随着年龄增长，骨髓招募移植造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的能力下降，这限制了基于HSPCs疗法的潜力。通过结合体内成像、操控以及综合代谢组学分析，我们发现，随着年龄增长，非神经源性乙酰胆碱（ACh）的降解会破坏局部Chrm5-eNOS-一氧化氮信号传导，导致动脉扩张减少、骨髓血流量和窦状壁剪切应力下降。因此，老龄骨髓微环境会削弱移植HSPCs的跨内皮迁移，其归巢效率因Piezo1激活减少而降低。值得注意的是，药理激活Piezo1可改善老年受体的HSPC归巢效率和移植后生存率。这些发现表明，与年龄相关的局部动脉功能失调通过降低剪切应力损害HSPC归巢至骨髓。调节这些机制可能提高老年患者临床移植的效果和安全性。
老龄HSPCs呈现低营养状态的代谢特征
为确定老龄骨髓环境中包括招募移植细胞能力下降在内的变化，我们调查了对环境变化敏感的HSPCs的代谢状态。为此，我们使用毛细管电泳质谱（CE-MS）进行代谢组学分析（图1a，补充图1a，补充表1）。基于年龄相关代谢物浓度变化的层次聚类分析揭示了两个主要集群，一个由老化过程中上调的代谢物组成，另一个由下调的代谢物组成（补充图1b）。这些数据表明骨髓微环境的老化对HSCs和MPP1产生类似的代谢效应。
在这些代谢物变化中，几种三羧酸循环中间体随着HSCs的老化而减少（图1b）。例如，老龄小鼠的HSCs中的柠檬酸和异柠檬酸水平低于年轻或中年小鼠，其他三羧酸循环中间体也倾向于随年龄下降（图1c，补充图c）。MPP1中也观察到与年龄相关的三羧酸循环代谢物下降（图1d，补充图1d）。对此的一种解释是，老龄HSPCs中三羧酸中间体的消耗增加。三羧酸循环驱动氧化磷酸化以生成能量货币ATP34。然而，在我们的实验中，伴随老化ATP浓度及其分解产物并没有增加（图1e），能量负荷也没有增加，这是反映ATP生产和利用的一个参数35（图1f）。因此，我们考虑了另一种可能性。
HSCs老化过程中代谢物水平变化的层次聚类分析显示许多氨基酸减少（图1b）。我们比较了年轻和老龄HSCs的胞内氨基酸水平。老龄HSPCs中总氨基酸量约为年轻HSPCs的20%，除了两种酸性氨基酸外。同样，80%的氨基酸在老龄MPP1s中比年轻MPP1s低（图1g，补充表1）。相反，HSPCs中胞内蛋白总量没有显著的年龄相关变化（图1h），表明老龄HSPCs中氨基酸减少并非由于蛋白质生产或降解的变化。这些结果表明，老龄三羧酸中间体和氨基酸的下降可能是由于这些代谢物或其代谢前体供给不足。与此一致，老龄HSPCs中糖酵解中间体总量低于年轻HSPCs（图1i）。这些HSPCs的代谢特征表明老龄骨髓龛中血液供应的代谢物减少。
HSPC生态位中的血流随年龄增长而减少
为了直接研究HSPC生态位中与年龄相关的血流变化，我们使用Evi1-IRES-GFP敲入（Evi1-GFP）小鼠36，标记了HSCs和一些MPPs，以可视化HSPCs及其周围微环境（补充图2a）。老龄Evi1-GFP小鼠的HSPCs和其他骨髓部分中GFP高频率与年轻小鼠相当（补充图2b）。通过多光子激光显微镜活体成像，我们在年轻和老龄小鼠的骨髓中都观察到了围绕Evi1-GFPhigh HSPCs的窦状血管（图2a，b）。
首先，我们测量了年轻和老龄骨髓中HSPCs和窦状血管之间的距离，以考虑由于HSPCs和窦状血管拓扑结构变化可能导致的代谢物传递减少的可能性。但是，我们没有发现距离或GFP高细胞分布随年龄变化（补充图2c）。接下来，为评估HSPCs中随年龄代谢物减少是否由于老龄HSC生态位中交换血管（窦状血管）密度减少，我们比较了年轻和老龄生态位中的窦状血管密度。然而，老龄HSC生态位中的窦状血管密度与年轻生态位无显著差异（图2c，补充图2d）。因此，考虑到骨髓微循环可能发生变化，我们使用活体成像比较了年轻、中年和老龄HSC生态位之间的血流情况15,37。Alexa Fluor 633 (AF633) 和乙酰化低密度脂蛋白 (AcLDLs) 的活体染色分别用于识别活体Evi1-GFP小鼠骨髓中的动脉和窦状血管（补充图2e）38。虽然窦状血管直径和血管内体积未变，但动脉直径和通量随年龄减小，且老龄HSPCs周围的窦状血管速度、通量、剪切率和剪切应力均低于年轻HSPCs（图2c-e）。这些数据表明，如HSPCs老化过程中代谢变化所提示，老龄HSC生态位中的灌注减少。
