摘要
虽然顺铂仍然是肿瘤学干预的基石，但它诱导的系统性氧化应激安排了一连串有害级联反应，损害男性生殖稳态。硒纳米颗粒(SeNPs)可能保护免受氧化应激，而用阿拉伯胶(AG)包被它们可能会增强其治疗功效。本研究调查了硒纳米颗粒(SeNPs)和阿拉伯胶(AG)包被的SeNPs(AG-SeNPs)对顺铂诱导的睾丸功能障碍的比较生殖保护潜力。将45只雄性Wistar大鼠随机分为九个实验组：四个基础对照组(正常、AG、SeNPs和AG-SeNPs)和五个治疗组，在顺铂给药后分别接受AG、SeNPs、AG-SeNPs或AG+SeNPs物理混合物。评估参数包括性腺体指数、氧化应激的生物化学标志物(过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPX、丙二醛MDA)和促炎细胞因子(TGF-β、TNF-α和IL-6)。通过组织病理学、PCNA蛋白表达(细胞增殖)和使用彗星试验及凋亡标志物(Caspase-3和细胞色素C释放)进行的DNA碎片分析进一步评估了睾丸完整性。AG-SeNPs的给药表现出优于未包被SeNPs或物理混合物的生殖保护功效。AG-SeNPs显著恢复了氧化还原稳态，通过增强抗氧化酶活性(CAT、GPX)和减少脂质过氧化(MDA)。此外，AG-SeNPs显著下调了炎症信号传导(TGF-β、TNF-α和IL-6)并减轻了DNA损伤。该治疗保持了基因组稳定性，并通过抑制细胞色素C释放和Caspase-3激活抑制了内源性凋亡途径。组织学检查证实了生精小管结构的恢复和细胞增殖增强(PCNA表达)。这些发现表明，AG包被增强了SeNPs的治疗指数，可能是由于提高了生物利用度和协同抗氧化特性。AG-SeNPs代表了一种有前景的基于纳米医学的策略，用于减轻基于顺铂化疗的性腺毒性副作用。
引言
不育症被定义为一对夫妇在12个月无保护性交后未能怀孕。这一状况构成了全球重要的公共卫生问题。男性因素显著影响全球约10-15%的夫妇，占不育症病例的20-30%，并贡献了几乎50%的整体不育症病例。当精液分析参数低于世界卫生组织(WHO)标准水平时，通常诊断为男性因素不育，包括少精症(精子计数减少)、精子活力受损和异常形态等疾病。
男性不育主要归因于受损的精子发生，这是将精原干细胞转化为完全成熟精子的复杂过程。这是一个受到严格调控的过程，可能轻易被多种原因干扰，包括遗传异常、激素失衡和其他环境污染物。虽然精索静脉曲张、勃起功能障碍和精子管阻塞导致男性不育，但超过60%的病例中睾丸功能减退的病因仍未得到解释。
值得注意的是，精子DNA碎片已成为导致不明原因生殖失败的关键因素，常常是不明原因生殖失败的根本原因。在导致男性不育的多种原因中，氧化应激已成为一个重要的潜在方面。活性氧(ROS)浓度升高可触发对精子DNA、脂质和蛋白质的损伤，导致精子活力、数量和存活率下降。
抗肿瘤药物，特别是顺铂(Cis)，一种常用的化疗药物，已被确定为对男性生殖系统造成显著损害。Cis诱导的睾丸损伤导致活性氧(ROS)生成增加、线粒体功能障碍和生殖细胞中凋亡的激活，结果导致睾丸形态和功能受损、睾酮水平降低和精子发生受损。
抗氧化治疗因其可能减轻氧化应激对男性不育症和化疗引起的生殖损害的有害影响而受到广泛关注。硒是一种重要的微量元素，对睾丸发育和精子发生至关重要，是一种强效抗氧化剂。硒纳米颗粒(SeNPs)与它们的体相等价物相比，具有更高的生物活性和更低的毒性，从而增强了它们的抗氧化、抗炎和细胞保护特性。
纳米医学的后续进步导致了阿拉伯胶包被的硒纳米颗粒(阿拉伯胶包被的SeNPs)的开发。阿拉伯胶是一种天然多糖，以其抗氧化和稳定特性而著称，显著影响SeNPs的生物利用度、稳定性和靶向给药。
越来越多的证据表明，基于纳米颗粒的疗法，特别是阿拉伯胶包被的SeNPs，是一种缓解Cis诱导男性不育的创新有效方法。本工作旨在评估阿拉伯胶包被的SeNPs对Cis诱导的雄性大鼠睾丸损伤的保护特性。
材料和方法
化学品
阿拉伯胶，CAS编号：9000-01-5，批号：822140。纳米硒和顺铂，EIMC Pharmaceuticals Co.，埃及开罗，CAS编号：15663-27-1。所有其他试剂均为优质分析级，购自Sigma-Aldrich Chemical Company Egypt。
硒纳米颗粒的制备
