摘要
冠状动脉疾病（CAD）是一种全球性的健康负担，受遗传和环境因素的共同影响。调节炎症反应的CCL5基因多态性已被证实与CAD易感性和严重程度有关。本研究分析了CCL5基因中的-403G/A和In1.1T/C多态性与CAD风险及严重程度的关系，重点探讨了糖尿病（DM）的作用。病例对照研究包括480名参与者：240名CAD患者（其中122名患有DM，118名无DM）以及240名健康对照者。通过冠状动脉造影确诊CAD，并使用Gensini评分评估其严重程度。采用PCR-RFLP技术对-403G/A（rs2107538）和In1.1T/C（rs2280789）多态性进行基因分型。结果显示，-403G/A SNP的A等位基因显著与CAD易感性相关（p = 0.03；OR = 1.37，95% CI: 1.03–1.82），并在校正混杂因素后仍保持显著性。虽然In1.1T/C与整体CAD风险无关，但CC基因型与更高的Gensini评分相关，表明病情更严重（p < 0.05）。亚组分析显示，在糖尿病患者中，In1.1T/C的C等位基因与CAD显著相关（p = 0.009；OR = 2.06，95% CI: 1.18–3.61），但在非糖尿病患者中未发现关联。此外，DM还增强了-403G/A与CAD严重程度之间的联系。这些结果表明，CCL5多态性会影响CAD的风险和严重程度，而DM则作为修饰因子，为糖尿病人群的CAD个性化管理提供了参考。
引言
冠状动脉疾病（CAD）是全球发病率和死亡率的主要原因之一，由环境和遗传因素的复杂相互作用驱动。尽管吸烟、高血压和血脂异常等传统风险因素已明确，但遗传易感性也逐渐受到关注。越来越多的证据表明，炎症和免疫反应通路中的遗传变异在CAD的发生和发展中起着重要作用。其中，参与白细胞招募和血管炎症的趋化因子CCL5被认为是动脉粥样硬化和斑块不稳定性的重要贡献者。糖尿病（DM）是CAD的既定风险因素，显著增加了心血管并发症的风险。DM与遗传易感性之间的相互作用可能在决定糖尿病患者的CAD风险和严重程度方面起到关键作用。近年来的研究表明，CCL5基因的遗传变异在DM背景下可能表现出与CAD的不同关联，强调了考虑基因-环境相互作用的重要性。本研究旨在探讨-403G/A和In1.1T/C多态性与CAD易感性和严重程度的关系，并进一步分析共病条件如DM对这些关联的影响。
材料与方法
研究人群
本病例对照研究包括480名突尼斯参与者，其中240名为CAD患者，240名为健康对照者。患者来自Monastir市Fattouma Bourguiba医院的心脏科，研究时间为2018年1月至2019年12月。CAD诊断通过冠状动脉造影确认，狭窄程度超过50%的主冠状动脉被定义为CAD。糖尿病状态根据美国糖尿病协会标准确认，空腹血糖水平≥126 mg/dL或HbA1c≥6.5%。肥胖定义为BMI > 24.9 kg/m²，符合突尼斯临床实践中BMI ≥ 25 kg/m²为超重的标准。排除患有自身免疫疾病、慢性炎症性疾病或其他可能影响炎症标志物的疾病的患者。收集每位参与者的详细人口统计和临床数据，包括年龄、性别、BMI、吸烟状况、高血压或DM病史以及家族CAD史。对照组由同一医院的献血者组成，经过严格筛选确保无CAD、DM或高血压风险因素。
CAD严重程度评估
使用Gensini评分评估CAD的严重程度，该评分基于狭窄程度及其解剖位置进行评估。较高的Gensini评分表示更严重的CAD。评分由两名经验丰富的心脏病学家独立完成，且对基因分析结果不知情以避免偏倚。
DNA提取和基因分型
从外周血白细胞中提取基因组DNA，使用盐析法提取并储存于-80°C。CCL5基因多态性-403G/A（rs2107538）和In1.1T/C（rs2280789）的基因分型通过聚合酶链式反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析完成。
