研究文章
免疫学
IL-7/IL-15/IL-21细胞因子融合支架生成高度功能性且富集长寿T记忆干细胞的CAR T细胞
摘要
嵌合抗原受体T细胞的功能持久性受到传统制造方法的限制，后者使用抗CD3/CD28刺激，导致终末分化和寿命较短的CAR T细胞。我们证明了HCW9206，一种独特的连接白细胞介素-7、IL-15/IL-15受体α复合物和IL-21的蛋白质支架，可以在无需抗CD3/CD28激活的情况下生成CAR T细胞。这些细胞高度富集长寿的T记忆干细胞（T_SCM细胞）（>50%），并在不同的疾病模型（HIV-1或B细胞白血病）中展现出强大的活性。在一个人类化小鼠HIV感染模型中，HCW9206生成的抗HIV duoCAR T细胞比抗CD3/CD28生成的抗HIV duoCAR T细胞更有效地抑制了病毒血症。在一个异种移植白血病小鼠模型中，HCW9206生成的抗CD19 CAR T细胞展现出回忆性增殖反应并完全清除了白血病再挑战，而抗CD3/CD28生成的细胞则未能做到。HCW9206作为首个此类基于细胞因子支架的平台，通过生成既高度功能化又显著富集长寿T_SCM细胞的CAR T细胞群体，能够生产出更有效的基于CAR T细胞的免疫疗法。该策略广泛适用于提高CAR T细胞的持久性和功能性，从而增强其治疗传染病和癌症的疗效。
引言
嵌合抗原受体T细胞疗法已彻底改变了癌症免疫治疗领域，美国食品药品监督管理局批准了五种CAR T细胞疗法用于治疗白血病、淋巴瘤和近期的多发性骨髓瘤。CAR T细胞疗法已超越癌症治疗，扩展到慢性感染性疾病的治疗，尤其是为HIV-1感染者提供功能性治愈。然而，CAR T细胞持续抑制HIV的有效性面临诸多挑战，包括逆转录酶的高突变率，这使得免疫逃逸病毒变体得以出现，并与抗逆转录病毒疗法停止后潜伏感染细胞库引起的病毒血症复发并行。为了规避HIV的免疫逃逸，这些靶向HIV的CAR T细胞必须被设计成能够识别HIV-1包膜糖蛋白gp120上高度保守的表位，这些表位表达在HIV感染细胞的表面。第一代抗HIV-1 CAR T细胞针对HIV-1 gp120的CD4结合域，使用人CD4胞外域与CD3ζ信号域融合，但由于仅包含CD3ζ T细胞受体信号域的CAR传递的T细胞信号有限，以及基于CD4的CAR使CD8+ T细胞易受HIV感染的意外后果，仅能最低限度地控制HIV-1感染。我们此前报道过通过构建duoCAR T细胞来克服这些限制。duoCAR T细胞是第二代CAR T细胞，表达两个独立的CAR域，分别靶向两个高度保守的HIV-Env表位，并与CD3ζ和4-1BB共刺激信号域相连；抗HIV CAR分子mD1.22-CAR和m36.4-CAR分别靶向HIV高度保守的CD4和CCR5共受体结合位点。
尽管这些多特异性抗HIV duoCAR T细胞在体内展现出强大的HIV感染抑制能力，但迄今为止，在中断ART后，没有一种测试过的抗HIV CAR T细胞显示出长期HIV抑制效果。我们假设，降低CAR T细胞功能持久性的一个因素可能是用于激活T细胞使其能够被CAR编码慢病毒转导的标准方法，即通过CD3和CD28抗体进行TCR信号传导。虽然这种方法能够实现高效的慢病毒转导，但它也会产生更分化的CAR T细胞产物，这与细胞毒功能的持久性降低相关。先前对CD19 CAR T细胞疗法的研究表明，临床结果最佳的患者通常拥有分化程度较低、早期记忆表型的CAR T细胞，特别是T记忆干细胞，其特征是表达CD45RO-、CCR7+、CD95+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和IL-7Rα+等标记。T_SCM细胞亚群代表继初始T细胞之后最早的T细胞分化阶段，因此，这两个T细胞亚群共享许多功能和表型特征，例如表达相同的T细胞标记CCR7，但不表达CD45RO（T_N/SCM细胞：CD45RO-CCR7+）。T_SCM细胞可以通过其CD95的表达与T_N细胞区分开来；因此，T_SCM细胞的特征是CD45RO-CCR7+CD95+。这种非常早期的T细胞分化阶段赋予了分化为多样化T记忆细胞后代的能力，并展现出自我更新、高增殖和体内长期存活的特性。这种T_SCM细胞表型对于生成最有效的HIV特异性CAR T细胞至关重要，因为功能性抗HIV CAR T细胞的持续存在是维持HIV抑制所必需的。这对于防止病毒从长寿命潜伏感染的细胞群中反弹非常重要，这些细胞群在ART停止后可能重新引入分散的HIV感染。