SeNPs通过还原亚硒酸盐合成，遵循Zhang等人的方法，稍作修改。简言之，将1克壳聚糖和0.8克维生素C完全溶解在100毫升1%(w/w)的乙酸中，产生壳聚糖/维生素C溶液。随后，将5毫升含有0.2克亚硒酸钠的水溶液逐渐加入壳聚糖/维生素C溶液中，并在500-600转/分钟下快速搅拌。
阿拉伯胶对硒纳米颗粒的包被
通过水热技术用阿拉伯胶包被硒纳米颗粒。用阿拉伯胶包被硒纳米颗粒是一种简单的程序，可提高其稳定性和生物相容性。在通过水热技术合成硒纳米颗粒后，将它们分散在水溶液中并与制备的阿拉伯胶溶液混合。随后混合物被搅拌，通常在室温或温和加热(50°C)下，促进阿拉伯胶在纳米颗粒周围形成保护涂层。包被后的颗粒随后通过离心或过滤回收，过滤以去除多余的阿拉伯胶，并脱水，有时采用冷冻干燥技术。这种包被技术产生的硒纳米颗粒表现出优异的胶体稳定性、在水环境中更大的分散性和改善的生物相容性。阿拉伯胶涂层保护纳米颗粒免受氧化，并增强其在靶向药物递送系统中的应用。通过修改过程中的因素如阿拉伯胶浓度、反应持续时间和温度，可以改进涂层的特性。
纳米颗粒的表征
使用多种技术评估硒纳米颗粒(SeNPs)、阿拉伯胶(AG)和AG包被的SeNPs的物理化学特性。使用Zetasizer Nano ZS 90(Malvern, UK)在25°C下测定Zeta电位和粒径。使用透射电子显微镜(TEM)观察形态(JEOL 2100, 80 kV, Tokyo, Japan)。使用Shimadzu UV-1800分光光度计(Kyoto, Japan)测量紫外-可见光谱，并使用Vertex 70光谱仪(Bruker, Germany)在4000-400 cm⁻¹范围内进行傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析。使用D8 ADVANCE衍射仪(Bruker, Germany)进行X射线衍射(XRD)分析。
阿拉伯胶(AG)的气相色谱-质谱(GC-MS)分析
通过气相色谱-质谱(GC-MS, Thermo Scientific Trace GC-TSQ, USA)使用TG-5MS柱确定AG的化学组成。
动物和伦理批准
从VACSERA(埃及吉萨)获得45只健康成年雄性Wistar大鼠(≈180克)，并在标准条件下(22-25°C，12小时光照/黑暗循环)保存，可在曼苏拉大学医学院医学实验研究中心(MERC)自由获取食物和水。允许大鼠在研究前有两周的适应期。该方案经曼苏拉大学动物伦理委员会批准(批准号MU-ACUC SC. PhD.23.06.9)，符合相关机构、国家和国际动物护理和使用指南。
动物实验组设计
将45只雄性Wistar大鼠随机分为九组，每组五只。每组样本量n=5(总N=45)旨在平衡足够的统计能力与动物减少的伦理原则(3R原则)。由于顺铂诱导了深刻、明确的病理改变，预期有大效应量。基于Cohen对单因素方差分析的原则，假设大效应量(f≥0.55)和显著性水平α=0.05，每组五只动物足以在九个实验组中实现至少80%的统计功效(1-β)。这符合体内纳米毒理学和药理功效研究中的标准做法。
所有治疗集在顺铂(Cis)单次注射后开始，每天连续给药45天，如表1所示。
评估和分析
通过腹腔注射xylazine(6 mg/kg)和ketamine(75 mg/kg)对治疗45天后的大鼠实施安乐死。随后收集血液和组织样本进行生化和组织学分析。
性腺体指数
在牺牲后立即取出睾丸、附睾和精囊并称重，然后估算器官与体重的比率。
精子分析
从所有实验组收集左侧尾部附睾，以根据制造商的协议评估精液参数。简言之，收集的附睾被解剖，放置在HTF(Easy Check, China)中，随后在37°C的金属浴中孵育5分钟。使用明场显微镜手动检查总精子计数、活力和形态。
生化分析
氧化应激和抗氧化生物标志物
将睾丸样本切碎并匀浆。然后将匀浆在4°C下以10,000×g离心15分钟。使用商用比色测定试剂盒(Bio-Diagnostics, Giza, Egypt)测定上清液中的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和丙二醛(MDA)水平。
炎症生物标志物
在牺牲前，在xylazine和ketamine麻醉下从心脏采集血液样本，分离血清(3000转/分，15分钟)，并使用ELISA试剂盒(Cambridge, MA, USA)分析转化生长因子β(TGF-β)和白细胞介素-6(IL-6)。