统计分析
连续变量的分布通过Kolmogorov-Smirnov检验评估。正态分布变量以均值±标准差（SD）表示，并使用Student's t检验比较；非正态分布变量以中位数（最小值-最大值）表示，并使用Mann-Whitney U检验比较。分类变量以频率或百分比表示，并使用卡方（χ²）检验分析。Yates校正卡方检验用于小样本数据。CCL5多态性与CAD风险的关联通过逻辑回归分析，包括等位基因、共显性、显性和隐性模型。计算调整后的比值比（ORs）及其95%置信区间（CIs）。使用Kruskal-Wallis检验分析基因型与Gensini评分的关联，并计算风险差异（RD）及其95% CIs。基因型分布在CAD组和对照组之间通过卡方检验比较，并使用卡方拟合优度检验评估Hardy-Weinberg平衡（HWE）。所有统计分析使用SPSS Statistics 22.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）和SNPStats在线软件（v1.0）完成。统计显著性设定为p值小于0.05。通过ROC曲线评估CCL5多态性的诊断潜力，并使用G*Power（v3.1.9.7）软件进行事后功效分析。
结果
研究人群特征
表1展示了研究参与者的基线特征。队列包括240名CAD患者（202名男性和38名女性），平均年龄为58.22 ± 11.06岁。对照组包括240名健康个体（180名男性和60名女性），平均年龄为34.61 ± 11.7岁。与对照组相比，CAD组在性别分布和肥胖比例上存在显著差异（P < 0.001）。此外，CAD组年龄更大，吸烟比例更高（P < 0.05）。
当比较伴有DM和不伴DM的CAD患者时（表2），两组在年龄、家族CAD史、Gensini评分、性别分布或肥胖方面没有显著差异（P > 0.05）。然而，在吸烟习惯和高血压患病率上存在显著差异（P < 0.05）。这表明，虽然吸烟和高血压是重要的风险因素，但DM可能并未独立影响CAD患者的这些基线特征。
总体CAD队列中的易感性和严重程度
- 403G/A SNP显示出A等位基因与CAD易感性显著相关（p = 0.03；OR = 1.37，95% CI: 1.03–1.82）（表3）。在隐性模型（AA vs. GG + GA）中，CAD发病风险增加（p = 0.01；OR = 2.22，95% CI: 1.14–4.31）。在校正年龄、性别、肥胖和吸烟状况后，这种关联仍然显著（p = 0.03；OR = 2.80，95% CI: 1.08–7.27）。
为了进一步评估-403G/A和In1.1T/C多态性作为CAD潜在标记的临床实用性，我们进行了敏感性、特异性和功效计算。对于隐性模型（AA vs. GG + GA），-403G/A多态性的敏感性为51.3%，特异性为55.4%，统计功效为65%（表3）。尽管这些值未达到临床实用性的常规阈值（80%），但它们为解释结果提供了更多背景信息。适度的敏感性和特异性反映了CAD的多基因性质以及遗传和环境因素在疾病易感性中的复杂相互作用。
未发现In1.1T/C SNP与CAD易感性之间的显著关联。然而，In1.1T/C的CC基因型与更高的Gensini评分相关，表明在共显性（p = 0.04；RD = 28.38，95% CI: 6.62–50.15）和隐性模型（p = 0.01；RD = 28.07，95% CI: 6.51–49.64）下，CAD严重程度更高（表4）。这些关联在校正年龄、性别、肥胖、吸烟、高血压和DM后依然成立。因此，In1.1T/C并不增加CAD发生的总体风险，但与疾病的严重程度相关。
糖尿病CAD组中的易感性
