摘要
益生元、益生菌以及两者的组合（合生元）干预措施在不同个体间往往表现出不同的效果，这是由引入的生物制剂、内源性微生物群和宿主饮食之间复杂的相互作用所驱动的。预测益生菌和益生元疗法在个体层面的成功或失败仍然是一个重大挑战。在此，我们利用微生物群落规模代谢模型（MCMMs）来预测益生菌定植以及对益生菌和益生元干预的微生物群介导的短链脂肪酸（SCFA）产生情况。
使用来自两项人体临床试验队列的数据，分别测试旨在改善代谢健康的五株益生菌与益生元菊粉的组合，以及旨在治疗复发性艰难梭菌感染的八株益生菌，我们发现MCMM预测的定植情况与测量结果基本一致，准确率达到75%-80%。不同分类群的定植概率各不相同。MCMMs捕捉到了治疗驱动的预测SCFA产量变化，在第一个试验中，模型预测的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）生长率越高，与葡萄糖曲线下面积（AUC）呈负相关，为理解治疗效果背后的机制提供了线索。
将这些模型扩展到接受健康饮食和生活方式干预的第三个人群队列，揭示了对增加膳食纤维的预测反应存在显著的个体间差异，这些差异与基线至随访期间心血管代谢健康标志物的变化显著相关。最后，我们的模拟结果表明，个性化的益生元选择可能会进一步增强益生菌的效果。这些发现共同证明了代谢模型在指导个性化微生物组介导干预方面的潜力。
引言
人类结肠微生物群在调节宿主生理和免疫方面发挥着关键作用。研究表明，益生菌、益生元以及合生元（即益生元和益生菌的组合）的使用可以影响内源性微生物群的代谢输出，抑制病原体定植，并增强黏膜屏障完整性。新兴证据表明，合生元干预甚至可能通过肠脑轴影响大脑功能。
尽管这些发现很有前景，益生菌、益生元和合生元干预的效果在不同个体间差异很大，这对它们的广泛应用构成了重大挑战。益生菌菌株的定植——即施用的微生物在肠道生态系统中生长和持续的能力——取决于多种因素，包括合适代谢生态位的可用性、与内源性微生物群的竞争和协作相互作用，以及与宿主免疫系统的相互作用。除共生微生物群的组成外，总共生生物量、接种压力（即益生菌剂量）、可用益生元底物和宿主饮食等因素之间的相互作用也会影响定植。
为了合理预测不同个体和饮食背景下的益生菌定植和益生元效果，我们需要整合这种复杂性的方法。
基因组规模代谢模型（GEMs）提供了一个强大的机制框架，用于估算微生物生长和代谢。约束基础建模的最新进展已将这种方法扩展到多样化的微生物群落，产生了微生物群落规模代谢模型（MCMMs）。通过将数百种肠道细菌分类群的基因组规模代谢重建与通量平衡分析相结合，MCMMs能够预测微生物-微生物相互作用、资源竞争和生态系统规模的代谢行为。这些模型在估计微生物生长率、短链脂肪酸（SCFA）产生、甲烷产生以及对疾病状态或饮食干预的代谢变化方面已显示出预测准确性。值得注意的是，先前的工作表明，MCMMs可以捕捉机会性病原体（如艰难梭菌）的定植潜力，这表明类似的方法可用于模拟个体宿主中的益生菌定植。