组织病理学调查
睾丸用Bouin溶液固定，常规处理并切片(5μm)。使用H&E进行一般组织学染色，使用Masson's Trichrome染色胶原纤维，然后在显微镜下检查(Olympus®)。由经验丰富的病理学家检查和评估处理的组织切片。为消除观察者偏差并确保完全客观性，病理学家在显微镜分析期间对实验组的身份不知情。
免疫组织化学
将石蜡包埋的切片脱蜡、再水化，并利用EDTA缓冲液(pH 8.0)进行热诱导抗原回收。在抑制非特异性结合后，将切片与初级抗Caspase-3抗体(R&D Systems, MAB835)一起孵育，随后与HRP缀合的二级抗体(Dako)一起孵育。使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)检测免疫反应性，并用Mayer's苏木精复染切片。通过用正常血清替换主要抗体来建立阴性对照。使用抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体(R&D Systems, MAB1389)执行了类似的免疫组织化学技术。
计算机辅助数字图像分析
使用安装在Olympus®显微镜(10×和40×)上的Olympus E420相机拍摄切片。使用Image J软件(USA)量化Caspase-3、PCNA免疫表达和胶原纤维。
流式细胞术
使用BD Biosciences流式细胞术测定试剂盒(CAS编号：9007-43-6, 94948-59-1)测量睾丸匀浆中的细胞色素C和TNF-α水平。上清液(10,000×g, 15分钟, 4°C)在FACs Canto II(BD, USA)上分析，使用FlowJo软件。
彗星试验
通过碱性彗星试验评估精子DNA损伤。使用Comet Score软件(Tritek, USA)分析每份样本的50个细胞，以尾长和尾矩作为DNA损伤指数。
统计分析
数据表示为平均值±标准误差(n=5)。使用GraphPad Prism(GraphPad 9.3.1软件, USA)进行单因素方差分析和Tukey事后检验。显著性水平设定为P<0.05。在相关时评估相对于对照的百分比变化。
结果
硒纳米颗粒(SeNPs)和阿拉伯胶包被的SeNPs(AG包被的SeNPs)的表征
通过几种分析技术评估了硒纳米颗粒(SeNPs)和阿拉伯胶包被的硒纳米颗粒(AG包被的SeNPs)。Zeta电位分析显示，SeNPs的平均Zeta电位为-13.7 mV(图1A)，表明中等胶体稳定性，而AG包被的SeNPs表现出显著更高的Zeta电位-29.4 mV(图1C)，因此显示出增强的稳定性。
动态光散射(DLS)评估了SeNPs的粒径分布，显示峰值在3.39 nm(图1B)，多分散性指数(PDI)为0.523。AG包被的SeNPs的DLS分析显示峰值尺寸为66.80 nm(图1D)，Z平均值为136.9 nm，PDI为0.453，表明中等异质性。
紫外-可见光谱显示包被的有效应用，因为它展示了SeNPs在250-300 nm范围内的特征吸收(图1E)和AG包被的SeNPs的红移。使用傅里叶变换红外(FTIR)和X射线衍射(XRD)技术确认了SeNPs和AG之间的相互作用。FTIR显示两个样本中的特征峰(图1F)，而XRD显示SeNPs的尖锐衍射峰和AG包被的SeNPs的宽非晶信号(图1G)。
SeNPs的TEM图像显示直径范围为58.66至73.56 nm的球形颗粒(图1H)，而AG包被的SeNPs的直径在130.89至139.50 nm之间(图1I)，表明有效包被。颗粒表现出高度分散和极少聚集，表明它们适合生物应用。
SeNPs和AG包被的SeNPs的Zeta电位、DLS、TEM、UV-Vis、FTIR和XRD分析的综合结果包含成功合成SeNPs及其与AG成功功能化的定性信息。这种密切观察是有效包被的积极迹象，导致稳定性增加，因为AG包被显著增加了纳米颗粒的胶体稳定性，这通过存在高负Zeta电位得到证明。此外，它导致控制形态，包被的纳米颗粒形状相似(球形)，尺寸增加，具有更坚固和定义明确的尺寸。
它还导致保留核心结构，因为光谱和衍射研究表明AG和SeNPs之间的相互作用已经实现并保留了硒核心的结晶结构。这些发现对生产稳定和功能性的SeNPs用于各种可能的生物医学和纳米技术应用起着关键作用。