然而，使用标准方法生成大量T_SCM CAR T细胞受到T_SCM细胞群体稀有性的阻碍，其仅占循环T细胞的2-3%。虽然可以通过从高度纯化的T_N或T_SCM细胞生成CAR T细胞来规避这一点，但获取这些T_SCM细胞需要从非常大的T细胞群体开始。反过来，生成的CAR T_SCM细胞显示出降低的细胞毒功能和细胞因子产生。另一种方案通过用可溶性αCD3抗体单独刺激高度纯化的初始CD8+ T细胞，然后用CAR编码慢病毒转导并用IL-7和IL-15培养4周，生成了大量的T_SCM CAR T细胞。虽然有报道称，在通过αCD3/28刺激生成CAR T细胞后，用IL-7、IL-15和IL-21培养与用IL-2培养相比，增加了显示初始和早期记忆表型的CAR T细胞群体，但该研究并未专门评估T_SCM CAR T细胞的生成。其他方法已被用于延长CAR T细胞的持久性，包括通过激活Wnt信号来阻断T细胞分化，以及通过IL-10免疫抑制信号生成保持干细胞样记忆活性的CAR T细胞。在本研究中，我们证明了HCW9206，一种可溶性组织因子融合分子，连接IL-7、IL-15/IL-15Rα sushi结构域复合物和IL-21，以激活和扩增记忆样自然杀伤细胞，能够实现CAR编码慢病毒对T细胞的高效转导，从而生成HIV和CD19特异性的CAR T细胞。这些CAR T细胞既包含大量的CAR T_SCM细胞群体，也包含足够的CAR T效应细胞，以有效抑制HIV感染或消除CD19+肿瘤细胞。通过HCW9206处理生成CAR T细胞的方法代表了对标准αCD3/28激活方法生产CAR T细胞的显著改进，因为它们包含的数倍更高的CAR T_SCM细胞比例使其能够展示出更持久的功能活性和强大的效应功能。
结果
用HCW9206，一种连接IL-7、IL-15/IL-15Rα sushi结构域复合物和IL-21的支架蛋白处理，能刺激CD8+ T细胞的增殖，特别是那些具有T_SCM细胞表型的细胞
为了提供最佳的细胞因子支持以离体扩增抗肿瘤记忆样NK细胞，我们开发了一种多功能融合分子HCW9206，它连接了人IL-7、一个IL-15/IL-15Rα sushi结构域复合物（作为IL-15超级激动剂发挥作用）和IL-21。我们先前通过证明其分别驱动细胞因子依赖性细胞系CTLL-2、2E8和B9增殖的能力，验证了HCW9206连接的IL-15SA、IL-7和IL-21的生物活性。为了进一步证明与HCW9206连接的细胞因子在原代T细胞中的生物活性，我们评估了它们激活信号转导及转录激活因子5和STAT3的能力，这些转录因子在JAK/STAT信号级联中被磷酸化；STAT5磷酸化由IL-7和IL-15启动，IL-21的作用程度较小，而STAT3磷酸化由IL-7、IL-15或IL-21诱导。在用HCW9206或IL-7、IL-15或IL-21处理供体来源的CD8+ T细胞后，STAT5磷酸化由IL-7、IL-15和HCW9206诱导，但不由IL-21诱导。通过评估CAR T细胞增殖和CAR T_SCM细胞生成的滴定分析，确定100 nM HCW9206为最佳剂量。STAT3在经HCW9206、IL-7、IL-15和IL-21细胞因子处理后磷酸化，而STAT5在IL-21处理后未显著磷酸化，这与其主要诱导STAT1和STAT3磷酸化一致。这些数据表明HCW9206诱导STAT5和STAT3的磷酸化，与其连接细胞因子的活性一致。
图1. HCW9206细胞因子支架在体外刺激人T细胞。(A) HCW9206示意图。(B) 代表性直方图显示经HCW9206刺激后CD8+ T细胞中磷酸化STAT5或磷酸化STAT3的表达。(C-F) 统计分析显示HCW9206能有效诱导STAT5和STAT3磷酸化，并以与αCD3/28刺激相当的方式促进T细胞增殖，但对T_N/SCM细胞的增殖诱导作用显著更强。
我们比较了HCW9206处理与加有IL-2的αCD3/28刺激诱导T细胞增殖的能力。用Cell Trace Violet染色的供体人T细胞用HCW9206或αCD3/28处理7天。通过流式细胞术定量染料稀释评估的增殖表明，HCW9206处理后发生增殖的CD8 T细胞比例与αCD3/28处理后观察到的相当。然而，HCW9206处理后，在T_N/SCM细胞记忆象限中发生增殖的CD8 T细胞比例显著高于对αCD3/28刺激做出增殖反应的CD45RO-CCR7+ CD8 T细胞比例。这可能是由于对αCD3/28做出增殖反应的CD8 T细胞下调了CCR7，该象限中剩余的小群体是T_N细胞而非T_SCM细胞，这使它们不易增殖。这些结果表明HCW9206促进CD8 T细胞的增殖，但与αCD3/28处理不同，它还优先诱导T_SCM样细胞的增殖，这与先前关于稳态细胞因子IL-7和IL-15可以驱动T_SCM细胞（而非T_N细胞）增殖的报道一致。
用HCW9206处理人T细胞可实现高效的慢病毒转导，并生成以T_SCM细胞表型为主的CAR T细胞
我们假设，通过开发一种基于细胞因子的替代标准CAR T细胞生成方法（即αCD3/28激活），可以增强CAR T细胞的持久性，从而生成具有更强增殖和自我更新能力的CAR T细胞。先前的研究报道，用IL-7或IL-15等细胞因子处理T细胞，可使T细胞被慢病毒转导，从而产生表达特定TCRαβ链或靶向CD19的CAR的早期记忆T细胞，这些细胞展现出改善的治疗活性。我们检验了用由支架连接的IL-7、IL-15SA和IL-21的组合处理是否会使T细胞对慢病毒转导易感，并能够生成以T_SCM细胞表型为主的CAR T细胞，以及具有强大效应活性的CAR T细胞。我们比较了从供体来源的T细胞生成的CAR T细胞，这些细胞用表达抗HIV duoCAR的慢病毒载体转导。细胞分别用标准αCD3/28激活（存在重组人细胞因子如IL-2）或仅用HCW9206处理来激活。