摘要
神经退行性疾病早期即出现脑血管功能障碍，但血管结构、血脑屏障(BBB)损伤与认知功能之间的联系仍不明确。利用VesselPro——一种整合灌注解析3D成像与空间蛋白质组学的全脑分析管道，我们绘制了小鼠寿命期间的血管老化图谱。我们识别出两种离散轨迹：一种低血管状态和一种新发现的、相对于年轻成年血管基线定义的高血管化、血脑屏障受损状态。这种高血管化轨迹集中于皮层和海马体，与明显的空间记忆障碍和广泛的血脑屏障渗漏相关。空间蛋白质组学揭示了一个涉及血管生成激活、内皮应激、细胞骨架重塑和炎症信号传导的协调程序。与英国生物银行(UK Biobank)人类蛋白质组生物标志物的跨物种比较显示，小鼠高血管化特征与血管性痴呆风险高度一致，但与阿尔茨海默病相关性微弱，定义了一种血管特异性痴呆内型。通过AKB-9778短暂激活Tie2信号通路可减弱这种轨迹，改善血管组织、血脑屏障完整性和记忆表现。我们的发现表明内皮不稳定性是这一异质性血管老化状态的关键机制驱动因素。
亮点
• VesselPro：我们开发了一种用于"捕获脑中灌注血管"的管道：血管老化中意外的二分现象，包括传统低血管状态和一种新的"高血管化、血脑屏障受损状态"。
• 高血管化病理：将皮层和海马体中的高血管化特征与"空间记忆障碍、广泛的血脑屏障渗漏"和"血管生成炎症信号"联系起来。
• 临床内型：通过"英国生物银行"进行跨物种分析证实，这种高血管化特征与"血管性痴呆"风险一致，而非阿尔茨海默病。
• 药理学稳定：证明了"Tie2信号激活(AKB-9778)"可改善血管组织、血脑屏障完整性和记忆表现。
引言
脑血管功能障碍是血管性认知障碍和血管性痴呆(VaD)的主要驱动因素，直接导致认知能力下降，与β-淀粉样蛋白斑块和tau神经原纤维缠结无关[1,2]。最早可检测到的血管变化之一是血脑屏障(BBB)的破坏，这是调节血液与神经组织之间分子交换的内皮界面[3,4]。人类成像、生物标志物和尸检研究表明，在脑小血管疾病、轻度血管性认知障碍和VaD中存在BBB渗漏，甚至在具有高血管风险的认知正常个体中也存在[5,6]。BBB破裂与内皮功能障碍、周细胞损失和小血管疾病标志物相关[7,8]，并预测认知能力下降[9]，确立BBB破坏作为血管性痴呆的核心病理机制和新兴生物标志物。矛盾的是，早期脑血管功能障碍可能表现为区域性高灌注。MRI和PET研究已报道在阿尔茨海默病(AD)和轻度认知障碍(MCI)中的海马和颞叶回路中出现流量增加[10-12]，以及在血管驱动的脑病理中，如血管性认知障碍和脑小血管疾病，其中毛细血管功能障碍、流量异质性和血脑屏障损伤是核心特征。这些发现在衰老和血管扰动的实验模型中也得到复制[13]，表明增加的灌注和血管重塑是人类血管性脑病理的反复特征，尽管其结构基础、分子调控和功能后果仍知之甚少。这种高灌注最初可能代表代偿机制[14]，但会增强血管应激并促进炎症和BBB渗漏，加速神经退行性变[15]。