阿拉伯胶(AG)的气相色谱-质谱(GC-MS)分析及其对生育力的潜在影响
表2列出了通过GC/MS方法检测到的化学成分列表，包括它们的RT(保留时间)和组成(%)。它们主要是脂肪酸、脂肪酸衍生物和萜烯，对男性不育症大多非常重要。
该表总结了GC-MS检测到的AG中的主要有机化合物，特别强调了各个化合物和累积区域的百分比，其中观察到同一化合物或接近异构体的多个条目。有趣的是，特别是像油酸甲酯(20.96%)和亚油酸(16.68%)等化合物的高组成百分比，表明它们在维持男性生育力方面的重要作用。上述化合物以其维持精子膜结构完整性、增强活力和调节激素过程而闻名，这对男性生殖健康至关重要。
AG、SeNPs和AG包被的SeNPs对体重和性腺体指数的影响
图2A-D显示，与对照组相比，顺铂(Cis)治疗后体重(图2A)和相对精囊重量(图2D)显著降低(P<0.0001和P<0.01)，这是系统毒性的证据，但对相对睾丸(图2B)和附睾(图2C)重量没有显著影响。
与Cis相比，通过AG、SeNPs、AG包被的SeNPs和AG+SeNPs的共同治疗显著(P<0.01)增强了体重，表明保护作用。虽然相对精囊重量仅通过AG和SeNPs的共同治疗显著增加(P<0.05)。尽管相对睾丸和附睾重量部分恢复，但变化不显著。总体而言，共同治疗，特别是AG包被的SeNPs，显示了对Cis诱导损伤的有效保护，这代表了预防Cis毒性的一个有希望的迹象。
AG、SeNPs和AG包被的SeNPs对精子质量的改善作用
顺铂(Cis)诱导的性腺毒性导致精子计数(图3J)和活力(图3K)显著下降，伴随形态异常(图3L)急剧增加(P<0.0001 vs. 对照组)。这些改变表明生精小管微环境紊乱和精子发生过程失败。值得注意的是，虽然AG或SeNPs的单一治疗提供了部分恢复，但AG包被的SeNP(Cis+AG包被的SeNPs)组显示出最强大的保护作用。该组显示了精子计数和活力的统计学上更优的恢复，与未包被的SeNP组和物理混合物(Cis+AG+SeNPs)相比，有效地使这些参数接近基线水平。此外，AG包被的SeNP组中精子异常显著减少表明在精子发生过程中维持了基因组和结构完整性。在Cis组中，精子形态显示失去典型的钩状外观，头部呈圆形或畸形。精子头部完全脱落，只留下可见的尾部(鞭毛)，这是精子发生过程中结构脆弱性或氧化损伤的常见指标。而尾巴紧密缠绕成螺旋或圆形配置。治疗组显示精子形态显著改善，AG包被的SeNP组改善最为显著(图3 A-I)。
AG、SeNPs和AG包被的SeNPs对氧化和抗氧化水平的影响
图4A-C展示了各种治疗对过氧化氢酶(CAT)活性(图4A)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)(图4B)和丙二醛(MDA)水平(图4C)的影响。Cis的给药显著(P<0.0001)降低了CAT活性和GPX水平，同时相对于对照组增加了MDA水平，表明氧化应激的产生。相比之下，AG包被的SeNPs和AG+SeNPs共同治疗显著恢复了CAT活性(P<0.001)和GPX水平(P<0.0001)，而AG、SeNPs、AG包被的SeNPs和AG+SeNPs共同治疗显著降低了MDA水平(P<0.0001)与Cis组相比。这表明了它们的抗氧化能力。AG包被的SeNPs在所有治疗组中具有最显著的保护作用。
AG、SeNPs和AG包被的SeNPs对纤维化和炎症细胞因子的影响
图5展示了各种疗法对细胞因子水平的影响，并提供了对纤维化和炎症反应的重要见解。图5A和B显示，与对照组相比，血清转化生长因子β(TGF-β)和白细胞介素-6(IL-6)在Cis组中显著升高(P<0.0001)。这表明Cis促进纤维化、免疫抑制和炎症。AG、SeNPs、AG包被的SeNPs和AG+SeNPs共同治疗显著降低了与Cis组相比升高的TGF-β和IL-6水平(P<0.0001)，表明它们对纤维化的保护能力和强效抗炎特性。总体而言，我们的发现表明，当Cis与AG、SeNPs或AG包被的SeNPs结合时，Cis诱导的纤维化和炎症可能得到有效缓解，Cis+AG包被的SeNPs组合最有希望。流式细胞术分析显示，顺铂(Cis)给药触发了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的急剧升高(P<0.0001)，证实了在睾丸组织中诱导了强烈的促炎状态。虽然单独使用AG或SeNPs治疗仅显示该细胞因子的轻微减少，但Cis+AG包被的SeNP组表现出TNF-α最显著的衰减。这种纳米制剂优于未包被的SeNPs和物理混合物(Cis+AG+SeNPs)，有效抑制了炎症激增并将TNF-α表达恢复到基线对照水平(图6A-J)。