老龄骨髓组织表现出与一氧化氮信号传导减少相关的代谢特征
代谢组学分析表明HSCs和MPP1存在类似的代谢缺陷（图1）。此外，由于整体骨髓血流量减少（图2），我们假设整个骨髓中正在发生代谢变化，并试图识别这些变化。为评估老龄骨髓灌注下降的机制，我们使用CE-MS对不同年龄的全骨髓组织样本进行了代谢组学分析（图3a，补充表2）。尽管检测到的代谢物中有60%在年轻和老龄骨髓样本间无显著差异，但大多数其他代谢物在老龄组中下降，且老龄小鼠中骨髓组织中下降的代谢物数量比中年小鼠更多（图3b）。层次聚类分析揭示了一个在HSCs和全骨髓组织中随年龄下降的代谢物集群，该集群包含许多氨基酸（图3c）。特别是，检测到的许多氨基酸（11种减少，8种不变）在老龄骨髓中比年轻骨髓中低（补充图3a）。为调查这些氨基酸减少是否由于血清氨基酸变化，我们通过CE-MS测量了年轻和老龄小鼠的血清氨基酸浓度（补充表3）。与骨髓不同，几乎所有血清氨基酸在老龄小鼠中都较高（7种增加，12种不变）（补充图3b），表明老龄骨髓中氨基酸的减少独立于血清氨基酸浓度的变化。与HSPCs一样，某些三羧酸循环中间体如顺乌头酸和α-KG在全骨髓组织中随年龄下降，其他三羧酸循环代谢物在老龄骨髓组织中也倾向于低于年轻骨髓组织（补充图3c）。这些发现支持了这样一个可能性，即输送这些代谢物至骨髓的血流量随年龄下降。为识别引发老龄骨髓血流减少的因素，我们使用年轻小鼠作为基线进行了Ingenuity Pathway Analysis（IPA），并发现eNOS信号传导途径在老化过程中下调39（图3d）。另一方面，使用中年小鼠作为基线的IPA显示从中年至老龄eNOS信号传导活性略有下降（Z-score，-0.447）。进一步的IPA分析显示，在老化过程中显著变化的路径中，只有eNOS信号传导途径随年龄下降（图3e，补充图3d）。特别是，一氧化氮生产的天然底物和激活剂精氨酸和乙酰胆碱的水平随年龄下降（图3f）。为验证乙酰胆碱是否在体内诱导一氧化氮生产，用卡巴胆碱处理颅骨骨髓。在骨髓中显著观察到一氧化氮生产，特别是在动脉中（补充图4a）。在eNOS酶反应下游，随着年龄积累的鸟苷三磷酸（GTP），是由一氧化氮激活的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的底物。此外，老龄骨髓中的一氧化氮浓度低于年轻骨髓（图3g）。总的来说，这些结果表明一氧化氮信号减弱是老龄骨髓灌注下降的潜在机制。
老龄骨髓组织中氨基酸浓度的下降可能涉及减少血流以外的机制。例如，有报道称，衰老会导致移植后HSCs的髓系分化偏向40-42。为调查这种偏向是否反映在稳态代谢物变化下，我们分析了年轻和老龄小鼠骨髓中髓系细胞的比例。两组年龄中髓系细胞比例保持恒定约为50%。此外，分离的髓系细胞的代谢组学分析显示，氨基酸或其他代谢物浓度没有显著的年龄相关变化（补充图4b-e，补充表4）。因此，我们将血流变化的影响作为首要因素进行调查。
老龄骨髓中非神经源性乙酰胆碱降解增加
乙酰胆碱（ACh）由表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）的神经元和非神经元细胞提供，ChAT是一种催化ACh合成关键步骤的酶43。我们使用ChAT (BAC)-eGFP（ChATBAC-eGFP）转基因小鼠44来研究ChAT定位及其变化。首先，我们对年轻和老龄ChATBAC-eGFP小鼠的骨髓进行了免疫组织化学分析。在年轻和老龄骨髓中都观察到ChAT+类血细胞圆形细胞，其频率和定位未随年龄变化（图4a，补充图4f，g）。流式细胞术分析显示，与先前报道一致45,46，B细胞是年轻骨髓中表达ChAT的主要造血细胞群体（补充图4h，i）。老龄骨髓中T细胞在表达ChAT的细胞中所占比例高于年轻骨髓，但B细胞仍然是表达ChAT的最大细胞群体。这些结果表明，ACh主要由年轻骨髓中的B细胞产生，而在老龄骨髓中还由T细胞产生。