年龄相关的血管病理还包括异常重塑[16-18]。虽然血管生成可能恢复灌注[19]，但新形成的血管往往结构不成熟且渗漏[20]。血管密度增加是缺氧状态(28-30)的典型反应，在阿尔茨海默病(AD)中易受损伤的海马区域也观察到[21,22]。血管内皮生长因子(VEGF)驱动的血管生成信号在缺氧和神经炎症疾病中经常升高[23-26]，并通过削弱紧密连接、增加细胞旁通透性和改变内皮细胞骨架耦合来损害BBB完整性[27-34]。这些观察表明，脑血管老化可能涉及异质性重塑过程，无法仅通过平均趋势完全捕捉。值得注意的是，在青年期，脑血管组织表现为紧密调控、稳态的血管结构，个体间变异很小。衰老可能不会简单地均匀移动这一基线，而是使其不稳定，使不同个体出现不同的血管结果。然而，现有方法无法解析这些潜在的轨迹。宏观神经成像模态要么缺乏足够的分辨率，要么缺乏足够的脑覆盖[35]，而微CT铸造[36]无法分析屏障通透性和分子状态。光学透明化技术可实现3D血管成像[37-40]，但通常需要去除血液，无法可靠保留BBB示踪剂；保留血液的变体[41]尚未应用于衰老研究，其中细胞外基质失调[42]进一步使染色复杂化。因此，目前没有一种方法能同时映射整个脑的灌注微血管、BBB完整性和分子重塑。
为克服这些限制，我们开发了VesselPro，一种全脑管道，结合灌注解析(具有活性循环的血管)3D血管成像、定量BBB映射和相同标本内的空间蛋白质组学。通过在标准化透明化和成像条件下整合灌注解析血管测量与结构指标和分子谱型，该方法最小化了技术变异性。它能够区分生物血管状态和处理相关伪影，为系统分析脑血管老化提供可扩展和可重复的框架。这种综合框架能够对个体间血管变异性进行无偏量化，使我们能够确定与衰老相关的异质性是否反映了一个围绕保留的生理基线的均匀连续体，或是由于年轻成年血管状态分解为具有不同认知后果的离散、机制不同的表型，以及通过靶向内皮稳定测试血管状态、BBB完整性和认知功能之间的因果联系。
结果
量化衰老小鼠脑中灌注血管、血脑屏障完整性和空间蛋白质组重塑的全脑管道
为捕获脑血管老化中的结构和功能变化，我们建立了一个针对衰老脑分析优化的多模态管道。该工作流程整合了无偏见的功能灌注脑血管映射[43]、光学组织透明化和空间蛋白质组学[44]，在单一实验框架内对成年和衰老C57BL/6小鼠(6-30个月)的同一队列进行综合结构和分子谱型分析。VesselPro (图1a)结合高分辨率3D光片成像、自动血管量化、BBB渗漏映射(图1a')、以及区域特异性蛋白质组学，直接将血管架构与原位分子特征相关联。小鼠通过腹腔注射伊文思蓝(EB)以评估BBB通透性，随后接受小麦胚凝集素与Alexa Fluor 594偶联物的心内注射，标记活性灌注血管。大脑被取出、光学透明化，并使用荧光光片显微镜成像，以生成整个功能性脑血管的体积图。该方法提供了整个脑的功能性灌注血管网络的高分辨率可视化，包括毛细血管，产生用于死后分析的灌注固定单时间点快照(图1b)。实现了全脑尺度的选择性灌注血管量化，这是标准固定后染色无法做到的。3D数据集的自动分析产生了每个脑和区域的血管长度、分叉密度和拓扑特征。成像后，相同的大脑被重新水化并根据3D成像结果进行解剖。为识别出具有异常灌注血管长度或BBB渗漏的区域，通过DISCO-MS工作流程生成空间蛋白质组谱型。这种集成设计实现了灌注血管网络(图1c)、BBB完整性以及相同小鼠内相应区域蛋白质组的直接比较，提供了跨越大脑的结构、功能和分子老化特征的综合视图。
相同年龄的衰老小鼠分化为低血管和高血管脑表型