对于使用duoCAR慢病毒的转导效率，在标准αCD3/28刺激和IL-2处理、αCD3/28刺激后接IL-15或IL-7、IL-15和IL-21处理，或HCW9206处理后，观察到的转导效率相当，这通过两个duoCAR gp120结合物m36.4和mD1.22的表达来指示。然而，在duoCAR T_HCW9206细胞群体中为T_SCM细胞的duoCAR T细胞比例比duoCAR T_αCD3/28细胞群体高约14倍，通过其T_SCM细胞表型标记CD45RO-CCR7+CD95+的表达指示。我们观察到，仅用IL-15处理即可发生T_SCM细胞扩增，但αCD3/28刺激与IL-15或IL-7、IL-15和IL-21混合物结合则不能。这可能是由于强大的αCD3/28刺激信号驱动了T_SCM细胞的分化，从而超越了单独IL-15或与IL-7和IL-21组合维持早期记忆T_SCM细胞的能力。相比之下，仅IL-15即可支持T_SCM细胞富集，但其程度显著低于通过HCW9206处理递送的IL-7、IL-15和IL-21的组合治疗。然后我们评估了这些T_SCM CAR T细胞在抗原刺激下展示T_SCM细胞生成多样化T记忆细胞后代特征性能力。我们比较了duoCAR T_HCW9206或duoCAR T_αCD3/28细胞在gp120刺激前后的记忆表型。经过gp120刺激后，duoCAR T_HCW9206细胞的主要表型从T_SCM细胞转变为更分化的中央记忆T细胞表型，T_SCM细胞群体相应减少。
图2. HCW9206处理使T细胞慢病毒转导能够生成HIV特异性duoCAR T细胞。(A-E) 图表和流式图显示HCW9206处理与αCD3/28激活相比，能实现相当的duoCAR转导效率，但生成的CAR T细胞中T_SCM细胞比例显著更高（约58.7% vs 4.1%），且这些T_SCM细胞在抗原刺激后能分化产生更成熟的记忆T细胞后代。
我们进一步评估了HCW9206处理生成CAR T细胞的能力，通过研究其产生CD19特异性CAR T细胞的能力。如duoCAR T细胞生产中所观察到的，虽然HCW9206处理生成的CD19 CAR T细胞水平与标准αCD3/28方法相当，但CAR T细胞的表型（即T_SCM细胞的比例）比CD19 CAR T_αCD3/28细胞高约12倍。我们还确定，在等摩尔浓度下，HCW9206处理导致CD45RO-CCR7+CD95+ CD19 CAR T_SCM细胞群体显著增加，几乎是单独IL-7刺激的两倍。这些CD45RO-CCR7+CD95+ CD19 CAR T_HCW9206细胞的T_SCM细胞表型通过其共表达多种与T细胞干性相关的标记物（包括CCR7、CD45RA、CD27和CD95）得到进一步证实；不表达T虚拟记忆标记细胞NKG2A；并表达T细胞祖细胞相关转录因子TCF-1。如同在duoCAR T_HCW9206细胞中观察到的那样，我们观察到在与CD19+ NALM-6细胞共培养进行抗原刺激后，CD19 CAR T_HCW9206细胞的表型向T_CM细胞表型发生了显著转变，T_SCM细胞平均比例从58.7%降至4.4%，而T_CM细胞平均比例从20.1%增至74.2%。总之，这些数据表明HCW9206处理生成的CAR T细胞显著富集了早期记忆T_SCM细胞。
图图3. HCW9206处理T细胞生成富集T_SCM细胞的CD19特异性CAR T细胞。(A-F) 图表和流式图显示HCW9206处理生成的CD19 CAR T细胞与αCD3/28方法相比，转导效率相当，但T_SCM细胞比例显著更高（约12倍）。HCW9206处理在等摩尔浓度下比单独IL-7刺激的T_SCM细胞富集效果更好。这些T_SCM细胞表达多种干性标记（CCR7、CD45RA、CD27、CD95），不表达NKG2A，表达TCF-1。在抗原刺激后，HCW9206生成的CAR T细胞能够分化为更成熟的记忆表型。
由HCW9206处理或αCD3/28激活生成的CAR T细胞在体外展现相当的功能活性
我们比较了duoCAR T_HCW9206细胞和duoCAR T_αCD3/28细胞抑制HIV-1感染的功能能力。使用表达Renilla荧光素酶报告基因的HIV-1感染性分子克隆。PHA激活的CD4+ T细胞被表达BaL或JRCSF Env糖蛋白的HIV-LucR感染，与指示的同源duoCAR T细胞共培养，几天后通过定量荧光素酶活性确定HIV感染水平。DuoCAR T_HCW9206和duoCAR T_αCD3/28细胞以剂量依赖性方式展现出相当的体外HIV-1抑制能力，在效应细胞与靶细胞比例为1:10时，对表达JRCSF包膜的IMC抑制率>90%，对表达BaL包膜的IMC抑制率>67%。类似地，CD19 CAR T_HCW9206和CD19 CAR T_αCD3/28细胞对CD19+肿瘤细胞系（包括Raji和NALM-6细胞）展现出同等的细胞毒性。