为了验证这种方法，我们旨在使用MCMMs基于两项人体干预试验的数据来预测益生菌物种的富集。首先，我们利用了Perradeau及其同事（验证研究A）进行的一项研究的数据。在这项双盲、安慰剂对照试验中，先前被诊断为2型糖尿病的参与者接受了12周的治疗，分别接受安慰剂或两种多菌株合生元鸡尾酒（WBF-010和WBF-011）中的一种。WBF-010包含婴儿双歧杆菌、贝氏梭菌和丁酸梭菌，补充了低剂量菊粉（0.3g），这是一种已知支持益生菌生长的益生元纤维。WBF-011包含与WBF-010相同的益生元和益生菌成分，但额外添加了两种益生菌菌株：嗜黏蛋白阿克曼菌和霍氏厌氧杆菌。与安慰剂组相比，接受WBF-011合生元的参与者在第0周至第12周期间，标准葡萄糖耐量测试中的葡萄糖曲线下面积（AUC）显著降低，表明对血糖控制有有益的群体水平效果。对于此分析，仅使用了WBF-011治疗组参与者的资料，因为WBF-010在主要结果变量上没有显示出显著的临床效果。
在第二项研究（验证研究B）中，Dsouza及其同事为参与者提供了8株益生菌鸡尾酒（VE303），旨在治疗复发性艰难梭菌感染。VE303包含博氏肠梭菌、人源厌氧棍状菌、肠道西蒙斯氏菌、共生梭菌、布劳特氏菌sp001304935、长链多瑞氏菌、无辜长链菌和普氏黄杆菌，尽管由于AGORA数据库中缺乏可用的GEMs，布劳特氏菌sp001304935和无辜长链菌在当前分析中被省略。
使用宏基因组测序数据、定量PCR（qPCR）以及免疫和代谢分析，我们评估了MCMMs准确预测益生菌定植以及对宿主代谢和免疫功能后续影响的能力。具体而言，我们评估了MCMM衍生的预测与观察到的微生物组成和临床标志物变化的吻合程度。最后，我们将MCMM模拟扩展到接受健康饮食和生活方式干预的一般健康个体横断面队列（Arivale队列），他们增加了运动和膳食纤维摄入量。从标准欧洲饮食切换到高纤维饮食后，MCMM预测的丁酸盐产量增加与该干预队列中纵向变化的心血管代谢健康标志物显著相关。使用Arivale队列的子集，我们探索了优化以增加丁酸盐或丙酸盐产量的个性化益生元、饮食和益生菌干预。这些结果共同突显了一个有前景的计算平台，用于为人类队列设计个性化的益生元、益生菌和合生元干预。
结果
验证研究A：qPCR显示治疗组中益生菌种类的富集
使用qPCR确定了目标微生物种类的丰度。嗜黏蛋白阿克曼菌和婴儿双歧杆菌在大多数参与者中从第0周到第12周表现出显著富集。相比之下，贝氏梭菌、霍氏厌氧杆菌和丁酸梭菌没有表现出类似的富集。这些趋势表明大多数接受治疗的个体中嗜黏蛋白阿克曼菌和婴儿双歧杆菌的短期定植。基于qPCR扩增阈值定义了二元化定植评分。
验证研究A：MCMMs预测物种水平富集
从基线分类分配（N = 21）构建模型，以评估MCMMs是否能预测qPCR结果中观察到的定植模式。对于每个个体，模拟添加5种益生菌的模型用于预测第12周qPCR数据中观察到的定植模式。
在所有比较中（21个样本中的5个预测，总计N = 105），模型预测生长和二元化富集评分显示出84.7%的一致性（Cohen's κ = 0.68，表示实质性一致）。贝氏梭菌被正确预测为所有21名参与者均不生长，嗜黏蛋白阿克曼菌被正确预测为所有21名参与者均生长。婴儿双歧杆菌的准确率最低，在21个案例中有8个预测错误。总体而言，预测和观察之间存在显著的一致性。在所有菌株中，58个生长实例被正确预测，31个非生长实例被正确预测，3个案例被错误预测为生长，13个案例被错误预测为非生长。
微生物短链脂肪酸生产的预测
为了评估益生菌给药的预测功能影响，我们分析了模型预测的丁酸盐和丙酸盐产量，这两种关键的SCFA具有明确的促进代谢健康、抗炎和增强肠道屏障的特性。先前的工作已经证明了基于MCMM的预测在人类肠道微生物组中SCFA生产方面的准确性，这为采用这种方法评估WBF-011的益生菌和益生元成分的机械贡献提供了强有力的依据。