使用VesselPro生成的全脑灌注图，我们发现12个月和24个月队列中灌注血管长度在脑区中表现出明显的区域性和年龄依赖性个体间变异性增加。6个月小鼠在脑区中表现出狭窄的单峰分布的血管长度，表明年轻成年血管基线稳定且同质。与围绕年轻成年参考形成连续分布不同，老年动物聚集到两个基于灌注血管长度的截然相反极端(图1d)，主要由微血管(定义为具有一到三个体素半径，≤15 μm的血管)驱动(图1e)。血管长度减少的亚组与经典的血管稀疏化一致。相比之下，第二个亚组表现出明显增加的血管长度。为客观评估这种异质性，我们应用了多种无监督聚类方法(Agglomerative Clustering, BIRCH, Gaussian Mixture Models, Mini-Batch KMeans, OPTICS, Ward's method)，所有方法都一致地根据全脑灌注血管长度将24个月龄的老年脑分为两个可重复的组(图1d)，在老年小鼠中没有发现稳定的中间血管状态。这些结果表明衰老与年轻成年血管稳态的丧失相关，导致相同日历年龄小鼠间脑血管组织的显著异质性。此外，高分辨率成像揭示了在衰老动物中，皮层分支点前大表浅血管的盘绕(图1f)；这种形态特征的功能意义尚不清楚。
高血管化脑表现出区域性血管重塑
为确定24个月龄动物间血管异质性的解剖学基础，我们进行了区域特异性分析，将血管长度和分叉密度与6个月龄(6mo)小鼠进行比较，后者在全脑水平上表现出均匀的血管化特征。与6个月龄相比，在24个月龄低血管化亚组(24mo-Lo)中，我们在19个脑区识别出灌注血管长度一致且统计显著(p<0.05)减少，主要位于皮下结构、下丘脑核和小脑(图2a)。血管分叉密度模式的平行分析显示，这19个区域中有15个也表现出分叉密度显著降低(图2b)，表明这些区域中灌注血管丰度和网络复杂性均出现协调减少。相反，高度血管化的24个月龄亚组(24mo-Hi)在34个不同脑区表现出血管长度和分叉密度的广泛显著增加，主要位于大脑皮层、海马形成和小脑(图2c-d)。值得注意的是，36个区域表现出升高的分支复杂性，与活跃的血管重塑一致。
代表性血管化模式和定量分析来自躯体感觉皮层、海马形成和下丘脑，如图2e-g所示。对每个脑区进行了稳健线性回归分析，以检查三个组(6mo、24mo-Hi和24mo-Lo)中灌注血管长度和分叉密度之间的关系(图2h)。我们在青年组中观察到这些血管参数之间的强耦合(R²=0.95)，与稳态、良好调控的血管架构一致。有趣的是，24mo-Hi中发现了最高的耦合(R²=0.97)，表明血管丰度和网络复杂性之间甚至更紧密的关系，可能反映在结构受限的血管网络中增强或持续的重塑活动。相比之下，24mo-Lo显示较低的相关性(R²=0.87)，表明灌注血管长度和分叉密度的相对解耦。由于均匀组织缩放预计将保持血管指标之间的比例关系，这种改变的耦合反驳了全局处理效应，而是指向亚组特异性微血管拓扑的重组。除血管长度和分叉密度外，24mo-Hi与6mo脑和24mo-Lo相比，表现出更高数量的闭合微血管环(图2i)。
不同的分子程序定义了不同的血管表型