我们进一步评估了HCW9206和αCD3/28生成的CAR T细胞的功能，通过测定它们在各自抗原激活后的细胞因子产生。DuoCAR T_HCW9206细胞在孵育293T-gp120细胞后，产生的TNFα和IFN-γ显著高于duoCAR T_αCD3/28细胞，这是由于duoCAR T_HCW9206效应记忆T细胞群体产生的IFN-γ和TNFα增加。同样，CD19 CAR T_HCW9206细胞在与靶NALM-6细胞孵育后，产生的IFN-γ和TNFα高于CD19 CAR T_αCD3/28细胞，这可能是由于CD19 CAR T_HCW9206 T_EM细胞群体产生的IFN-γ增加，以及T_EM和T_SCM细胞群体产生的TNFα增加。此外，我们观察到在基线时和293T-gp120细胞刺激24小时后，duoCAR T_HCW9206细胞中耗竭标记LAG3和TIM3的表达显著低于duoCAR T_αCD3/28细胞，表明HCW9206刺激不会驱动功能失调的激活状态。总体而言，这些发现表明CAR T_HCW9206细胞具有与CAR T_αCD3/28细胞相似或更优的细胞毒功能，同时展现出富集的早期记忆T_SCM细胞表型。
图4. HCW9206刺激生成具有细胞毒性和多功能性的HIV和CD19特异性CAR T细胞。(A-J) 功能分析显示，在体外HIV抑制实验和短期细胞毒性实验中，HCW9206生成的CAR T细胞与αCD3/28生成的细胞具有相当或更优的杀伤效力。细胞因子分析表明，HCW9206生成的CAR T细胞在效应记忆和T_SCM亚群中产生更多的IFN-γ和TNFα，且耗竭标志物表达更低。
抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞相较于duoCAR T_αCD3/28细胞展现出增强的T_SCM细胞转录程序化和效应特征
为了进一步评估标准αCD3/28刺激与HCW9206处理生成的抗HIV duoCAR T细胞之间的差异，我们比较了它们在有无293T-gp120细胞刺激下的转录组。来自两个供体的CD8+ duoCAR T_αCD3/28细胞和duoCAR T_HCW9206细胞分别与293T细胞或293T-gp120细胞共培养16小时，通过流式细胞分选纯化，并进行bulk RNA测序。无论是否经过293T-gp120细胞刺激，duoCAR T_HCW9206细胞与duoCAR T_αCD3/28细胞相比都表现出明显的转录差异。在比较未刺激和gp120刺激下的duoCAR T_HCW9206和duoCAR T_αCD3/28细胞时，我们在未激活条件下鉴定出311个独特的差异表达基因，在gp120激活后鉴定出172个差异表达基因，以及128个共享差异表达基因。这些结果表明，duoCAR T_HCW9206和duoCAR T_αCD3/28细胞之间最大的转录差异出现在未激活的CAR T细胞中；然而，激活后它们的转录谱趋于收敛，差异表达基因数量减少，表明它们对gp120的CAR刺激反应存在重叠。具体来说，我们发现与未激活的CAR T_αCD3/28细胞相比，未激活的CAR T_HCW9206细胞中与细胞因子信号传导和JAK/STAT信号传导相关的基因转录本上调，包括STAT3、IL15RA、IL-2RA、IL6R、SOCS1、SOCS2、SOCS3、FOS和JUN，以及促炎细胞因子如TNF和IFNG。
通过Ingenuity Pathway Analysis预测，duoCAR T_αCD3/28和duoCAR T_HCW9206细胞中鉴定的差异表达基因与T细胞发育和激活、JAK/STAT信号传导或T细胞迁移相关。具体而言，IPA和预排序的基因集富集分析表明，在未激活的duoCAR T_HCW9206与duoCAR T_αCD3/28细胞的比较中，STAT3和STAT5信号通路显著上调。我们确定，与duoCAR T_αCD3/28细胞相比，无论是未激活还是被293T-gp120细胞激活的duoCAR T_HCW9206细胞，都显著上调了与细胞迁移（CXCR4）、存活（BCL2）和T_SCM细胞表型（SMAD7、KLF2和IL7R）相关的基因。此外，通过IPA鉴定，未激活和激活的duoCAR T_HCW9206细胞也都表现出T细胞效应样基因特征，包括PRF1、NOTCH1、FAS、PRDM1和ICOS的表达。比较未激活的CAR T_HCW9206和CAR T_αCD3/28细胞的转录组，IPA分析发现CAR T_HCW9206细胞中与“细胞活力”、“细胞存活”、“细胞运动”和“T淋巴细胞刺激”等通路相关的基因表达富集。CAR T_HCW9206细胞中与细胞活力和存活通路相关的基因表达富集，表明与CAR T_αCD3/28细胞相比，CAR T_HCW9206细胞中代表长寿命早期记忆T_SCM细胞的比例增加。此外，比较激活的CAR T_HCW9206和CAR T_αCD3/28细胞的转录组，发现CAR T_HCW9206细胞中与效应功能通路（包括“细胞毒性”和“细胞内化”）以及迁移通路（如“细胞外渗”）相关的基因表达增加。这些结果表明，与CAR T_αCD3/28细胞相比，CAR T_HCW9206细胞的转录组富集了具有促存活、T_SCM样特征的细胞，同时保留了具有强大效应T细胞转录组的群体。