为了系统地剖析益生菌和益生元干预对SCFA生产的影响，我们比较了基线条件和合生元条件之间的丙酸盐和丁酸盐生产。由于原始研究使用了最小益生元剂量（0.3克菊粉），我们还模拟了添加更大益生元剂量（30克菊粉）的情况。模拟后，比较了不同条件下总的MCMM预测丁酸盐和丙酸盐生产率。
正如预期，无治疗组表现出相对较低水平的丁酸盐生产。添加益生菌鸡尾酒与最小益生元并未显著增加群落产生的丁酸盐水平。在模拟的合生元干预中添加更大剂量的菊粉，观察到显著增加。
丙酸盐也观察到类似的结果。无治疗组和益生菌+最小益生元组显示出低水平的丙酸盐生产。更高剂量的益生元组合显著增加了丙酸盐的生产。
葡萄糖AUC与预测的嗜黏蛋白阿克曼菌生长率相关
在Perraudeau及其同事的研究中，葡萄糖AUC是一个主要的代谢终点。在接收WBF-011的参与者和接收安慰剂的参与者之间，观察到从第0周到第12周葡萄糖AUC变化（ΔglucoseAUC）的显著差异。这种效果在WBF-010配方中未观察到，该配方缺少嗜黏蛋白阿克曼菌和霍氏厌氧杆菌。结合上述WBF-011诱导的MCMM预测丁酸盐或丙酸盐生产变化不显著以及霍氏厌氧杆菌预测定植普遍较低的情况，我们假设嗜黏蛋白阿克曼菌生长率可能与临床反应性相关。确实，MCMM预测的嗜黏蛋白阿克曼菌生长率在WBF-011组中显著高于安慰剂组。此外，我们发现ΔglucoseAUC在WBF-011治疗组内与嗜黏蛋白阿克曼菌的预测生长率显著负相关。
MCMM预测将膳食纤维反应与临床健康标志物联系起来
为了评估MCMM预测的益生元和益生菌反应性SCFA是否与宿主健康变化相关，我们对来自前精准健康项目（Arivale队列）的1,786名参与者的微生物组样本进行了建模，这些样本具有配对的16S扩增子测序数据、基于血液的临床化学数据和纵向随访数据。Arivale参与者被指导增加运动量和增加水果和蔬菜摄入量。每个样本在两种饮食条件下进行模拟：低纤维标准欧洲饮食（即大致代表基线、干预前饮食）和富含抗性淀粉的高纤维饮食（即大致代表干预后饮食）。在参与者中，模拟预测从低纤维到高纤维干预的转变会导致丁酸盐生产出现异质性增加。回归分析显示，丁酸盐预测增加量（Δbutyrate）较大与多个心血管代谢标志物的改善显著相关，包括较低的LP-IR、空腹胰岛素和HOMA-IR。在Δbutyrate与免疫激活标志物（如总白细胞计数、中性粒细胞和淋巴细胞）之间也观察到负相关。
MCMM优化的益生元和益生菌干预旨在改善个性化益生菌定植和SCFA生产
为了评估我们MCMM方法的潜在能力，我们将参与者特定的模拟应用于具有可用粪便宏基因组测序数据的Arivale子队列（N = 156），与16S扩增子数据相比，这些数据通常为MCMMs提供略为准确的约束。
在Arivale子队列的背景下，模拟了包括验证研究A中的WBF-011菌株与八种不同益生元和饮食背景的干预：（1）无益生元补充的标准欧洲饮食，（2）补充菊粉的标准欧洲饮食，（3）补充果胶的标准欧洲饮食，（4）补充抗性淀粉的标准欧洲饮食，（5）补充麦芽糊精的标准欧洲饮食，（6）补充洋车前子壳的标准欧洲饮食，（7）补充大麻籽的标准欧洲饮食，以及（8）标准高纤维饮食。添加验证研究A中的益生菌群落在除无益生元和大麻籽背景外的每种情况下都显示出预测丁酸盐的显著减少。类似地，当添加益生菌鸡尾酒时，预测的丙酸盐生产显著减少，除了在无益生元或大麻籽背景下，没有观察到显著差异。