为研究与这些血管特征相关的分子谱型，我们重新水化脑组织样本，并对24mo-Lo或24mo-Hi小鼠血管网络(血管长度和分叉密度)显示最显著变化的主要脑区进行了全脑和蛋白质组谱型分析(图3a)。我们首先询问血管表型是否与脑蛋白质组成的全局差异相关。脑蛋白质组的主成分分析(PCA)显示6mo、24mo-Hi和24mo-Lo样本的明显聚类，集群间重叠最小，表明这些组间存在显著的蛋白质表达谱差异(图3b)。与6个月龄小鼠的脑蛋白质组相比，24mo-Hi表现出比24mo-Lo显著更多的显著失调蛋白质(图3c,d和图S1)。选择海马体(HC)和躯体感觉皮层(SS)进行深入分子分析，因为我们在这些区域检测到数量最多的显著改变蛋白质。对24mo-Hi和24mo-Lo亚组(与6mo相比)海马体和SS区域十个最显著改变的血管相关蛋白质的分析表明，区域特异性表达模式清晰，衰老亚组间无重叠，表明血管拓扑与脑区的特定蛋白质组特征相关。
为在生物功能层面解释这些差异，我们随后进行了基因本体论(GO)富集分析，揭示了连接血管重塑、神经元发育和细胞应激反应的协调生物过程网络：与血管发育、血管生成以及血管大小和循环调节相关的过程，以及神经发生、神经元投射形态发生和突触组织。GO术语还包括细胞粘附、迁移、细胞骨架组织和蛋白质磷酸化。也观察到凋亡和自噬途径的富集。24mo-Hi和24mo-Lo小鼠富集生物过程的定量比较显示，高血管化与30个以上比率为1的生物学过程的广泛上调相关。相比之下，24mo-Lo仅显示五个过程超过此阈值(图3e)。
最后，为直接将分子变化与血管架构联系起来，我们检查了跨脑区的单个蛋白质表达水平与血管指标之间的相关性。对每个蛋白质，计算了丰度水平与五个血管参数之间的相关系数：血管长度、微血管长度、分叉密度、微血管中分叉密度和平均血管半径。将强关联定义为|r|>0.9。然后基于方向性将蛋白质分为仅正相关、仅负相关或混合正负相关，并用圆形图表表示，按解剖区域(海马体和躯体感觉皮层)展示蛋白质-血管相关性的分布，适用于6个月龄小鼠和24个月龄高或低血管化的小鼠(图3f)。在年轻动物的这五个参数中，平均血管半径与海马体和躯体感觉皮层中蛋白质水平的关系最强。相比之下，在衰老小鼠脑中，与其他形态特征的相关性变得更加均匀分布，与各参数的相关数量相当。值得注意的是，24mo-Hi小鼠的海马体显示出最多的蛋白质-血管关联，几乎是年轻小鼠海马体的八倍。相比之下，24mo-Lo的SS表现出最显著数量的关联。我们的结果表明，衰老和血管化水平强烈影响跨脑区蛋白质表达与血管指标之间的关系，海马体在24mo-Hi小鼠中显示出最显著的变化。
高血管化轨迹与BBB渗漏和空间记忆障碍相关
为研究观察到的与血管架构相关的年龄相关差异是否与认知表现相关，我们在6个月和24个月龄小鼠中进行了行为测试。使用巴恩斯迷宫(BM)评估空间记忆，使用高架十字迷宫评估焦虑相关行为，并使用旋转杆测试评估运动协调。在牺牲前，采集血浆用于细胞外囊泡(EV)的分子谱型分析，大脑则使用VesselPro处理(图4a)。EV制备避免了血浆的高动态范围，富集组织特异性信号货物，提高了对神经血管健康低丰度标志物的检测灵敏度[45]。虽然24个月龄小鼠在焦虑样行为方面没有差异，并且与6个月龄对照相比运动表现显著下降(图4b,c)，但在老年队列内空间记忆表现出现了显著分化。具体而言，一个老年小鼠亚组在巴恩斯迷宫中主要使用目标导向(靶向)搜索策略，随机策略的使用频率约为随机策略的两倍，并能迅速找到逃生孔。相比之下，另一个亚组表现出受损的记忆表现，其特征是随机搜索策略的使用频率几乎是随机策略的三倍，并且无法在给定时间内找到逃生孔。基于这种行为差异，老年小鼠被分为认知受损和未受损组(图4d)。各组之间到达目标的时间和距离的比较显示，认知受损的亚组比6个月龄组和认知未受损的老年亚组花费更多时间并行进更长距离(图4e)。