图5. HCW9206生成的HIV特异性duoCAR T细胞同时展现T_SCM样和效应样转录程序。(A-E) 实验方案和转录组分析显示，与αCD3/28生成的细胞相比，HCW9206生成的duoCAR T细胞在未刺激和抗原刺激条件下均表现出独特的基因表达谱。差异表达基因富集于细胞活力、存活、运动、JAK/STAT信号及T细胞激活等通路，并同时具有T_SCM特征（如SMAD7、KLF2、IL7R）和效应特征（如PRF1、FAS）。
CD19 CAR T_HCW9206细胞在NALM-6白血病细胞再挑战的NSG小鼠中展现增强的体内功能持久性
我们检验了CD19 CAR T_HCW9206细胞富集T_SCM细胞表型是否比CD19 CAR T_αCD3/28细胞增加了其体内功能持久性，通过评估它们清除初始挑战和随后再挑战的NALM-6白血病细胞的能力来判定。在NSG小鼠静脉注射NALM-6-Luc细胞一天后，小鼠静脉注射CD19 CAR T_HCW9206细胞或CD19 CAR T_αCD3/28细胞。通过每两周注射HCW9206为小鼠体内移植的人T细胞提供人IL-7、IL-15SA和IL-21支持。初步研究表明，注射HCW9206的小鼠中CAR T细胞功能和持久性得到增强。即使在未接受细胞因子治疗的小鼠中，我们也观察到了CD19 CAR T_HCW9206存活增强和NALM-6-Luc细胞扩增延迟的趋势。通过生物发光成像每周定量小鼠体内NALM-6-Luc细胞群。在未治疗或接受未转导T细胞治疗的小鼠中，观察到NALM-6-Luc细胞快速扩增和全身扩散。相比之下，在所有接受CD19 CAR T_HCW9206细胞或CD19 CAR T_αCD3/28细胞治疗的小鼠中，我们观察到NALM-6-Luc细胞生长几乎完全被抑制。为了评估这些小鼠中功能性CD19 CAR T_HCW9206细胞或CD19 CAR T_αCD3/28细胞的持久性，在初始CAR T细胞注射3周后，我们用第二次注射NALM-6-Luc细胞进行再挑战。通过BLI评估小鼠显示，虽然在使用CD19 CAR T_αCD3/28细胞注射的六只小鼠中有五只观察到NALM-6-Luc细胞扩散，但在输注CD19 CAR T_HCW9206细胞的五只小鼠中均未检测到NALM-6-Luc细胞扩散。这通过测量总光子通量证实了显著减少。在再挑战后，CD19 CAR T_HCW9206细胞治疗的小鼠中对NALM-6-Luc细胞扩增的强效抑制与8天和16天时循环CD19 CAR T_HCW9206细胞数量的显著增加相关，而CD19 CAR T_αCD3/28细胞治疗的小鼠循环CD19 CAR T_αCD3/28细胞水平几乎检测不到。这与注射CD19 CAR T_HCW9206细胞的小鼠外周血中具有T_SCM细胞表型的CD19 CAR T细胞群体持续较高相平行。具体而言，输注后15天，注射CAR T_HCW9206细胞的小鼠外周血中具有T_SCM细胞表型的CD19 CAR T细胞比例几乎是注射CD19 CAR T_αCD3/28细胞小鼠中T_SCM细胞群体的20倍。这很可能有助于CAR T_HCW9206细胞相较于注射CD19 CAR T_αCD3/28细胞的小鼠具有更强持久性的体内功能活性。此外，在注射CD19 CAR T细胞6周后以及再挑战NALM-6-Luc细胞3周后，我们在注射CD19 CAR T_αCD3/28细胞的小鼠脾脏和骨髓中检测到很少的CAR T细胞。相比之下，我们在所有注射CD19 CAR T_HCW9206细胞的小鼠脾脏和骨髓中都检测到离散的CD19 CAR T细胞群体，其数量显著高于注射CD19 CAR T_αCD3/28细胞的小鼠。总之，这些数据表明CD19 CAR T_HCW9206细胞展现出强大的植入能力，且CAR T_SCM细胞群体显著更高。这一群体与增强的持久性和更大的体内增殖保护反应能力相关，正如CD19 CAR T_HCW9206细胞与CD19 CAR T_αCD3/28细胞相比，在再挑战CD19+ NALM-6-Luc细胞后有效抑制肿瘤细胞扩增所表明的那样。
图6. CD19 CAR T_HCW9206细胞在NSG小鼠中比CD19 CAR T_αCD3/28细胞更长久地抑制NALM-6细胞扩增，并展现增强的功能持久性。(A-H) 实验方案显示，CD19 CAR T_HCW9206治疗的小鼠在肿瘤再挑战后能完全抑制肿瘤生长，而αCD3/28治疗组出现肿瘤复发。CAR T_HCW9206治疗组外周血中CAR T细胞扩增显著，T_SCM细胞比例持续较高，且在脾脏和骨髓中有更好的植入和持久性。
抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞在HIV-1 PBMC人源化小鼠模型中展现强大的细胞毒功能