对于每个个体，在标准欧洲饮食上确定了最大化预测丁酸盐或丙酸盐生产率的最佳益生元-益生菌组合。虽然出现了一些模式，但最佳干预在个体间有所不同。对于丁酸盐和丙酸盐生产，无益生菌鸡尾酒的洋车前子壳是最常见的最佳干预。然而，许多个体显示合生元组合是他们的最佳干预。总体而言，与原始WBF-011试验中使用的"标准护理"合生元治疗（即结合菊粉和五株益生菌鸡尾酒）相比，个性化最佳解决方案显示出显著更高的预测丙酸盐和丁酸盐生产水平。
讨论
口服益生菌成功在肠道中定植的能力受到多种生态和宿主特异性因素的影响，包括肠道微生物组的现有组成和背景饮食。在特定微生物群和饮食背景下，合理预测益生菌定植和与健康相关的微生物代谢物生产的方法，将为精准益生元、益生菌和合生元设计开辟新途径。我们团队先前的工作已经证明，我们的MCMM平台可以用于预测个性化的SCFA生产率和个性化的病原菌定植风险。为了在合生元设计的背景下验证我们的MCMM方法，我们使用验证研究A和B的现有数据来确定我们是否可以回溯预测相关结果。两项研究都显示益生菌生物体的定植率不同，以及不同的临床反应。鉴于这种异质性，这些试验数据代表了我们MCMM预测的理想测试案例。
评估经验定植——通过qPCR或宏基因组学测量治疗后益生菌分类群的相对富集，并将这些与MCMM预测进行比较——具有挑战性。内源性相同物种的菌株的存在使得从宏基因组数据中检测益生菌菌株变得困难。益生菌分类群的物种水平富集很难与已经存在的相关菌株丰度的增加区分开来。在验证研究A中，菌株特异性qPCR引物通常未检测到基线，因此将治疗后超过物种特异性阈值的检测归因于施用的菌株。在验证研究B中，由于基线宏基因组包含相同物种的内源性菌株，定植由两倍标准定义：超过全局阈值的检测和相对于个体基线的增加。尽管这些指标不能证明长期定植，但它们为施用的益生菌物种的短期富集/生长提供了粗略的替代。
尽管预测益生菌生长具有固有的复杂性，基于MCMM的框架显示出相当高的准确性，在验证研究A中与经验性益生菌定植指标的协议超过84%（图2A），在验证研究B中超过75%（图2C）。这些模型结合了关键的生态决定因素，如内源性微生物组组成和益生元及饮食底物的可用性，以估计益生菌生长率。值得注意的是，尽管我们缺乏饮食摄入的个性化约束（即标准欧洲饮食应用于每个模型），但定植预测的高水平准确性仍然得以实现。同样值得注意的是模型失败的情况——例如，B. infantis和D. longicatena分别在验证研究A和验证研究B中预测不佳。这可能是由于这些预测不佳的分类群的GEMs中未注释的途径，或模型中应用的in silico饮食约束与研究参与者实际消费模式之间的不匹配所致。
益生菌和益生元补充的一个基本目标是调节支持宿主健康的关键微生物代谢物的产生。其中，SCFA——如丁酸盐和丙酸盐——由于其在维持肠道屏障完整性、调节适当免疫功能和支持代谢稳态方面的作用而特别重要。合生元给药提供了一种增强SCFA生产的方法，可以利用MCMMs来预测这些代谢变化。值得注意的是，我们的分析揭示了益生元给药和WBF-011益生菌鸡尾酒之间的协同效应。仅与少量菊粉配对的益生菌鸡尾酒对丁酸盐和丙酸盐生产的影响最小。然而，增加菊粉补充量导致丁酸盐和丙酸盐生产的显著增加。