组织病理学发现
H&E染色
图7展示了H&E染色下不同实验组中生精小管的组织结构。所有对照组(对照、AG、SeNPs和AG包被的SeNPs)均显示典型的生精小管结构，具有完整的生精上皮层(图7A-D)。
相反，Cis组(图7E)表现出睾丸的显著损伤。这表现为受损的生精小管、严重空泡化和生殖细胞密度降低，表明显著的细胞毒性损伤。在共同治疗组(Cis+AG、Cis+SeNPs、Cis+AG包被的SeNPs和Cis+AG+SeNPs)中观察到不同程度的组织恢复(图7F-I)。然而，Cis+AG包被的SeNPs组(图7H)表现出增强的结构恢复。该组表现出改善的生精小管组织、显著减少的空泡化和更完整的生精上皮。
Masson's三色染色
表3和图8显示了Masson's三色染色以评估睾丸中的胶原纤维沉积。对照组；图8A-D(对照、AG、SeNPs、AG包被的SeNPs分别)显示生精小管和睾丸囊周围存在不显著的胶原纤维。Cis组；图8E，在睾丸囊中具有强烈的蓝色染色胶原纤维。共同治疗组，(Cis+AG、Cis+SeNPs和Cis+AG+SeNPs)图8 F、G和I，分别，显示这些纤维显著减少，而Cis+AG包被的SeNPs组具有最强的抗纤维化作用，图8H。睾丸组织中各组的胶原纤维面积(%)在图8J中量化。
睾丸中Caspase-3和PCNA的免疫组织化学研究
图9显示了Caspase-3的免疫组织化学标记以及所有实验组中Caspase-3免疫反应性(%)的相应图像分析。对照(图9A)、AG(图9B)、SeNPs(图9C)和AG包被的SeNPs(图9D)组表现出低Caspase-3表达，表明凋亡活性处于基线水平。相比之下，Cis组(图9E)与对照组相比Caspase-3表达显著增加(P<0.0001)，强烈表明发生凋亡。
相反，与AG(Cis+AG；图9F)、SeNPs(Cis+SeNPs；图9G)、AG包被的SeNPs(Cis+AG包被的SeNPs；图9H)和AG+SeNPs(Cis+AG+SeNPs；图9I)共同给药显著降低了与Cis组相比的Caspase-3表达(P<0.0001)，表明具有保护作用。Cis+AG包被的SeNPs组表现出Caspase-3表达最显著的降低，表明具有优越的细胞保护功效。Cis+AG+SeNPs组的Caspase-3表达高于Cis+AG包被的SeNPs，但低于Cis组表达(P<0.0001)。
Caspase-3免疫反应性的定量分析结果，以百分比表示所有组，显示在图9J中。数据表明，与AG、SeNPs和AG包被的SeNPs的共同治疗减轻了Cis诱导的睾丸凋亡，AG包被的SeNPs表现出最显著的抗凋亡影响。
图10展示了对照和各种实验组中睾丸组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学表达。对照(图10A)、AG(图10B)、SeNPs(图10C)和AG包被的SeNPs(图10D)组表现出增强的PCNA表达，表明活跃的细胞增殖。
然而，Cis组(图10E)中的PCNA表达与对照相比显著降低(P<0.0001)，表明睾丸细胞增殖受损。另一方面，Cis+AG(图10F)、Cis+SeNPs(图10G)、Cis+AG包被的SeNPs(图10H)和Cis+AG+SeNPs(图10I)的组合与Cis组相比显著增强了PCNA表达(P<0.0001)，表明增殖活性显著增强。此外，Cis+AG包被的SeNPs(图10H)表现出所有治疗组中最高的PCNA表达。此外，Cis+AG+SeNPs(图10I)表现出显著的PCNA表达，超过Cis单独的表达，尽管仍低于Cis+AG包被的SeNPs的水平。
图10J展示了PCNA免疫反应性百分比的评估，表明AG、SeNPs和AG包被的SeNPs减轻了Cis诱导的细胞增殖抑制，AG包被的SeNPs表现出最明显的保护作用。
细胞色素C的流式细胞术分析
