。由于神经元和胶质细胞表面表达RVG受体，系统性给药后RVG修饰外泌体相较未改造外泌体，脑内富集量提升了2倍[19]。
2.2 外泌体的化学修饰
通过化学修饰可直接工程化改造外泌体表面，使其具有更强的靶向性。点击化学技术是其中一种方法，其利用炔烃与叠氮残基间的共价作用形成稳定的三唑键，可将靶向配体偶联至外泌体表面[20,21]。例如，Jia团队[22]使用点击化学将RGERPPR肽（RGE）偶联至外泌体膜。这种工程化外泌体通过RGE靶向神经纤毛蛋白-1（NRP-1）——胶质瘤细胞高表达而正常神经元和其他组织低表达的受体，实现了颅内肿瘤的靶向治疗[22]。Chen团队[23]采用点击化学将靶向肽偶联至巨噬细胞来源外泌体表面。这些工程化外泌体可靶向骨组织并释放抗菌肽，在大鼠模型中有效缓解骨髓炎且无副作用[23]。
2.3 组合策略
杂交纳米颗粒
除亲本细胞/外泌体的基因工程改造和化学修饰外，另一种方法是将靶向配体与聚乙二醇（PEG）结合，生成靶向外泌体。例如，将特异性靶向表皮生长因子受体（EGFR）——多种实体瘤高表达靶点——的纳米抗体与磷脂-PEG衍生物偶联形成纳米抗体-PEG胶束[24]。当将这种纳米抗体-PEG胶束与外泌体共培养时，其嵌入外泌体膜而不影响外泌体的尺寸分布、蛋白组成或形态。PEG修饰和靶向外泌体对EGFR高表达肿瘤细胞的结合能力增强，且在血液循环中的保留时间是未修饰外泌体的6倍[24]。
二酰基链磷脂在水溶液中自组装形成脂质体[25]。通过将靶向胶质瘤细胞的tLyp-1肽（CGNKRTR）——具有高NRP-1亲和性——与外泌体（具有穿越血脑屏障的增强能力）融合，创建了具有双重优势的杂交脂质体-外泌体纳米载体。这种新型载体在穿越血脑屏障和靶向脑肿瘤方面表现出显著优于脂质体和原代外泌体的能力[26,27]。
另一项创新研究中，脂肪来源的间充质干细胞（ADSC）外泌体与明胶纳米颗粒（GNP）水凝胶因电荷相反形成稳定网状结构。在大鼠颅骨缺损模型中，GNP水凝胶-ADSC外泌体混合物诱导的颅骨形成量显著高于GNP单独处理组和假手术组[28]。
Liu团队[29]开发了一种命名为REXO-C/ANP/S的纳米复合物，包含核心层和外壳层。核心层（C/ANP/S）由三部分组成：(a)破坏α-突触核蛋白聚集体的小分子姜黄素；(b)靶向SNCA基因的小干扰RNA以抑制α-突触核蛋白合成；(c)具有活性氧响应性的聚合物（聚（二甲氨基乙基丙烯酸酯），可包封姜黄素并实现活性氧响应性药物释放。外壳层（REXO）由：(a)未成熟树突状细胞来源的外泌体；(b)嵌入外泌体膜的RVG肽组成——该靶向肽可增强穿越血脑屏障并靶向神经元。在帕金森病小鼠模型中，该纳米复合物显著降低了病理性神经元中的α-突触核蛋白聚集体[29]。
2.4 大规模外泌体生产技术
传统二维静态培养体系中外泌体的产量和质量均显著下降，因该体系无法模拟体内流体刺激等微环境[30]。为突破这一限制，Huang团队[31]开发了一种培养基因工程化间充质基质细胞的新方法，显著提高了富含肝细胞生长因子（HGF）的外泌体产量以改善伤口愈合。通过构建含微通道的芯片，顶部鲱鱼骨结构通过扰动层流产生湍流涡旋增强废物清除和营养输送，底部微柱阵列为细胞提供大量黏附位点。该微流控芯片培养的细胞产生的外泌体量约为传统二维静态培养的14倍，且外泌体富含HGF，显著促进伤口愈合[31]。
相较传统静态培养，采用平板生物反应器可显著提高外泌体产量。该反应器通过蠕动泵提供层流条件产生的剪切应力激活钙通道，增加钙离子内流[32]。已有研究表明胞内钙浓度升高可促进外泌体分泌[33]。通过闭环系统循环培养基，实现了氧气、营养物质的持续交换和废物清除。该反应器生产的外泌体量较静态培养提升7倍，且保持了外泌体的质量和治疗效力[32]。
2.5 牛奶和植物来源外泌体
尽管体外培养细胞来源外泌体规模化生产取得进展，牛奶和植物来源外泌体的应用日益受到关注。牛奶是极富集的外泌体来源，浓度可超过10^12个/毫升[34]。凭借其稳定性、可扩展性、穿越生物屏障能力和跨物种生物相容性，牛奶外泌体正被开发为药物递送平台。牛奶外泌体作为非免疫原性载体，可用于基因编辑工具、肽类、小分子和生物活性RNA的口服递送[35-37]。然而牛奶外泌体分离与表征面临挑战，因为牛奶中包含多种纳米颗粒[38]。持续研究对挖掘其临床潜力至关重要。