鉴于对益生菌定植的准确预测，我们试图确定益生菌给药与初始研究主要结果之间的关联。Perraudeau及其同事报告称，在WBF-011治疗组中，12周试验期间餐后葡萄糖AUC显著降低，但在安慰剂或WBF-010组中没有。WBF-011和WBF-010之间的主要区别是包含两种额外菌株：嗜黏蛋白阿克曼菌和霍氏厌氧杆菌。虽然霍氏厌氧杆菌很少被预测生长，但嗜黏蛋白阿克曼菌在接收WBF-011的大多数个体中被一致预测为生长。我们假设嗜黏蛋白阿克曼菌生长可能与葡萄糖AUC变化相关。与此假设一致，MCMM预测的嗜黏蛋白阿克曼菌生长率与WBF-011和安慰剂组以及WBF-011组内的ΔglucoseAUC呈负相关。这些发现支持嗜黏蛋白阿克曼菌生长和代谢活性可能对WBF-011接收者观察到的临床反应有实质性贡献的观点。未来整合纵向宏基因组和宿主反应数据的干预研究可能有助于建立嗜黏蛋白阿克曼菌生长、微生物代谢和宿主结果之间更直接的机制联系。
在两项益生菌干预研究中观察到的预测生长与经验估计定植之间的强烈一致性基础上，我们将MCMM模拟应用于从Arivale（N = 1,786）招募的更大队列的一般健康参与者，他们被指导改善饮食和生活方式。使用从该数据集构建的MCMMs，我们模拟了从低纤维到高纤维饮食的转变，并比较了预测丁酸盐（Δbutyrate）的变化如何与心血管代谢标志物（LP-IR、胰岛素、HOMA-IR）和免疫激活标志物（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数）的纵向变化相关联。Arivale参与者通常被引导朝向更高纤维、产生丁酸盐的饮食，这些发现突显了基于MCMM的方法预测个性化微生物组介导的饮食干预反应的潜力。
微生物丁酸盐和丙酸盐的产生在益生元补充和转向标准高纤维饮食后增加。有趣的是，添加WBF-011益生菌鸡尾酒通常导致丁酸盐和丙酸盐生产减少，这部分可由乳酸和乙酸的同时增加来解释。尽管该鸡尾酒被设计为产生丁酸盐，但丁酸盐生产者霍氏厌氧杆菌、贝氏梭菌和丁酸梭菌观察到的有限生长与这一结果一致。然而，个体特定建模允许识别每个样本在SCFA生产方面的最有效治疗。反应因人而异，并非所有受试者从相同的益生元纤维中受益相同，一些个体在WBF-011存在下显示出更高的丁酸盐生产，尽管个体间的平均趋势为负。这突显了MCMMs作为个性化益生元和益生菌组合工具的潜力。
MCMMs有几个固有的局限性。其中最主要的是MCMMs依赖于简化稳态假设，限制了它们完全捕捉肠道微生物群落时间动态的能力。此外，MCMM框架依赖于样本中所有分类群的准确GEMs的可用性，现有GEMs中缺失的注释或反应可能导致不准确的预测。现有的GEM数据库不包括给定肠道细菌物种的所有现存菌株。其结果是，受现实世界肠道微生物组样本约束的MCMM分析通常仅限于物种水平分辨率，使用总结给定物种内所有可用菌株代谢能力的模型。
总之，这些发现展示了MCMMs作为评估益生元、益生菌和饮食干预在个体和群体水平上的预测框架的效用。通过将代谢建模与实验验证相结合，我们突显了益生菌定植成功和SCFA生产的关键生态和代谢决定因素，为更针对性的基于微生物组的疗法提供了途径。然而，这些方法仍在发展，需要在前瞻性人体试验中进一步验证。实现这些模型的全部潜力将需要持续改进，包括改进的菌株水平分辨率、个性化的饮食摄入约束，以及增强的宿主-微生物组相互作用建模。未来研究应通过整合多组学方法、纵向采样和个性化饮食分析来弥合这些差距。最终，在临床环境中利用MCMMs可以实现精准微生物组治疗，优化益生菌、益生元和饮食摄入，更有效地治疗各种急性和慢性疾病。
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