乙酰胆碱酯酶（AChE）对其水解过程至关重要，可以防止过度刺激接收乙酰胆碱的细胞，包括神经节中的胆碱能神经元47。为了解老龄骨髓中ACh减少的机制，我们比较了年轻和老龄骨髓中AChE的蛋白水平和酶活性。Western blot分析显示老龄骨髓中AChE水平高于年轻骨髓（图4b，c）；AChE的酶活性也随年龄增加（图4d）。接下来，为确定年轻和老龄骨髓中AChE的主要来源，我们分析了Tabula Muris Senis（
缺失Chrm5或毒蕈碱受体的药理抑制模拟老龄骨髓的微循环
为了解ACh在骨髓微循环中的作用，我们筛选了特异性表达于小鼠骨髓血管中的ACh受体（AChRs）。AChRs包括由多个亚单位组合形成的类似桶状通道的烟碱受体（α1–α10, β1–β4, δ,γ和ε），和G蛋白受体毒蕈碱受体（Chrm1-5）48。定量PCR（qPCR）分析表明，在AChRs中，胆碱能受体烟碱α2（Chrna2）、Chrna5和毒蕈碱AChR5（Chrm5）在动脉内皮细胞（AEC）和窦状内皮细胞（SEC）中表达，但其他AChRs（Chrna1, 3, 4, 6−10, Chrnb1-4, Chrnd, Chrng, Chrne, 和 Chrm1-4）未检出（图4e，补充图6a，b）。免疫组织化学和流式细胞术分析也证实了Chrm5在小鼠骨髓血管上的蛋白表达（图4f，补充图6c，d）；在老龄骨髓AEC中也检测到Chrm5表达（图4e，f）。为确定Chrm5缺失是否会在骨髓中引起类似老龄化的情况，我们比较了Chrm5基因敲除（Chrm5 KO）小鼠和野生型（WT）小鼠的BM代谢谱及其产生一氧化氮（NO）的能力。与WT相比，Chrm5 KO小鼠BM中一些氨基酸水平和动脉NO水平降低。（补充图6e，f，补充表5）。
为研究Chrm5在BM微循环中的作用，我们比较了Chrm5 KO小鼠与WT小鼠的BM血液动力学参数49。与WT小鼠相比，Chrm5 KO小鼠颅骨和胫骨BM中小动脉直径较小，血流量较少（图4g，补充图7a，b）。同时，Chrm5 KO小鼠BM窦状血管中的血流速度和流量较WT小鼠减少（图4h，补充图7a，b）。相比之下，WT和Chrm5 KO小鼠之间窦状血管的直径和血管内体积相似（图4h，补充图7a-c）。当我们比较Chrm5 KO小鼠与WT小鼠的造血表型时，未观察到任何与年龄相关的表型变化，例如KO小鼠相对于WT对照组中HSCs的增加。这表明仅减少血流不足以加速BM中已存在的HSCs出现与年龄相关的表型（补充图7d）。
接下来，为排除毒蕈碱AChR发育或骨髓外功能对模拟老龄BM微循环的贡献，将毒蕈碱AChR拮抗剂东莨菪碱局部施用于成年小鼠的颅骨BM，并通过活体成像监测BM血流38（补充图8a）。局部施用东莨菪碱后，BM动脉收缩，动脉血流减少（补充图8b，c）。在BM窦状血管中，施用东莨菪碱后血流速度和流量减少（补充图8d）。这种东莨菪碱引起的动脉和窦状血管血流减少可通过施用NO供体硝普钠（SNP）逆转（补充图8b-d）。这些数据表明，抑制毒蕈碱ACh信号传导再现了老龄BM受损的血流。
抑制NO信号传导模拟老龄BM微循环
