图形摘要
Muralidharan及其同事通过人类死后前额叶皮质样本的单核RNA测序开发了细胞类型特异性转录组衰老时钟。这些时钟能准确预测年龄，并识别特定脑细胞类型的衰老轨迹。该方法还在阿尔茨海默病和精神分裂症中检测到加速衰老现象，为健康与疾病状态下的脑衰老差异提供了新见解。
1 引言
衰老涉及复杂的分子变化，最终导致包括大脑不同细胞类型在内的器官功能衰退。衰老是大多数神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的主要风险因素。然而，我们对不同脑细胞类型的衰老机制及其对疾病病理生理学的影响仍知之甚少。近年来开发的分子衰老时钟多基于批量组织数据，缺乏细胞类型特异性分辨率。本研究通过单核RNA测序（snRNA-seq）分析31名18-94岁捐献者的前额叶皮质组织，建立了人类脑细胞类型特异性转录组衰老时钟，并验证了其在阿尔茨海默病和精神分裂症数据集中的应用价值。
2 结果
2.1 衰老队列的单核RNA测序
研究分析了31名捐献者的腹外侧和背外侧前额叶皮质样本，涵盖年轻（18-39岁）、中年（40-59岁）和老年（60+岁）群体（图1）。中位死后间隔时间为4.5小时，样本性别均衡。经质控后获得73,941个高质量细胞核，鉴定出少突胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质祖细胞（OPCs）、小胶质细胞、抑制性神经元和兴奋性神经元等19个细胞簇。所有主要细胞类型在各年龄组中均有代表性。
2.2 小胶质细胞和星形胶质细胞的转录组衰老变化
差异基因表达分析显示：老年组小胶质细胞中炎症反应基因（如FOXP1、TLR2、CD163）显著上调，而稳态标志物CX3CR1、P2RY12、P2RY13下调（图2）。基因富集分析证实炎症反应通路的激活，这与既往小胶质细胞衰老研究一致。星形胶质细胞中反应性星形胶质化相关基因（TPST1、SAMD4A、CNN3、STAT3、SORBS1）表达增加，且蛋白质错误折叠通路富集，这与衰老大脑的炎症特征相符。
2.3 细胞类型特异性转录组衰老时钟的开发与评估
使用ElasticNet回归模型，基于73,941个细胞核构建了六种主要细胞类型的衰老时钟：单细胞、简单伪批量和自举伪批量方法。结果显示：
- 单细胞时钟相关系数0.74-0.83（MAE 10.2-12.2年）
- 自举伪批量时钟相关系数0.78-0.89（MAE 8.5-11.2年）
- 简单伪批量时钟表现较差（相关系数低至0.4）
进一步验证显示：神经元水平（相关系数0.9，MAE 8年）和胶质细胞水平的非细胞类型特异性时钟同样具有预测能力，但自举伪批量方法更优。
2.4 时钟基因揭示生物学相关的衰老通路
特征基因分析显示：
- 小胶质细胞时钟基因富集炎症反应通路（如SLC1A3、FOXP1、MS4A6A）
- 少突胶质细胞和星形胶质细胞时钟基因富集突触传递相关通路
- 兴奋性神经元时钟中突触传递基因表达上调
- FKBP5（所有时钟共有基因）表达与年龄呈正相关（r=0.7）
2.5 独立单核RNA测序数据集的验证
在Fröhlich等（2024）和Velmeshev等（2023）的独立数据集中：
- Fröhlich数据集：自举伪批量时钟相关系数0.56-0.78
- Velmeshev数据集：单细胞时钟相关系数0.15-0.3
- 表达谱差异分析显示：训练集基因表达覆盖率（95-100%）高于Velmeshev数据集（52-85%）
2.6 神经系统疾病的衰老加速现象
在精神分裂症数据集中，除小胶质细胞外的所有细胞类型均显示显著年龄加速（图5a）。阿尔茨海默病（Gabitto et al, 2024）数据集中，少突胶质细胞和小胶质细胞时钟显示显著加速（图5b），这与其他细胞类型的非显著加速趋势形成对比。
3 讨论
本研究构建的高质量snRNA-seq数据集首次实现了人类大脑主要细胞类型的转录组衰老时钟开发。与批量组织分析相比，单核测序具有更高的细胞分辨率。虽然单细胞时钟在训练集中表现优异，但在独立数据集中的性能差异提示需要优化：
- 统一组织处理标准
- 增加不同族群样本量
- 提升细胞亚型分辨率
研究发现精神分裂症患者几乎所有细胞类型均存在衰老加速，而阿尔茨海默病主要表现为少突胶质细胞和小胶质细胞特异性加速，这提示需要开发更高分辨率的细胞亚型特异性时钟。
4 实验方法
伦理声明
研究遵循赫尔辛基宣言和匈牙利医学研究伦理规范，获得匈牙利卫生部和区域伦理委员会批准（IV/2627-1/2021/EKU）。
snRNA-seq分析
使用Cell Ranger 7.0.0（RRID:SCR_017344）进行序列比对，通过Seurat v4.3.0（RRID:SCR_016341）进行数据分析。筛选标准：读数1,200-100,000，基因数800-12,000，线粒体转录<5%。使用Harmony v0.1.1（RRID:SCR_022206）整合数据，通过scDblFinder v1.13.10（RRID:SCR_022700）去除双细胞。
衰老时钟模型
基于ElasticNet回归模型（Glmnet算法），使用35,578个基因特征训练单细胞和伪批量时钟。采用5折交叉验证防止数据泄露，最终选择α=0.5模型。
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