重要的是，灌注脑微血管的定量分析显示，认知受损亚组表现出高血管化表型(图4f)，类似于24mo-Hi亚组(图1d)。微血管对24个脑区中受损组和未受损组之间的长度差异有贡献(图4g)，特别是在对空间记忆编码至关重要的皮层和海马区域(图4g')。因此，记忆受损与记忆相关网络中微血管长度的增加相关。
为确定高血管化状态是否伴有BBB功能障碍，我们量化了伊文思蓝(EB)外渗。将血管掩模应用于EB通道，并量化了距灌注血管边界同心径向壳(2、4和6像素)中的EB荧光强度(图1a')。将实质与血管内信号归一化实现了屏障完整性的3D映射。这些分析显示认知受损亚组存在显著BBB渗漏。与6mo小鼠相比，认知受损的24mo小鼠在50%分析的脑区中显示出渗漏。相比之下，未受损的老年小鼠仅在14%的区域中显示渗漏(图4h)。未受损的老年亚组在13个区域(包括皮层、海马和丘脑)以及小脑干中表现出显著升高的EB积聚(图4i)。我们在显示灌注微血管增加的脑区和那些显示BBB渗漏的脑区之间观察到部分重叠(六个区域)(图4j)，证明高血管化重塑和屏障失效之间存在空间对应，包括参与记忆处理的关键区域，如皮层和海马区域(图4i')。
为从正交角度了解衰老小鼠中血浆蛋白质组的分子组成，我们开发了一种简化和缩放的Mag-Net版本[45]，用于从血浆中富集带负电荷的粒子，即Nano-Mag-Net。血浆EV蛋白质组学鉴定出93个上调和47个下调蛋白质。STRING DB表明62个上调和27个下调蛋白质在脑组织中表达(图4k)。GO富集分析揭示了包括细胞粘附和先天免疫反应在内的几个生物过程的失调(图4l)。过表达分析(ORA)将这些特征与"记忆丧失"和"健忘"等人脑疾病概念联系起来(图4m)。STRING网络分析识别出一个密集互连的蛋白质簇，其中App、Mapk3、Tuba4a、Itm2b、Csf1r、Egfr上调，而Agt、Mapk1和Rac1下调(图4m',m")。这些系统特征与伴随高血管化、BBB渗漏表型的内皮应激和炎症激活一致。
为评估与高血管化、认知受损表型相关的血浆EV特征的转化相关性，我们进行了跨物种分析，将我们的小鼠数据与英国生物银行(UKB)的人类血浆蛋白质组学进行比较。我们检查了在高血管化、认知受损的老年小鼠中失调的蛋白质是否与人类痴呆相关特征匹配。使用UKB Olink数据，我们应用Cox比例风险模型(经年龄和性别调整)来识别与全因痴呆(ACD)、血管性痴呆(VaD)和阿尔茨海默病(AD)相关的蛋白质。分析仅限于具有足够病例数的蛋白质。我们将转化"匹配"定义为在人类中具有统计学显著关联(p<0.05)且方向性一致(即在两个物种中均升高或降低)的蛋白质(图4n，饼图)。在ACD分析中，65个显著相关蛋白质在物种间共享；其中23个(35%)显示方向性一致(图4n，左)，表明高血管化小鼠特征反映广泛的痴呆相关模式。与VaD的最显著一致性：在38个显著共享蛋白质中，27个(71%)表现出匹配的方向性(图4n，右)。相比之下，与AD的重叠更为有限，27个显著蛋白质中仅有7个(26%)显示方向性一致(图S2a)。这些发现共同表明，衰老小鼠中的高血管化、BBB渗漏表型与人类血管性痴呆的系统蛋白质组特征密切相关，但与阿尔茨海默病无关，将这一轨迹识别为VaD样分子内型。
Tie2通路激活逆转认知和屏障功能障碍并恢复灌注血管长度