呈现的流式细胞仪图11：(A-J)展示了对照和其他实验组中细胞色素C释放表达百分比，表明线粒体凋亡参与。对照(图11A)、AG(图11B)、SeNPs(图11C)和AG包被的SeNPs(图11D)组分别表现出12.7%、18.7%、19.4%和35.4%的细胞色素C阳性细胞，确认了基线凋亡活性。而Cis组(图11E)与对照组相比表现出显著(P<0.0001)大量细胞色素C释放(81.5%)，表明其强效促凋亡活性。
另一方面，细胞色素C释放的百分比显著(P<0.0001 vs. Cis)降低，导致Cis+AG(图11F)和Cis+SeNPs(图11G)治疗对细胞色素C阳性细胞分别部分保护效果为54.5%和43.4%。此外，Cis+AG包被的SeNPs(图11H)进一步显著(P<0.0001 vs. Cis)将细胞色素C阳性细胞减少到27.4%，表明线粒体保护增强。此外，Cis+Se+AG组(图11I)表现出36.9%的细胞色素C释放，强化了联合抗氧化剂的保护作用，与Cis组相比显著降低(P<0.0001)。
对照和其他实验组中细胞色素C释放表达百分比(%)在图11J中测量。这些结果强调AG包被的SeNPs非常有效地拯救Cis诱导的凋亡，可能允许线粒体稳定。
通过彗星试验检测DNA损伤
彗星试验的结果(图12A-M)表明，对照(图12A)、AG(图12B)、SeNPs(图12C)和AG包被的SeNPs(图12D)组的DNA损伤证据很少，彗星尾部短，尾部DNA百分比低，表明没有明显的基因毒性。定量分析结果(图12K-M)确认尾长(图12K)、尾部DNA百分比(图12L)和尾矩(图12M)在这些组之间没有显著差异。
相反，与对照组相比，Cis组(图12E, F)中所有DNA损伤参数显著增加(P<0.0001)，证实了其基因毒性作用。而，AG(图12G)、SeNPs(图12H)、AG包被的SeNPs(图12I)或AG+SeNPs(图12J)共同治疗与Cis组相比显著降低了DNA损伤标志物(P<0.0001)，而，AG包被的SeNPs组具有最强的保护作用。定量分析结果：(图12K-M)，突出了AG包被的SeNPs对Cis诱导基因毒性的基因保护作用增强，可能是因为增强了抗氧化活性和细胞递送。
讨论
不育症是一个主要的全球健康问题，男性因素占实例的50%以上。化疗药物，特别是顺铂(Cis)的给药已被证明通过过量产生活性氧(ROS)不利地影响男性生育能力，导致氧化应激、线粒体功能障碍、DNA损伤、凋亡和精液质量受损。ROS和抗氧化防御失衡被解释为Cis引起的睾丸毒性的主要机制之一。
已经研究了具有抗氧化和抗炎特性的天然化合物，以减轻化疗引起的生殖损害。阿拉伯胶(AG)是一种已被证明具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用的试剂。有趣的是，纳米颗粒的特性是独特的，包括显著的特定表面积、高表面活性、众多表面活性中心、高催化和吸附能力以及低毒性。作为一种必需微量元素，硒(Se)是抗氧化防御系统中的重要元素。此外，它对人类和动物的生育能力、生长和免疫力至关重要。此外，硒纳米颗粒(SeNPs)因其生物活性高、毒性低以及与硒体相相比具有更大的生物利用度而日益受到关注。
AG包被在治疗顺铂(Cis)诱导的性腺毒性方面提供了协同的双重优势。主要多糖基质确保了结构稳定性，增强了靶向递送到睾丸组织所需的生物利用度。同时，次要植物化学成分，特别是鉴定出的萜烯和不饱和脂肪酸，以其固有的抗氧化和抗炎特性而闻名。这些次级代谢物可能与硒核心一起作用，淬灭Cis诱导的活性氧(ROS)并抑制脂质过氧化级联反应。这种多方面的防御机制保持了生精小管的完整性，维持了精子发生能力，正如在AG-SeNP治疗队列中观察到的精子计数和活力恢复所证明的。
本研究的发现表明，SeNPs、AG和AG包被的SeNPs通过对顺铂诱导的毒性进行一系列生化和分子侦探方法发挥了保护作用。结果显示出体重、氧化应激、炎症和纤维化反应、凋亡细胞活性和基因毒性效应的显著变化。顺铂治疗后体重和精囊相对重量的这些显著变化与先前观察到的证据一致，表明这些变化是由顺铂的系统细胞毒性活动引起的，导致体重减轻和包括睾丸在内的多系统组织损伤。