我们使用之前开发的HIV-1感染的人源化NSG小鼠模型比较了duoCAR T_HCW9206细胞和duoCAR T_αCD3/28细胞抑制HIV感染的能力。按照实验方案，在NSG小鼠脾内注射感染HIV-1_JRCSF的同源PBMC后，它们要么不接受治疗，要么接受未转导的αCD3/28激活T细胞或HCW9206处理T细胞作为对照，或接受duoCAR T_HCW9206细胞或duoCAR T_αCD3/28细胞治疗。小鼠在17-18天后被处死，定量脾脏中duoCAR T细胞、人淋巴细胞和HIV感染水平。虽然在注射duoCAR T_HCW9206细胞或duoCAR T_αCD3/28细胞的小鼠脾脏中检测到相当数量的duoCAR T细胞，但注射duoCAR T_HCW9206细胞的小鼠脾脏中HIV感染细胞的抑制率显著高于注射duoCAR T_αCD3/28细胞的小鼠。我们还观察到，与注射duoCAR T_αCD3/28细胞的小鼠相比，注射duoCAR T_HCW9206细胞的小鼠脾脏中人类CD4+ T细胞群体增加，这可能反映了小鼠脾脏中HIV感染水平与HIV介导的CD4+ T细胞耗竭之间的反比关系。总之，这些数据表明duoCAR T_HCW9206细胞比duoCAR T_αCD3/28细胞表现出更强的体内抗HIV活性，这可能是由于植入的duoCAR T_HCW9206细胞中T_SCM细胞表型的富集，这可能为duoCAR T_EM和效应细胞提供持续的来源，从而实现对HIV感染的更强抑制。
图7. HCW9206生成的抗HIV duoCAR T细胞在人源化小鼠模型中比αCD3/28生成的duoCAR T细胞表现出更强的体内HIV-1抑制。(A-D) 在hu-spl-PBMC-NSG模型中，duoCAR T_HCW9206细胞使脾脏HIV感染细胞减少92.4%，显著优于αCD3/28细胞的49.7%抑制率，并伴随着CD4+ T细胞的更好保存。
具有强大效应功能的抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞可以从HIV感染者中生成
duoCAR T细胞治疗的目标是为HIV感染者提供能够介导持续缓解的持久免疫应答。因此，我们评估了HCW9206处理HIV感染者T细胞是否也能生成富集T_SCM细胞表型的duoCAR T细胞，这应展现出更持久的功能活性，以提供对复发性HIV感染的持续抑制。正如在未感染HIV的供体中所观察到的，与αCD3/28激活相比，HCW9206处理使HIV感染者T细胞与duoCAR T慢病毒的转导效率相当。此外，通过HCW9206处理生成的CD8+ duoCAR T细胞中，表型为T_SCM细胞的比例比αCD3/28激活产生的duoCAR T细胞中T_SCM细胞的比例高约15倍，这通过CD45RO与CCR7表达以及CD95和CD27的表达得到证实。我们评估了来自HIV感染者的duoCAR T_HCW9206细胞与duoCAR T_αCD3/28细胞在体外HIV-1抑制实验中的能力。简言之，我们用表达BaL包膜的HIV-1-LucR IMC超感染来自HIV感染供体的CD8耗竭PBMC，两天后，以1:1的效应细胞与靶细胞比例加入自体duoCAR T_HCW9206细胞或duoCAR T_αCD3/28细胞。与仅含HIV感染的CD8耗竭PBMC以及用未转导对照T细胞处理的CD8耗竭PBMC相比，duoCAR T_HCW9206细胞和duoCAR T_αCD3/28细胞均将HIV-1感染抑制了75%以上（效应细胞与靶细胞比例为1:1），这在代表性实验和三个HIV感染供体的合并数据中均有显示。因此，用HCW9206处理HIV感染者的T细胞，能够生成由高度富集的T_SCM细胞群体（支持体内长期持久性和功能活性）以及能够提供即时且强效HIV-1抑制的T_EM细胞群体共同组成的duoCAR T细胞。
图8. 从HIV感染者来源的T细胞可生成强效的、富集T_SCM细胞的HCW9206 duoCAR T细胞。(A-E) 与未感染供体类似，HCW9206处理同样能在HIV感染者T细胞中实现高效的duoCAR转导，并产生约15倍富集的T_SCM细胞群体。这些duoCAR T_HCW9206细胞在体外HIV-1抑制实验中展现出与αCD3/28生成的细胞相当的病毒抑制效力（>75%）。
讨论
尽管ART能够将HIV复制抑制到检测水平以下，但ART停止后，HIV病毒库的持续存在能够重新引发系统性HIV感染，这阻碍了HIV感染者实现持续缓解。实现HIV功能性治愈的一种策略是，通过引入持久的、循环的、能够识别高度保守HIV抗原的免疫细胞来增强HIV感染者的免疫系统。这些细胞应能抵抗HIV感染，能够克服病毒免疫逃逸，并能够迁移到潜伏HIV感染的部位，以便它们能够持续存在并迅速清除再激活的HIV感染细胞，防止系统性感染复发。为此，我们开发并验证了双特异性duoCAR T细胞的强效抗HIV活性。这种duoCAR T细胞靶向HIV-1包膜糖蛋白gp120的两个高度保守表位，高度抵抗HIV感染，并能迁移到活动性感染部位，在hu-spl-PBMC-NSG小鼠模型中有效抑制HIV-1感染。然而，当前CAR T细胞免疫疗法的长期疗效受到输注患者后其功能活性随时间推移而丧失的限制，特别是如果它们的成熟状态主要由终末分化的效应细胞组成，这些细胞会上调耗竭标志物的表达，并与不良的体内植入和抗肿瘤活性相关。相比之下，包含早期记忆T细胞表型的T细胞在过继转移后表现出更优的植入和更好的临床结果。