基于在认知受损、衰老小鼠中观察到的BBB通透性、与记忆障碍相关的高血管化以及升高的循环血管炎症标志物，我们测试了药理学稳定内皮是否能恢复血管完整性和认知表现。我们使用AKB-9778，一种小分子血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶(VE-PTP)抑制剂，可激活Tie2信号通路以增强内皮稳定性。18个月龄小鼠首先完成基线巴恩斯迷宫(BM)测试，然后返回笼中进行为期八周的衰老期。动物被随机分配接受AKB-9778或载体治疗(4天，每天两次皮下注射)。治疗后，小鼠重新训练并在BM中重新测试。在治疗前和最终时间点采集血浆；大脑被收获用于使用VesselPro进行血管和BBB分析(图5a)。
与基线和载体治疗对照相比，AKB-9778治疗小鼠表现出显著改善的空间记忆(图5b)。治疗动物主要使用目标导向(靶向)搜索策略，找到逃生孔的潜伏期更短(图5c,图S2b)。载体治疗小鼠从基线无变化。
VesselPro分析显示，与载体治疗的衰老对照相比，AKB-9778治疗动物表现出灌注血管长度减弱(图5d)，类似于之前队列中认知未受损的衰老动物(图4f)。这种效应主要由微血管驱动(图5e)，在42个脑区中显示出异质模式(图5e')。EB映射显示治疗后BBB完整性显著改善，渗漏仅限于4.2%的脑区，类似于6个月龄小鼠，明显低于6个月龄脑，并与未经治疗的衰老小鼠中广泛渗漏形成鲜明对比(图5f)。与载体组相比，AKB-9778治疗导致47个脑区的BBB渗漏减少(图5f')。24个脑区同时表现出灌注血管长度减少和BBB渗漏减少(图5g)。
有趣的是，在几个脑区中，我们发现血管表现出开放血管段比例增加(图5h)，这可以解释微血管长度减少的同时中尺度血管比例增加。
血浆细胞外囊泡的Nano-Mag-Net分析显示，AKB-9778治疗减少了几种由STRING DB指示的脑表达标志物(图5i)。这包括脑内皮特异性蛋白Flt4(Vegfr-3)和Cdh5(VE-cadherin)，以及脑壁细胞相关蛋白Anpep、Pdgfrb和Lama1(图5j)。先前对同一小鼠品系的研究表明，AKB-9778治疗增加了神经血管中的这些蛋白(图5k)[46]。
基因集富集分析(GSEA)显示，改变的蛋白水平与包括"记忆障碍"统一医学语言系统(UMLS)概念在内的几种记忆和脑血管相关疾病相关，涉及17个蛋白(图5l)。STRING DB分析识别出一个由13个蛋白组成的紧密互连网络，其中App和Tgf-β1位于中心位置。该网络中的所有蛋白在AKB-9778治疗后均下调，如节点颜色所示(对应于火山图中的类别)(图5m)。
此外，从时间分辨蛋白质组学数据中，我们发现与血管生长和屏障完整性相关的标志物(Add1、Agt、Timp3、Tgfrb3、Sphk1、Thbs1、F11r、Gpld1、Itgb1)在载体治疗组中升高，与病理性高血管化和脑通透性增加一致。相比之下，药物治疗减弱了它们的水平(图5m')。
这些发现共同表明，短暂的Tie2激活足以减弱高血管化和BBB渗漏表型及其相关的认知缺陷，这与内皮不稳定性作为这一衰老轨迹的关键驱动因素一致。
讨论