相反，SeNPs、AG和特别是AG包被的SeNPs的共同给药显著恢复了体重。这种保护作用与先前研究一致，表明AG减轻了抗癌药物如Cis的负面影响，特别是通过其强效抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎特性。此外，含有硒的物质在先前研究中已被记录可以减轻Cis产生的毒性，可能是由于其抗氧化能力，表明SeNPs对顺铂给药后体重和器官重量具有保护特性。
令人惊讶的是，尽管共同治疗组中体重和相对精囊重量显著恢复，但睾丸和附睾重量没有显著变化。这一发现与Oda等人2025年的结果相反，后者显示补充硒后生殖器官重量增加。这可能是由于剂量、治疗长度或实验设计的差异。然而，AG包被的SeNPs组报告了最大的增加，因为AG的稳定效应增加了SeNPs的生物利用度。
Cis给药导致过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性显著下降，丙二醛(MDA)水平大幅升高，证实了氧化应激的开始。这些发现与Zhang等人所示一致，他们证明Cis促进氧化应激，导致细胞损伤。AG、SeNPs特别是AG包被的SeNPs的治疗有效恢复了CAT和GPx活性，同时降低了MDA水平，表明其显著的抗氧化潜力。这一发现与我们最近的研究一致，表明SeNPs通过增强抗氧化防御来对抗Cis诱导的氧化损伤。在本研究中发现AG包被的SeNPs具有优越的保护作用，也可以参考先前的研究，该研究表明，用AG等抗氧化剂包被SeNPs可以提高SeNPs的生物利用度并协同其抗氧化作用。
TGF-β和IL-6在Cis组中的上调表明纤维化和炎症信号传导被刺激，这与先前研究的结果一致。另一方面，通过AG、SeNPs和AG包被的SeNPs的共同给药显著降低这些细胞因子表明这些试剂抑制炎症和纤维化的能力，补充了先前报道硒和抗氧化剂在稳定炎症反应中的作用的研究。
有趣的是，AG包被的SeNPs对TGF-β和IL-6的抑制作用最为明显，这可能归因于AG稳定SeNPs的能力，从而有助于增加保护能力和生物利用度。纤维化指标的结果通过Masson's三色染色得到证实，该染色用于评估睾丸组织中的胶原纤维沉积。Cis组具有大量蓝色染色的胶原纤维，特别是在睾丸囊中。其他研究也类似地显示了白膜和动脉壁中胶原沉积增加。这种增加可能归因于活性氧激活p38丝裂原活化蛋白激酶，然后启动TGF-b1介导的纤维化过程。相反，共同治疗组显著减少了这些纤维，而Cis+AG包被的SeNPs组显示出显著减少，表明强烈的抗纤维化反应。这一结果与先前研究一致。
通过流式细胞术观察到的强效抗炎反应，其特征是TNF-α表达显著降低，直接与AG-SeNP制剂的独特化学和结构特征相关。TNF-α是炎症级联的主调节因子；其过度产生通常导致下游组织损伤和凋亡。AG包被的SeNP组中该细胞因子的显著减少表明，包被不仅提高了硒核心的稳定性，而且增强了其与免疫信号通路交互的能力。
虽然Cisplatin诱导的系统毒性是通过细胞因子风暴和促炎标记物上调介导的，但AG包被的SeNPs有效抑制了这种反应。这种功效可能是硒核心元素和生物活性植物化学物质(特别是我们在GC-MS分析中鉴定出的萜烯和不饱和脂肪酸)之间协同作用的直接结果。萜烯已被广泛记录通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，从而减少TNF-α等促炎细胞因子的产生。此外，与物理混合物(Cis+AG+SeNPs)相比，纳米共轭物的优越性能突显了纳米制剂在实现最佳生物利用度方面的重要性。通过在AG基质中稳定硒核心，该制剂确保将抗氧化硒和抗炎次级代谢物同时递送到细胞环境。这种局部递送可能比单独的成分更有效地淬灭炎症的氧化触发因素，从而保护睾丸组织免受继发性炎症损伤，并保持生殖系统整体完整性。
使用H&E染色的组织病理学分析进一步证实了Cis组中严重的睾丸损伤，其特征是正常睾丸结构扭曲、生精小管周围间质空间明显扩大以及明显的血管充血。这些发现与先前研究一致。血管充血被认为是Cis诱导炎症的指标，与核因子κB的激活增加有关。扩大的间质空间表明间质水肿，可能源于Cis诱导的内皮损伤，引发毛细血管扩张，随后是内皮损伤和液体泄漏。
