TDP-43（AR DNA结合蛋白34 kDa）病理学与家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关。几乎所有ALS病例中都存在细胞质TDP-43聚集物，TDP-43突变导致这种致命的神经退行性疾病。rNLS8模型是一种双重转基因模型，其中人类TDP-43表达受多西环素（Dox）抑制，并具有有缺陷的核定位信号。本研究旨在将疾病表型与之前报道的模型特征进行比较（Walker等人，Acta Neuropathol 130, 2015）。
方法
动物
所有动物实验均遵循欧盟指令2010/63，并获得国家项目授权委员会的批准。缺乏_tetO-hTDP-43- ΔNLS_转基因的小鼠（tTA，6雌+6雄）与半合子rNLS8双转基因小鼠（rNLS8，6雌+10雄；JAX ID: 028412）进行了比较。IHC分析在一个单独的队列中进行，包括rNLS8（6雌+5雄）和tTA（4雌+3雄）。从出生到疾病诱导期间，动物被喂食含有多西环素的食物（200 mg/kg，Envigo）。
指标
- 临床评分和体重每周测量三次（图1）。
- 通过倒置铁丝笼顶部的网格，测量动物掉落所需的时间（最大180秒）。如果未达到180秒，则允许最多三次试验，选择最佳尝试进行分析。
- 动物先在4 RPM下训练五分钟，一小时后，动物接受三个连续加速试验（0至40 RPM，360秒内；试验间隔30分钟）。
- 使用Quanterix SimoaTM NF-Light V2 Advantage试剂盒（#104073）单次测定CSF中的NfL。
- 通过抗VAChT和抗Syp抗体及AF594标记的α-银环蛇毒素染色腓肠肌冷冻切片，分析神经肌肉接头（NMJ）。调查不重叠和部分重叠的前突触和后突触成分。
- 对腰椎脊髓的FFPE切片进行染色，以识别总TDP-43（人和小鼠）和磷酸化TDP-43（Ser409/410）。使用Visiopharm®系统进行图像分析。
图1. 本研究的设计和临床评分标准。临床评分时，动物被提起尾巴以监测后肢抓握，随后固定以监测震颤。图片来源：Charles River Laboratories.
结果
临床评分和体重
在rNLS8小鼠中，停用多西环素七天后开始出现后腿无力（图2A）。第22天，所有rNLS8小鼠表现出完全的后肢抓握（评分为2）。停用多西环素两周后，rNLS8小鼠开始体重下降（图2B）。10只rNLS8雄性中有5只因体重减轻超过25%而提前达到研究终点。研究随访期间，仅有一只雌性小鼠和没有tTA对照组达到HEP标准。
图2. 随时间变化的虚弱症状和体重。A）每周三次评估的临床评分，* p < 0.05（多次Mann-Whitney U检验）。B）每周三次测量的体重。平均值±标准误差。* p < 0.05（混合效应ANOVA，Fisher's LSD）。tTA，n=6雌+6雄；rNLS8，n=6雌+10雄。红线表示停用多西环素饮食的时间。图片来源：Charles River Laboratories.
图3. 基线时、停用多西环素后2周和4周的铁丝悬挂时间和转棒性能。平均值±标准误差。** p < 0.01，**** p < 0.0001（混合效应ANOVA，Fisher's LSD）。转棒：tTA，n=6雌+6雄，rNLS8，n=6雌+10雄。铁丝悬挂：tTA，n=6雌+6雄，rNLS8，n=6雌+10雄。图片来源：Charles River Laboratories.
NfL
CSF样本在停用多西环素四周后或在人道终点时收集，NfL水平表明rNLS8动物存在严重的轴突损伤和神经退行性病变（图4）。
图4. CSF中的NfL水平。平均值±标准误差。**** p < 0.0001，Welch's t检验。tTA，n=5雌+6雄，rNLS8，n=6雌+10雄。图片来源：Charles River Laboratories.
NMJ分析
rNLS8小鼠中NMJ明显解体，与tTA对照组中完全完整的NMJ相比，部分或完全重叠的前突触和后突触成分显著减少（图5）。tTA对照组中不重叠的前突触和后突触染色百分比为3.0%，而rNLS8动物中为40.7%。
图5. A）腓肠肌中运动终板（AChRs）的支配和去支配比例。tTA，n=6雌+6雄，rNLS8，n=6雌+10雄。平均值±标准误差。**** p < 0.0001，Welch's t检验。B）IHC示例图像。tTA示例中所有可见的NMJ都有完全重叠的前突触和后突触成分，而在rNLS8示例中可以看到完全（c）、部分（p）和不重叠/去支配（n）的NMJ。图片来源：Charles River Laboratories.
TPD-43病理学
rNLS8动物的脊髓中，总TDP-43染色强度显著增加。TDP-43在细胞核中的水平远低于细胞质（图6A和6B），表明该蛋白的错位。观察到蛋白质的磷酸化增强（图6C和6D）。
图6. A）腰椎脊髓中总TDP-43 IHC染色作为核与细胞质强度比。平均值±标准误差。tTA，n=3雌+2雄，rNLS8，n=2雌+3雄。**** p < 0.0001，Welch's t检验。B）tTA和rNLS8小鼠的总TPD-43 IHC示例图像。C）腰椎脊髓中pTDP-43染色强度。** p < 0.01，Welch's t检验。D）tTA和rNLS8小鼠的pTDP-43 IHC示例图像。图片来源：Charles River Laboratories.
总结
所有rNLS8小鼠都表现出无力、体重减轻和运动协调能力差。CSF样本中的NfL检测证实了广泛的神经元损伤。腓肠肌中发现了神经肌肉接头的去支配。TDP-43病理学表现为细胞质中TDP-43的积累和磷酸化的增强。此小鼠模型中研究的所有症状和病理特征也在ALS患者中发现，证明了该模型在ALS药物发现中的应用价值。
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