脑血管老化不遵循统一的下降：相同日历年龄的小鼠分离成具有不同功能结果的低血管和高血管化两种截然不同的轨迹。这些轨迹是相对于共享的年轻成年血管基线定义的，从而突显了老年个体间不同的血管结果。这种分离得到了全脑血管长度指标、区域映射和聚类分析的支持。
这里识别的高血管化表型在人类中并非没有先例，因为在血管驱动的脑病理中，包括血管性认知障碍和脑小血管疾病，已报告了区域性高灌注和血管重塑。短暂激活Tie2通路减弱了高血管化、BBB渗漏和高灌注相关的血管状态，并改善了认知表现，支持内皮不稳定性是这一衰老轨迹的因果驱动因素。
先前的全脑和区域特异性成像研究报道，衰老通常与血管稀疏化伴随血管直径和扭曲度增加相关。我们的发现通过揭示被总体平均分析掩盖的显著个体间异质性扩展了这些观察。虽然我们队列中的一部分老年动物表现出与血管稀疏化一致的预期低血管表型，但另一部分则表现出明显的高血管化重塑，其特征是灌注微血管长度和网络复杂性增加。因此，血管损失和扩张代表了脑血管老化的普遍结果，而高血管化重塑则是一种与BBB功能障碍和认知障碍相关的替代表型。
在分子水平上，高血管化小鼠显示出与血管生成、细胞骨架重塑、细胞粘附和应激信号传导相关的通路富集，与激活且结构不稳定的内皮一致。血浆EV蛋白质组学反映了这些发现，揭示了与系统性血管应激一致的内皮、壁细胞和炎症标志物。虽然在人类组织中尚未系统量化全脑结构高血管化，但高血管化、BBB受损状态的血浆特征与人类血管性痴呆风险强烈一致，并与阿尔茨海默病标志物显示出较弱的一致性，将这种表型识别为VaD样分子内型，而非神经退行性疾病的通用特征。
尽管我们的横断面衰老数据没有解决血管重塑和BBB功能障碍的时间顺序，但急性Tie2激活同时调节血管状态、屏障完整性和认知的能力限制了它们的因果关系。它支持内皮去稳定化作为共同的上游驱动因素。尽管如此，我们的研究存在局限性，包括使用单一小鼠模型、横断面设计，以及仅限于海马依赖性记忆的行为测试；也未评估性别特异性效应。虽然当前实施在单个时间点捕获血管状态和BBB完整性，但要直接解析血管重塑和屏障功能障碍之间的时间关系，需要纵向扩展。候选通路的直接因果联系将需要靶向扰动。
未来工作应纵向跟踪血管轨迹，并整合人类成像和血浆分析以验证和完善这些发现。
总之，脑血管老化遵循具有不同结构、分子和功能特征的离散轨迹。通过整合全脑血管成像、空间蛋白质组学和内皮扰动，我们识别出一种可损害认知并能通过稳定内皮急性逆转的适应不良高血管化、BBB渗漏状态。这些结果为理解异质性血管老化提供了机制框架，并强调内皮稳定性是晚年神经血管健康的核心调节器。
作者贡献
M.I.T.设计并执行了大部分实验并分析了数据；K.T.V.、D.P.M.、S.K.、R.M.、J.M.、M.A.、L.Z.、A.N.、J.C.P.执行了实验并分析了数据；L.L.为本研究提供了关键材料；H.S.B.、M.S.、M.K.G.、M.D.、F.H.和A.E.对研究设计和手稿写作提供了关键输入；A.E.发起并协调了研究，并与M.I.T.和F.H.一起撰写了手稿；所有作者阅读并修改了手稿。
竞争利益
A.E.是Deep Piction的联合创始人。其他作者声明无竞争利益。
材料和方法
动物和饲养
所有实验均使用从Janvier Labs(法国)获得的雄性C57BL/6小鼠进行。小鼠在脑卒中和痴呆症研究所的动物设施中饲养，置于独立的通风高效微粒空气过滤笼中(12小时明暗循环，自由获取食物和水)。组织在平行时间段内收获。
实验设计