为研究NO在维持BM血流中的作用，我们筛选了在小鼠BM ECs中表达的NOS同工酶。eNOS在AECs和SECs中均有表达，AECs的eNOS表达显著高于SECs（图5a）。在老龄BM的AECs和SECs中也检测到eNOS表达（补充图9a）。免疫组织化学分析证实了eNOS蛋白的表达，特别是在被血管平滑肌细胞包绕的AECs中（图5b，补充图9b）。为研究eNOS在BM微循环中的作用，我们比较了eNOS基因敲除（eNOS KO）小鼠与WT小鼠的BM血管网络特性。形态学上，WT和eNOS KO小鼠在动脉和窦状血管的BM血管架构方面没有显著差异（图5c），两组间的BM血管密度也相当（图5d）。另一方面，通过活体成像分析颅骨和胫骨BM，结果显示eNOS KO小鼠的动脉直径较小，窦状血流速度较WT小鼠降低，而窦状血管的直径和血管内体积在WT和eNOS KO小鼠之间相似（图5e，f，补充图9c-e）。为确定eNOS缺失是否会在BM中引起类似于老龄化的状况，我们比较了eNOS KO小鼠与WT小鼠的BM代谢谱。与WT相比，eNOS KO小鼠BM中11种氨基酸和总氨基酸浓度降低（补充图10a，补充表6）。
鉴于eNOS KO小鼠血压较高（补充图10b），为排除eNOS对BM血流的骨髓外功能影响，将NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）局部施用于WT小鼠的颅骨BM，并通过活体成像监测BM血流（图5g）。在局部施用L-NAME后，系统血压和心率未发生变化38，BM动脉收缩，动脉血流减少（图5h，j，补充电影1）。在BM窦状血管中，施用L-NAME后血流速度和流量减少（图5i，k，补充电影1）。这种L-NAME引起的动脉和窦状血管血流减少可通过施用SNP逆转（图5h-k）。使用PBS而不含L-NAME的局部施用对照实验显示，无论是动脉还是窦状血管中的BM血流都没有变化（补充图10c，d）。这些结果表明，抑制NO诱导的血管舒张再现了老龄BM受损的血流。
Piezo1是治疗老龄受体跨内皮迁移缺陷的可用药靶点
接下来，我们检查了NO是否维持BM窦状血管中的剪切应力并促进HSPCs的跨内皮迁移（TEM）。我们将从泛素（Ubc）-GFP小鼠获得的HSPCs注入受体，并在局部施用或不施用L-NAME的情况下，使用多光子活体显微镜分析TEM过程（图6a）。为评估TEM效率，从HSPCs粘附在窦状血管到完成血管外迁移的时间被测量为ΔtTEM（图6b）。局部施用L-NAME延长了HSPCs的ΔtTEM，而额外施用SNP则缩短了它（图6c）。此外，注射Ubc-GFP+ HSPCs的eNOS KO受体的ΔtTEM比WT受体延长（图6d）。eNOS KO受体延长的ΔtTEM在局部施用SNP后缩短到与WT受体相同的水平（图6d）。
我们进一步调查了动脉血流及其产生的剪切应力如何促进HSPC的TEM。血管壁剪切应力激活机械感受器Piezo1，随后启动钙信号传导，促进炎症期间淋巴细胞运输33。基于这一报告，我们检查了Piezo1在BM ECs上参与HSPC TEM的情况（补充图11a）。额外施用Piezo1抑制剂GdCl3消除了SNP在eNOS KO小鼠中缩短ΔtTEM的效果（图6d）。为测试GdCl3是否影响血流，我们在局部施用GdCl3前后测量了BM中的血流。结果显示动脉血流没有变化，但由于窦状血管扩张，流速和剪切应力有所下降（补充图11b）。这些结果表明，GdCl3处理通过直接药理抑制和剪切应力的减少降低了窦状血管中的Piezo1活性。
此外，局部施用Piezo1激动剂Yoda1缩短了注射到eNOS KO小鼠中的Ubc-GFP+ HSPCs的ΔtTEM，而在这些条件下未观察到Yoda1对血流的影响（图6e，补充图11c）。这些结果表明，eNOS合成的NO通过维持ECs上的剪切应力激活Piezo1，从而维持有利于HSPC TEM的BM环境。
我们已经确定老龄BM的NO水平和窦状剪切应力低于年轻BM（图2e，3g）。为调查与年龄相关的NO和窦状剪切应力下降是否影响HSPCs的TEM，我们将Ubc-GFP+ HSPCs注入年轻和老龄小鼠，并比较在存在或不存在NO和/或Piezo1调节剂的情况下ΔtTEM。老龄BM中HSPCs的ΔtTEM比年轻BM更长（图6f）。老龄BM中HSPCs延长的ΔtTEM通过局部施用SNP得以缩短。接下来，我们评估了剪切应力对老龄BM中NO依赖性ΔtTEM延长的贡献。在老龄BM的SECs中检测到Piezo1表达（图6g）。SNP缩短ΔtTEM的效果通过局部施用GdCl3消除（图6f）。局部施用Yoda1激活Piezo1缩短了HSPCs进入老龄BM的ΔtTEM（图6h）。此时，我们未观察到对老龄小鼠血流的影响（补充图11d）。我们进一步分析了TEM发生位置的ΔtTEM与窦状剪切应力的相关性（图6c、d和f）（不包括GdCl3处理的小鼠）。我们发现HSPCs的ΔtTEM与窦状剪切应力呈负相关（图6i）。这些结果表明，由于NO产量减少导致剪切应力降低，老龄BM不如年轻BM适合进行TEM，而这一点可以通过药理激活Piezo1来解决。