当将队列分为伴有DM和不伴DM的CAD患者时，新的关联浮现（表5）。所有统计关联均已校正年龄、性别、肥胖和吸烟状况。In1.1T/C的C等位基因与糖尿病CAD患者显著相关（p = 0.009；OR = 2.06，95% CI: 1.18–3.61）。在显性模型（TC + CC vs. TT；p = 0.03；OR = 1.98，95% CI: 1.03–3.81）下观察到基因型关联。当将糖尿病CAD患者与对照组比较时，相同的关联仍然存在（等位基因模型：p = 0.01；OR = 1.77，95% CI: 1.13–2.77；显性模型：p = 0.02；OR = 1.96，95% CI: 1.10–3.50）。然而，当将非糖尿病CAD患者与对照组比较时，这些关联消失。
未发现-403G/A与CAD组（糖尿病与非糖尿病）之间的显著关联。然而，在将各组与对照组比较时发现了显著关联（糖尿病CAD vs. 对照：隐性模型p = 0.02；OR = 2.65，95% CI: 1.12–6.26；非糖尿病CAD vs. 对照：等位基因模型p = 0.03；OR = 1.43，95% CI: 1.02–2.02，隐性模型p = 0.04；OR = 3.17，95% CI: 1.08–10.05）。
糖尿病CAD患者中的Gensini评分
在糖尿病CAD患者中，两个SNP均与Gensini评分显著相关（表6）。In1.1T/C的CC基因型在共显性（p = 0.04；RD = 30.10，95% CI: 3.05–57.15）、显性（p = 0.03；RD = 15.37，95% CI: 1.46–29.28）和隐性模型（p = 0.04；RD = 27.49，95% CI: 0.51–54.47）下与最高的Gensini评分相关。-403G/A的AA基因型相较于GG + GA也显示出显著更高的Gensini评分（p = 0.02；RD = 21.02，95% CI: 3.24–38.80）。这些关联在校正年龄、性别、肥胖、吸烟习惯和高血压后依然成立。
讨论
冠状动脉疾病（CAD）仍然是全球死亡的主要原因，占心血管相关死亡的很大一部分。虽然CAD受多种风险因素影响，但慢性炎症在其发病机制中起着关键作用。CAD的诊断通常涉及临床评估、血脂谱评估、心脏生物标志物检测以及冠状动脉CT血管造影等先进成像技术。
另一种正在达到流行病水平的疾病是糖尿病（DM），影响着约3.65亿人。DM导致毁灭性的并发症，如微血管紊乱和大血管疾病，后者主要是CAD。在2型DM中，CAD风险评估和个体化血糖管理至关重要，最近的指南强调了基于个体风险概况的精准医学策略。
本研究突出了CCL5基因中的两个SNP（In1.1T/C和-403G/A）与CAD（包括糖尿病CAD）的关联，通过等位基因和基因型分布进行分析。
-403G/A与CAD易感性和严重程度的关联
CCL5 -403G/A多态性的A等位基因显著与CAD风险增加相关，提示该变异可能通过调节炎症通路来促进疾病易感性，鉴于CCL5在免疫调节和炎症中的既定作用。在调整其他因素后，这种关联仍然显著，突出了-403G/A对CAD的独立于传统风险因素的遗传贡献，表明靶向CCL5基因或其途径可能是降低高危人群CAD风险的有前景方法。
进一步支持其功能意义的是，有人提出-403G/A中的G到A替换可能导致CCL5表达改变，AA基因型在CAD患者中表现出比GG和GA更高的mRNA水平。尽管尚未得到证实，但有人提出这一多态性可能破坏VDR-PXR结合位点，同时引入EVI-1元素，从而可能影响基因表达和调节炎症反应。这些调控变化可以解释A等位基因与较高CAD易感性之间的关联。
与我们的发现一致，Ting等人发现CCL5 -403G/A的AA基因型使CAD风险增加三倍以上，相比于GG或GA个体（p = 0.012；OR = 3.063；95% CI = 1.231–7.624）。CCL5 -403的A形式被认为相对于G等位基因是CAD的风险等位基因（p = 0.037；OR = 1.377；95% CI = 1.019–1.859）。结果与其他研究一致，这些研究发现-403G/A的A等位基因与CAD独立于传统风险因素相关。然而，其他病例对照研究未发现此类关联。此外，一些研究表明CCL5 -403 A等位基因与较低的血清CCL5浓度相关，可能降低CAD风险。