此外，Cis还被报道诱导过量的一氧化氮合成，导致血管舒张和低血压，最终导致器官灌注减少和水肿。该组中的生精小管狭窄且不规则，基底膜扭曲，生殖上皮部分或完全退化。Leydig细胞中可见核固缩。这些发现与先前研究一致。AG包被的纳米制剂的卓越功效可能源于硒的抗氧化特性和阿拉伯胶的稳定、生物相容性之间的协同相互作用。通过提高SeNPs的生物利用度，AG包被可能促进更有效地中和Cis诱导的睾丸组织中的活性氧(ROS)。这种保护对维持线粒体功能(如活力恢复所示)和防止导致形态缺陷的DNA损伤至关重要。AG包被的纳米颗粒与物理混合物之间的显著差异突显了纳米共轭过程在实现预防化疗诱导不育的最佳治疗指数方面的重要性。
相反，AG、SeNPs和AG包被的SeNPs的给药导致睾丸组织学的可观察改善，AG包被的SeNPs中组织恢复水平最高。这些发现与先前的研究人员一致，表明硒相关疗法改善组织愈合并提供针对Cis诱导睾丸损伤的保护。
Caspase-3(凋亡活性的指标)在Cis组中表现出显著升高，证实了Cis的促凋亡影响。然而，其表达在与AG、SeNPs和AG包被的SeNPs共同治疗的组中可忽略不计，因此确认了它们的抗凋亡作用。这一观察与先前研究一致，表明硒化合物可以减轻多种器官中的凋亡。
先前研究表明，SeNPs通过阻断Cis触发的caspase依赖性凋亡来减轻氧化应激，主要是通过减少ROS的过度产生，并通过提高睾丸组织中抗氧化金属硫蛋白-1的水平。AG包被的SeNPs组表现出Caspase-3表达最显著的降低，突显了其优越的细胞保护功效，归因于AG稳定SeNPs并增强其生物利用度的能力。有趣的是，AG-SeNP对照组中观察到的细胞色素C基线升高与Caspase-3激活或组织学损伤无关。在睾丸的独特生理环境中，这种分子谱可能表明增强的线粒体生物发生和氧化磷酸化能力。鉴于精子发生的显著能量需求，这种AG-SeNP诱导的线粒体"启动"似乎支持观察到的精细胞成熟和结构完整性的增加，突显了硒和阿拉伯胶在纳米制剂中对精子线粒体鞘的双重作用，作为代谢增强剂和结构成分。
PCNA(增殖细胞核抗原)的免疫组织化学检查显示Cis组中PCNA显著减少，归因于Cis诱导的毒性导致睾丸中细胞增殖受损。这一发现与其他研究表明Cis通过产生氧化应激和DNA损伤破坏精子发生一致。相反，AG、SeNPs特别是AG包被的SeNPs的共同给药导致PCNA表达的明显恢复，表明增殖能力增强。AG包被的SeNPs组表现出最明显的增强，接近对照组水平，可能归因于AG和硒的抗氧化和保护特性以及增强的细胞吸收的协同作用。
彗星试验显示Cis组中存在显著的DNA损伤，但与AG、SeNPs和AG包被的SeNPs的共同治疗显著减少了DNA损伤，特别是在AG包被的SeNPs组中。这支持了AG包被的SeNPs具有优越的DNA保护特性的概念，可能是由于其增强的抗氧化和抗凋亡作用。结果与先前研究表明硒对预防Cis诱导的基因毒性有效一致。最后，值得注意的是本研究中使用的实验模型的转化背景。临床顺铂治疗通常涉及累积、多周期给药，而本研究采用单一急性腹腔注射(5 mg/kg)。这种急性模型是一种广泛验证的方法，旨在诱导严重、可重复的氧化应激和生殖细胞耗竭，同时将啮齿动物的系统致死率降至最低。此外，45天的伤害后治疗持续时间特别设计为跨越Wistar大鼠中一个完整的精子发生周期(≈48至52天)。这允许对AG-SeNP介导的保护作用在生殖细胞发育和成熟的各个阶段进行全面评估。虽然这种急性损伤模型提供了重要的机制概念验证，但未来使用慢性、分级顺铂给药模型的研究将有助于进一步验证AG-SeNPs在预防累积化疗诱导的不育方面的长期临床适用性。
数据表明，SeNPs直接用AG包被可以增强其减轻顺铂诱导睾丸损伤的功效。这种保护可能优于增强的生物利用度和协同抗氧化作用。因此，与单独给药AG和SeNPs或作为简单混合物相比，AG包被的SeNPs对顺铂诱导的睾丸损伤表现出更明显的保护作用。
结论
本研究表明，用阿拉伯胶(AG-SeNPs)物理包被的硒纳米颗粒提供比未包被的SeNPs或简单混合物更好的保护，以抵抗顺铂诱导的睾丸毒性。主要新意在于AG包被的协同双重作用，同时确保结构稳定性以增强生物利用度，并提供固有的抗氧化特性以减轻局部组织损伤。虽然AG-SeNPs作为铂基化疗期间的生育保护辅助疗法显示出相当大的前景，但将这种配方推进到临床应用需要特定的后续措施。未来研究必须优先考虑针对性的体外机制研究以阐明精确的细胞内途径、全面的药代动力学分析以追踪体内生物分布和清除，以及严格的剂量优化以建立长期生殖安全性和理想的治疗窗口。
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