与牛奶来源外泌体类似，植物来源外泌体亦具巨大潜力。植物来源外泌体可能通过细胞间通讯和免疫调节保护植物免受病原体攻击[39]。其尺寸分布、密度、形态和表面电荷与哺乳动物来源外泌体相似[40]。像哺乳动物细胞来源外泌体一样，它们也含有来源于葡萄、姜和苹果等植物的脂质、蛋白质和RNA[41-43]。植物外泌体的分离技术与哺乳动物细胞来源外泌体差异不大[44]。植物外泌体安全性高[42]，其生产比哺乳动物细胞来源外泌体更具成本效益[45]。为推动临床应用，需建立标准化提取协议并评估长期安全性。
3. 本特刊的贡献
在本特刊中，Mecocci团队[46]报道了牛初乳来源外泌体在体外新生犊牛大肠杆菌感染腹泻模型中的抗菌和抗炎效应。其研究结果表明初乳来源外泌体可能成为抗生素替代品，应对耐药菌感染。Schepici团队[47]全面综述了间充质基质/干细胞来源外泌体在脊髓损伤再生治疗中的作用及临床前研究进展。Mohammad团队[48]研究了运动诱导外泌体对体外滋养层细胞的影响，揭示其在妊娠期间母胎通讯中的潜在作用。Rademacher[49]描述了外泌体在帕金森病中的双重作用——既是疾病进展的介质，又是潜在的治疗工具。在外泌体介导的疾病进展中，其通过传播毒性蛋白和促进神经炎症发挥作用，但其天然细胞通讯功能和递送治疗剂的潜力使其成为下一代疗法的候选[49]。Wang团队[50]研究了成骨诱导的人骨髓间充质细胞（hBMSCs）来源外泌体在恢复缺氧损伤hBMSC成骨能力中的作用。他们发现常氧培养hBMSCs来源的外泌体可恢复缺氧损伤的hBMSCs成骨能力，为缺氧条件下的骨再生提供了潜在治疗策略[50]。Berry团队[51]综述了物理线索（如电刺激、机械扰动和导电材料）对干细胞来源外泌体治疗周围神经病变的影响。他们得出结论：这些物理线索显著提升了外泌体的产量、质量和治疗潜力，使其更有效治疗周围神经病变[51]。Zmievskaya团队[52]比较了两种诱导方法（细胞松弛素B化学诱导和超声波物理诱导）对T细胞人工外泌体效率和质量的影响。Garaeva团队[53]发现负载外源重组葡萄柚来源热休克蛋白70的外泌体在结直肠癌体内外模型中触发抗肿瘤免疫反应，凸显植物来源外泌体作为有效治疗载体的潜力。Jones团队[54]证实冻干人脂肪干细胞来源外泌体在促进创伤性脑损伤愈合中的有效性，证明其可室温储存并应用于临床。最后，Salih团队[55]研究了非小细胞肺癌患者血清外泌体中let-7a-5p和miR-21-3p的表达，揭示其作为诊断生物标志物的潜力。
4. 未来研究方向
尽管基因工程改造外泌体具有改善靶向精度、提高治疗递送效率和减少脱靶效应等优势，但高生产成本、高技术门槛以及区分基因工程改造外泌体与生物液体中天然外泌体的挑战等缺陷仍需突破。未来需进一步研究和优化以推动其临床转化。化学修饰外泌体具有增强靶向性、保留天然特性、可穿越生物屏障等优势，但共价/非共价修饰技术难点、外泌体膜蛋白功能可能丧失以及规模化生产的困难仍是主要障碍。未来研究应着重解决这些问题。杂交纳米颗粒在生产过程中可能导致外泌体膜破坏、引发免疫反应以及监管分类不明确等问题，增加审批难度。清晰的监管框架、可扩展的生产方法和改进的工程技术是解决这些挑战的关键。尽管微流控芯片和生物反应器等大规模生产技术取得积极进展，但未来仍需发展隔离技术、工程方法和标准化协议以实现临床级规模化生产。牛奶外泌体作为非免疫原性口服递送载体具有潜力，但主要障碍在于隔离技术从实验室向工业生产的转移。此外，缺乏详细的药代动力学研究以及牛奶复杂成分给高纯度外泌体分离带来困难。需改进隔离技术、可扩展生产方法以及开展全面安全性和有效性研究。尽管植物外泌体安全且生产成本效益更高[45]，但需通过临床前和临床研究验证其治疗效果、优化剂量并评估长期影响，才能成功应用于临床。
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