输注的CAR T细胞持久性降低的一个原因可能是，使用强烈的CD3和CD28激活来使编码CAR的慢病毒能够转导，而这会意外地驱动T细胞快速分化，并产生次优的CAR T细胞产品。为了解决这个问题，人们已经评估了不涉及CD3和CD28刺激的替代策略，这些策略提供足够的激活以实现慢病毒转导并生成CAR T细胞，但诱导的T细胞分化程度较低。一种策略是用IL-7处理替代TCR激活。IL-7增加抗凋亡分子BCL2的表达，并诱导细胞周期从G0期进入G1期，从而实现慢病毒转导而不驱动T细胞分化。在缺乏CD3激活的情况下，IL-7处理能够通过慢病毒转导产生富集T_SCM细胞表型的TCR修饰T细胞或CD19 CAR T细胞，与αCD3/28刺激的细胞相比，在体内黑色素瘤和淋巴瘤异种移植模型中显示出改善的肿瘤控制。然而，这些研究无法证实循环的IL-7刺激工程T细胞的相应持久性。同样，先前的研究也表明，IL-7和IL-15能更好地保持T_SCM细胞表型。一项研究使用分离的T_N细胞，用αCD3/28激活并用IL-7和IL-15培养，以生成富集T_SCM细胞亚群的CD19 CAR T细胞。尽管这些CAR T_SCM细胞表现出增强的肿瘤抑制和相应的CAR T细胞持久性，但与分化程度更高的CAR T细胞亚群相比，它们的细胞毒性较低。在当前的研究中，我们在先前研究的基础上，通过将IL-21与IL-7和IL-15SA一起纳入到一个单一的支架蛋白中，以支持具有强大效应功能的T细胞的扩增，同时维持早期记忆表型，包括T_CM和T_SCM细胞亚群。先前的报道表明，IL-21对于早期记忆CD8 T细胞的发育和维持至关重要，并且与IL-7或IL-15联合使用时，能明确增强存活和增殖，使记忆样和初始样CAR T细胞均受益。据我们所知，我们是首个展示使用这种新型三重细胞因子支架生成富集T_SCM细胞、多功能性CAR T细胞的研究。值得注意的是，这项研究也是首个仅使用基于细胞因子的激活信号来生成HIV特异性CAR T细胞的研究。这通过引入一种能够产生功能持久产品的新策略，推进了HIV免疫疗法，从而延长了抗HIV CAR T疗法在HIV感染者中的寿命，并可能实现功能性治愈。
为了使用单一药剂递送IL-7、IL-15SA和IL-21，我们开发了HCW9206，一种可溶性TF融合分子，它连接IL-7、IL-15SA和IL-21以激活和扩增记忆样NK细胞。该支架基于IL-15超级激动剂N-803，并使用相应的IL-15/IL-15RaSu结构域。然而，HCW9206在N-803的基础上额外连接了IL-7和IL-21细胞因子结构域，所有这些都通过一个基于TF的支架连接在一起。这种设计简化了三种协同细胞因子在单一治疗中的递送，并允许与支架相互作用的每个细胞同时结合所有三种细胞因子。在此，我们证明了使用HCW9206的多细胞因子支架处理，无需额外的CD3激活，即可高效生产高度富集T_SCM细胞表型的HIV和CD19特异性CAR T细胞。HCW9206处理也产生了足够的CAR T效应细胞，这些细胞能够引发即时的细胞毒反应，有效抑制HIV感染并消除CD19+肿瘤细胞。这些结果表明，HCW9206处理比标准αCD3/28激活更具优势，因为它生成了富集CAR T_SCM细胞的HIV特异性duoCAR T细胞和CD19特异性CAR T细胞。这些细胞展现出强大的体内HIV感染和白血病细胞生长抑制能力，以及增强的功能持久性。
我们证明了HCW9206生成的、高度富集T_SCM细胞的CAR T细胞，在与同源抗原（HIV gp120或CD19）共培养后，会转变为更分化的记忆和效应表型分布，这表明HCW9206生成的CAR T细胞既能增殖，也能扩增更分化的T记忆细胞后代，这两者对于最佳效应反应都至关重要。先前通过预先纯化T_SCM细胞再进行CAR慢病毒转导来生成CAR T_SCM细胞的研究，产生的CAR T细胞比传统αCD3/28生成的CAR T细胞细胞毒性更低。相比之下，我们在体外和体内都证明，HCW9206生成的HIV特异性duoCAR T细胞显著富集了T_SCM细胞表型，同时展现出与CAR T_αCD3/28细胞相当的细胞毒功能。这很可能是由于通过HCW9206递送的IL-7和IL-21联合细胞因子信号支持了效应功能，先前已表明IL-7和IL-21能协同促进细胞毒性T细胞的扩增和炎症细胞因子的产生。然而，与duoCAR T_αCD3/28细胞相比，duoCAR T_HCW9206细胞炎症细胞因子产生显著增加的一个潜在挑战是诱发炎症性细胞因子释放综合征的风险。因此，本研究的一个重要未来方向是在我们的人源化小鼠模型中进一步评估细胞因子释放综合征。与单独或组合使用这些或其他细胞因子相比，使用HCW9206处理生成CAR T细胞的一个优势是，它使用单一生物制品来利用IL-7、IL-15SA和IL-21这三种细胞因子的独立和协同效应，简化了剂量确定和临床转化所需的监管审批。总之，这些结果表明，使用HCW9206生产CAR T细胞协同利用了IL-7、IL-15SA和IL-21的效应，促进了包含多样化T细胞亚群的CAR T细胞产品的生成，这些产品展现了T_SCM细胞自我更新能力和增强的T细胞效应功能（很可能来自T_EM细胞群体）的组合，表明CAR T_HCW9206细胞可能比传统的CAR T_αCD3/28细胞是一种更有效、更持久的CAR T细胞免疫疗法。