In1.1T/C与CAD易感性和严重程度的关联
与-403G/A SNP相反，In1.1T/C变体未显示与总体CAD风险发展的显著关联。这表明In1.1T/C可能不在CAD的启动中发挥直接作用，但在疾病其他方面仍可能重要。我们的结果与其他研究一致，这些研究不支持CCL5 In1.1T/C多态性在心肌梗死遗传易感性中的主要作用。
在我们的研究中，In1.1T/C的C等位基因显著与更高的Gensini评分相关，特别是在共显性和隐性模型下（表4）。这意味着虽然In1.1T/C可能不是CAD发展的风险因素，但它可能在调节CAD患者的疾病严重程度中起作用。C等位基因与更高Gensini评分的关联可能是因为它影响诸如斑块负荷、冠状动脉狭窄或动脉粥样硬化进展等因素。这种遗传变异可能影响炎症过程或其他对CAD进展至关重要的通路，使携带者更容易出现疾病的严重表现。最近的研究提供了关于该多态性的TT基因型增加CCL5在T细胞中的表达的新见解，这可能增强Th1免疫。支持In1.1T/C SNP的调控意义的是，有人提出T到C的替换可能导致PAX2和ATATA结合元件的丢失，同时创建一个新的转录因子结合位点。这些调控变化可能影响CCL5基因表达，进而影响CAD患者中的炎症和疾病进展。然而，这一假设模型需要实验验证。
很可能CCL5基因SNPs调节CCL5趋化因子的分泌，从而影响浸润在动脉粥样硬化斑块中的CD4+ T细胞数量，这解释了本研究中发现的这些SNPs与CAD发生之间的关联。然而，关于CCL5血浆水平与心脏病之间关系的结果仍然存在争议，有正面和负面的结果。例如，Cavausoglu等人记录了低水平的血浆CCL5与心肌梗死后的心脏死亡相关。同样，Rothenbacher等人确定较低的血清CCL5水平与冠心病的进展和风险相关。另一方面，MONICA/KORA Augsburg病例队列研究建议CCL5在心血管风险中不起作用，该趋化因子的水平不影响动脉粥样硬化斑块中的免疫细胞行为。鉴于这些混合结果，很明显评估如CCL5等基因中的SNPs提供了比血清水平更稳定和可靠的疾病风险生物标志物，因为血清水平可能受到药物、饮食和生活方式因素的影响。
DM对遗传关联的影响
当将CAD患者队列分为糖尿病和非糖尿病时，In1.1T/C的C等位基因在糖尿病亚组中显著与CAD相关（表5）。这一发现尤为重要，因为它表明DM与遗传易感性之间的相互作用可能会提高患CAD的风险。DM是炎症、斑块稳定性和内皮功能障碍的已知驱动因素，这可能与In1.1T/C变体协同作用，增加DM个体中CAD的风险。
我们的研究结果还可能表明In1.1T/C多态性的C等位基因与糖尿病而非CAD更密切相关，因为在糖尿病CAD患者中观察到的遗传关联持续存在，但在非糖尿病CAD患者中消失（表5）。这表明该多态性可能在糖尿病相关的病理生理机制中发挥作用。然而，由于我们研究中的所有糖尿病患者都有CAD，因此需要在没有CAD的独立糖尿病队列中进一步调查，以澄清这种关联是否特定于糖尿病或反映糖尿病和CAD的联合效应。这强调了基因-环境相互作用的重要性，其中遗传易感性在其他风险因素（如DM）存在的情况下可能变得更加明显。与我们的结果高度一致的是，已有研究发现，患有终末期肾病的2型糖尿病患者携带CCR5 -403 A或In1.1 C等位基因的全因死亡风险显著更高，主要原因是心脏事件。
有趣的是，糖尿病和非糖尿病CAD患者与对照组相比，都与-403G/A显著相关，这表明该SNP可能是CAD的一般风险因素。最近的研究表明，CCL5 -403G/A多态性与沙特和俄罗斯人群中2型糖尿病风险增加相关。这可以通过CCR5调节下丘脑胰岛素信号传导，从而有助于全身胰岛素敏感性和葡萄糖代谢来解释。