动脉ACh-NO信号及随后的窦状剪切应力是改善归巢的治疗靶点
基于这些发现，我们调查了动脉ACh-eNOS信号及随后通过剪切应力激活的窦状Piezo1是否调控移植HSPCs的归巢。我们确认了造血细胞特异性ChAT基因敲除（ChAT-cKO）小鼠骨髓动脉中NO水平的降低（补充图12a）。接下来，我们比较了使用ChAT-cKO或WT小鼠作为受体的移植HSPCs归巢效率（图7a）。与WT相比，ChAT cKO受体的BM归巢效率较低（图7b，补充图12b）。当测试ACh受体缺失是否影响归巢时，我们发现Chrm5 KO小鼠也有HSCs和一些成熟血细胞归巢到BM的效率降低（补充图12c）。接下来，我们比较了使用eNOS KO或WT小鼠作为受体的移植HSPCs归巢效率。与WT相比，eNOS KO受体的移植HSCs和其他细胞群的BM归巢效率较低（图7c，补充图12d，e）。向eNOS KO受体施用SNP增加了HSCs和LSK细胞的归巢效率，而BM和外周血细胞群没有变化（图7c，补充图12d，13a，b）。为测试剪切应力是否涉及HSPCs归巢到BM的过程，我们在抑制或激活Piezo1的情况下评估了移植HSPCs的归巢效率。与对照组相比，GdCl3处理的BM中HSCs的归巢效率较低（图7d，补充图14a）。另一方面，施用Yoda1增加了HSCs的归巢效率（图7e）。这些结果表明，动脉ACh-NO信号及随后的窦状剪切应力负责HSPCs归巢，而且通过激活Piezo1有可能改善HSPCs归巢。
因老龄BM中NO减少和Piezo1失活导致的归巢效率降低可以通过药理手段进行治疗
我们比较了在无辐照情况下年轻和老龄受体中移植HSPCs的BM归巢效率变化（图7f）。与之前报道一致8，包括HSCs、MPP1s和LSK细胞在内的移植HSPCs的BM归巢效率在老龄受体中低于年轻受体（图7g，补充图14b）。向老龄受体施用SNP改善了HSCs的归巢效率（图7g）。此外，与未预处理的老龄DMSO处理受体相比，向老龄受体施用Yoda1提高了移植HSCs的BM归巢效率（图7h）。我们在更为临床相关的预处理设置中进一步检查了移植后的归巢效率和造血恢复。我们研究了增强NO信号是否可以改善经辐照老龄受体中移植HSPCs的归巢效率（图7i）。正如之前报道的那样8，经辐照老龄受体中移植的HSCs、MPP1s和BM单核细胞（BMMNCs）的归巢效率降低（图7j，补充图14c）。在这些经辐照的老龄受体中，通过施用SNP改善了移植HSCs受损的归巢效率（图7j）。最后，我们研究了通过药理激活Piezo1使用Yoda1是否可以在老龄小鼠接受HSPC移植后增强造血恢复（图7k）。在此模型中，年轻受体的1个月存活率为50%，而老龄受体的存活率为0%（图7l）。在老龄Yoda1处理受体中观察到改善的造血恢复和BM中供体衍生的HSC嵌合体（补充图15a，b），并且Yoda1处理的老龄小鼠存活率得到改善（图7l）。
正如HSCT50和连体共生51模型所示，长期植入能力在老龄受体中下降。我们测试了Yoda1给药是否能改善与年龄相关的植入下降（补充图15c）。移植后12周的嵌合体分析显示，Yoda1组外周血中的供体嵌合体比例高于对照组（补充图15d）。这些发现表明，补充NO或激活Piezo1可以改善老龄受体的植入失败。
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