冻干粪菌微生物群产品的体外验证概念：以细菌活力为核心
研究背景与意义
艰难梭菌（Clostridioides difficile，C. difficile）感染是医疗相关腹泻的主要原因。尽管万古霉素等抗生素对首次感染有效，但约15-20%的患者会经历复发。粪菌移植（FMT）通过恢复肠道微生物群多样性和功能，被推荐作为复发性C. difficile感染（rCDI）的二次预防措施。目前FMT产品主要采用新鲜或冷冻悬浮液形式，通过结肠镜、鼻空肠管或口服胶囊给药。冻干粪菌（LFM）作为冷冻产品的替代方案，理论上具有更长保质期和便于储存运输的优势，但其制备工艺对细菌活力的影响尚未完全明确。
研究方法
样本处理与分析
研究团队从德国科隆微生物库筛选8名健康供体（补充材料表S1），每份粪便样本处理如下：
- 新鲜未处理组（5g未处理粪便）
- 新鲜处理组（112g粪便用0.9% NaCl均质化后离心去除残渣）
- 冷冻组（添加10%甘油后冷冻保存）
- 冻干组（添加5%海藻糖二水化合物后冻干）
采用QUANTOM Tx™微生物计数仪进行总细菌和活菌计数，并通过16S rRNA基因扩增子测序、胆汁酸检测（使用AbsoluteIDQ® Bile Acids试剂盒）及卡尔费休滴定法测定残留水分。
冻干工艺优化
在德国Osterode am Harz的Martin Christ公司进行初步冻干实验后，优化参数如下：
- 初级干燥：35小时（温度-23°C，真空0.180mbar）
- 次级干燥：2小时（温度+20°C，真空0.05mbar）
研究结果
细菌活力分析
- 新鲜未处理粪便的总细菌浓度为5.02×10¹¹ cells/g，活力为3.5×10¹¹ cells/g
- 经处理的新鲜悬浮液活力降至6.07×10¹⁰ cells/g（回收率17.33%）
- 冻干产品（第3天）活力为4.62×10¹⁰ cells/g，与冷冻组（p=0.15）和新鲜处理组（p=0.07）无显著差异
- 冻干产品在4°C储存90天后活力保持在约55%，显著优于冷冻产品在-80°C储存1个月的69%
胆汁酸变化
- 未处理粪便的总胆汁酸浓度达254,472 pmol/g，显著高于冻干产品（10,601 pmol/g）和含甘油冷冻悬浮液（12,394 pmol/g）
- 脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）作为主要胆汁酸，在冻干后浓度显著下降（p=0.037）
- 初级胆汁酸经冷冻和冻干处理后浓度差异不显著（Friedman检验，p<0.0001）
微生物群落稳定性
通过16S rRNA测序分析发现：
- α多样性（Shannon指数）在不同处理组间无显著差异（p=0.52）
- β多样性（Bray-Curtis距离）主要受供体个体差异影响（PERMANOVA：r²=0.92，p=0.001）
- 冻干对14个主要菌群的丰度无显著影响
产品制备与性能
- 每50g粪便经冻干可获得2.48±0.38g粉末
- 封装为羟丙基甲基纤维素胶囊（0号，DRcaps®），每颗含0.2g粉末
- 标准粪便捐赠（50g）可制备12.4±2颗胶囊（10.5-14颗），每颗含1.86×10¹¹活菌
- 胶囊储存成本显著低于冷冻产品（-80°C vs 4°C）
研究结论
本研究建立了冻干粪菌产品（LFM）的全面体外验证方案，结果显示：
- 冻干工艺对细菌活力和16S rRNA基因谱无显著影响
- 胆汁酸浓度在冻干过程中下降约20倍，但次级胆汁酸LCA和DCA仍为主要成分
- 冻干胶囊所需数量较冷冻产品减少67%（10.5-14颗 vs 30颗）
- 次级干燥步骤未对细菌活力产生负面影响
研究建议在GMP标准下将次级干燥纳入冻干工艺，并指出后续需延长随访时间（1-2年）以评估长期稳定性。该成果为开发标准化、低成本的FMT口服制剂提供了关键数据支持。
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