DM对疾病严重程度（Gensini评分）遗传关联的影响
在糖尿病CAD人群中，In1.1T/C和-403G/A均与更高的Gensini评分显著相关（表6），表明更严重的疾病。支持遗传效应的是，值得注意的是，在糖尿病和非糖尿病CAD患者之间未检测到Gensini评分的显著差异（表2），这表明DM本身可能不会直接放大冠状动脉粥样硬化的严重程度。
在In1.1T/C中，CC基因型在所有遗传模型中均与最高的Gensini评分相关（表6），这表明该变体可能通过影响动脉阻塞的程度或疾病进展的速度来促成疾病严重程度。这可能是由于与DM特定机制的相互作用，如加剧的炎症或氧化应激。最近的研究强调了氧化应激和加剧的炎症在DM特定机制中的作用，特别是在血管并发症中。在DM患者中，高血糖可通过涉及晚期糖基化终产物（AGEs）、蛋白激酶C和己糖胺的途径诱导活性氧的产生，从而导致内皮功能障碍。AGEs与其受体的结合促进氧化应激，激活核因子κB等炎症通路，进一步损害血管系统。这些通路不仅恶化血管并发症，还与糖尿病共病相互作用，加剧心血管风险。
在-403G/A SNP中，AA基因型与糖尿病队列中更严重的CAD相关（表6），进一步支持了该变体影响疾病进展的观点。这些结果部分与Vogiatzi团队的研究一致，他们发现病例对象中CAD的严重程度（以每位患者平均病变血管数量表示）在-403 A纯合子中显著高于野生型纯合子和杂合子（2.9 vs. 2.2，p = 0.02）。
据我们所知，这是首次将可靠的CAD严重程度评分（如Gensini）与CCL5 In1.1T/C和-403G/A多态性关联起来的研究。最近对SNPs调控作用的研究已经确定，与这些基因相关的非编码区域可以调节基因表达，从而影响炎症级联反应。这可以改变CAD的风险或严重程度，特别是在患有其他健康并发症（如DM）的人群中。CCL5多态性也在具有类似炎症机制的其他疾病中进行了研究，如子宫内膜癌，其中DM和高血压的存在加剧了风险，以及神经退行性疾病如精神分裂症。这些发现强调了在CAD管理中考虑遗传特征的重要性，特别是对于同时患有代谢紊乱（如DM）的个体。
局限性和未来方向
尽管我们的研究为In1.1T/C多态性与CAD风险之间的关联提供了有价值的见解，但仍需承认几个局限性。首先，相对较小的样本量，尤其是在亚组分析（糖尿病与非糖尿病）后，可能限制了统计功效和我们发现的普遍性。C等位基因和CC基因型的低频率进一步导致比值比过高估计和置信区间宽泛，强调了需要更大、功效更强的研究来验证这些结果。其次，病例（58.2 ± 11.1岁）和对照组（34.6 ± 11.7岁）之间的显著年龄差异可能引入了偏倚，因为对照组可能包括具有CAD遗传倾向的个体，这些个体可能在晚年生活中发展出该病症。这种潜在的错误分类可能稀释了观察到的关联，特别是如果遗传效应微弱。未来的研究应考虑年龄匹配或统计调整以最小化这种混杂效应。最后，在各种比较组（例如，CAD患者与健康对照组，糖尿病CAD与非糖尿病CAD）和遗传模型（等位基因、共显性、显性和隐性）中进行多次测试增加了虚假发现的风险。虽然我们应用了适当的统计调整并谨慎解释了我们的发现，但我们建议未来的研究在独立队列中复制发现。此外，探索这些多态性的功能相关性并研究基因-环境相互作用可以提供关于其在CAD发病机制中作用的更深入见解。在未来研究中解决这些局限性将增强我们发现的稳健性和临床相关性。
总之，本研究强调了CCL5基因中的遗传变异，特别是-403G/A和In1.1T/C SNPs，在影响CAD风险和严重程度方面的重要性。虽然-403G/A似乎增加了患CAD的风险，但In1.1T/C在调节疾病严重程度方面起着关键作用，尤其是在DM个体中。这些发现为CAD预防和治疗的更个性化方法打开了大门。
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