对由HCW9206递送的IL-7、IL-15SA和IL-21处理生成的HIV特异性duoCAR T细胞与αCD3/28激活生成的duoCAR T细胞进行转录组RNA测序分析，鉴定出多个独特表达的基因，包括与增加的迁移和促存活通路相关的基因。抗原刺激duoCAR T_HCW9206细胞显著上调了SATB1（富含AT序列特异性结合蛋白1）的表达，该基因先前被报道是通过染色质重组决定谱系命运的关键因素。具体而言，SATB1已被证明是CD8+ T细胞静止和干性的关键调节因子，同时促进早期效应细胞扩增和分化，以支持效应反应和长期T细胞持久性。与duoCAR T_αCD3/28细胞相比，抗原刺激的duoCAR T_HCW9206细胞的转录组也显示出IL-10、IL-6和STAT3表达增加，这些先前被报道支持CAR T_SCM细胞维持，并与患者中CAR T细胞的长期性相关。对静息duoCAR T_HCW9206细胞与静息duoCAR T_αCD3/28细胞转录组的IPA分析，鉴定出与细胞活力和细胞存活等通路相关的差异表达基因富集。这些通路中基因的富集表明，与CAR T_αCD3/28细胞产品相比，CAR T_HCW9206细胞产品中长寿命、自我更新的早期记忆T细胞群体显著增加。与我们的体外研究一致，我们还发现，与抗原刺激的duoCAR T_αCD3/28细胞的转录组相比，抗原刺激的duoCAR T_HCW9206细胞的转录组在与细胞毒性、细胞内化和“迁移通路”相关的通路中基因表达富集。这些结果表明，duoCAR T_HCW9206细胞在促存活和T_SCM样基因特征（表明T_SCM细胞表型）以及更多分化的效应样表型方面均有富集，这可能促成了在体外和体内观察到的强效HIV抑制。
在一个人类化小鼠HIV感染模型中，我们证明，虽然两种静脉注射的CAR T细胞类型都能以相当的水平定位到小鼠脾脏中的HIV感染部位，但抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞与duoCAR T_αCD3/28细胞相比，表现出更优的病毒血症抑制能力。具体来说，我们证明，在注射了HIV感染人PBMC的小鼠脾脏中，duoCAR T_HCW9206细胞对HIV感染的抑制率（92.4%）显著高于duoCAR T_αCD3/28细胞（49.7%）。这表明，在迁移到脾脏后，duoCAR T_HCW9206细胞表现出比duoCAR T_αCD3/28细胞更优的抗HIV细胞毒活性。这种增强的活性可能是由于植入的duoCAR T_HCW9206细胞中T_SCM细胞群体增加，这些细胞可能充当有效的效应细胞的可再生来源，以更好地控制HIV感染。然而，这项研究并未评估抗HIV duoCAR T细胞对抗从潜伏HIV库中再激活的HIV感染细胞的长期疗效。因此，将我们的抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞与潜伏期逆转剂配对，对于实现HIV功能性治愈可能至关重要。先前的研究表明，像N-803这样的IL-15超级激动剂，其结构与HCW9206构建体中的IL-15SA组分相似，可以独立作为LRA发挥作用，并在体内展现出潜伏期逆转和成功的效应细胞募集。因此，该项目的一个重要未来方向是评估HCW9206作为LRA，与抗HIV duoCAR T_HCW9206细胞治疗相结合。
使用NSG人源化小鼠模型，我们观察到CD19 CAR T_HCW9206细胞（而非CD19 CAR T_αCD3/28细胞）能够对第二次CD19+ NALM-6白血病挑战产生回忆反应，有效阻止了肿瘤播散。这种反应与CD19 CAR T_HCW9206细胞治疗的小鼠血液、脾脏和骨髓中CD19 CAR T细胞扩增的显著增加相关，而CD19 CAR T_αCD3/28细胞治疗的小鼠则没有。这与我们在用CD19 CAR T_HCW9206细胞注射44天后观察到循环CD19 CAR T_SCM细胞维持，而用CD19 CAR T_αCD3/28细胞处理的小鼠则没有相关。通过HCW9206刺激在CAR T细胞中富集T_SCM细胞代表了一种生成CAR T细胞的替代策略，可能为接受治疗的患者提供更持久、更有效的癌症复发保护。
总之，这些数据表明，用单一生物制剂HCW9206递送的IL-7、IL-15SA和IL-21细胞因子组合处理T细胞，可以快速有效地生成高度富集T_SCM细胞记忆表型以及能够维持HIV和白血病细胞增殖抑制的效应T细胞的HIV和CD19特异性CAR T细胞。因此，通过HCW9206处理生成CAR T细胞，可以为治疗癌症和感染性疾病患者提供一种新的、改进的、高度可扩展的方法，并取代使用αCD3/28激活的标准CAR T细胞生产方法。这对于生成更强大的基于CAR T细胞的免疫疗法，以提高CAR T细胞治疗HIV和癌症的功能持久性和疗效具有广泛的意义。
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