该研究在三个主要队列中进行：
表型队列：使用6、12和24个月龄的小鼠进行血管表型的初始发现，补充了少数达到30个月龄的幸存者。大脑通过VesselPro管道处理，用于3D血管成像，随后进行空间蛋白质组分析。
认知队列：6个月和24个月龄小鼠接受了行为测试(巴恩斯迷宫、高架十字迷宫、旋转杆)。行为后，采集血浆，大脑通过VesselPro管道处理，以将血管指标和BBB完整性与认知表现相关联。
干预队列：18个月龄小鼠首先接受基线巴恩斯迷宫测试，随后采集血浆。经过8周衰老期后，小鼠被随机分配接受Tie2激活剂AKB-9778或载体对照。AKB-9778(MedChem, Cat# HY-109041)溶解在无菌DMSO和Mygliol中。小鼠每天两次皮下(s.c.)注射10 mg/kg AKB-9778或载体DMSO，持续4天。治疗一天后，小鼠重新训练并在巴恩斯迷宫中重新测试，采集血浆，大脑通过VesselPro管道处理。
行为测定
巴恩斯迷宫测试
巴恩斯迷宫用于评估BL6小鼠在两种条件下的学习和记忆缺陷：(i)24个月与6个月年龄比较，(ii)18个月龄小鼠接受AKB-9778或载体治疗后。空间记忆使用先前发表的缩短巴恩斯迷宫方案评估，略有修改[47]。小鼠完成三个测试阶段：习惯化(第1-2天)、训练(第2天)和探测试验(第3天)以评估短期记忆。所有小鼠在每次测试前在测试室中适应1小时。在习惯化过程中，小鼠被放置在迷宫中心的玻璃烧杯下30秒。然后缓慢引导到目标孔，引导小鼠进入逃生笼10-15秒。到达目标孔后，小鼠在逃生笼中停留1分钟，然后返回到保持笼中。每只小鼠总共完成三次习惯化(第1天下午两次，第2天上午一次)。训练时，小鼠被放置在迷宫中心的玻璃烧杯下30秒。之后移除烧杯，允许小鼠探索迷宫最多3分钟。如果小鼠找到目标孔并进入逃生笼，则允许其在笼中停留1分钟后再返回到保持笼中。如果它未能找到逃生孔，则使用烧杯引导它；如果它在引导1分钟后仍不进入，则用烧杯轻推；如果仍不进入，则手动放入逃生笼并在笼中停留1分钟后返回到保持笼中。探测试验时，小鼠被放置在迷宫中心的玻璃烧杯下30秒，然后允许探索迷宫3分钟。试验结束时，小鼠返回到保持笼中。到达目标孔的潜伏期和路径长度被记录并量化为空间记忆的主要测量指标。
旋转杆
使用旋转杆测试评估运动协调和平衡。在性能测试前两天，小鼠接受训练。第1天，小鼠完成两次恒定低速(5 rpm)试验，随后进行三次加速方案试验(5-30 rpm，300秒)。第2天，小鼠接受三次额外的训练试验，使用相同的加速方案(5-30 rpm，300秒)。这些环节旨在让动物熟悉设备，减少因新奇或焦虑导致的变异性。第3天，使用加速速度方案(5-30 rpm，300秒)评估运动性能，进行三次试验。每次试验中，从旋转杆上跌落的潜伏期被记录为主要结果指标。对于每只小鼠，计算三次测试试验的平均潜伏期并用于统计分析。
高架十字迷宫
使用高架十字迷宫(EPM)评估焦虑样行为，该设备是一个十字形平台，由两个开放臂和两个封闭臂组成，距地面50-60厘米高。测试前，小鼠在行为测试室中适应1小时。在测试过程中，每只小鼠被放置在迷宫中心的玻璃烧杯下30秒。然后允许小鼠自由探索迷宫5分钟。记录在开放臂与封闭臂中花费的时间，作为焦虑样行为的主要测量指标。
VesselPro管道：灌注、透明化和成像
灌注功能性脑血管和BBB渗漏的荧光标记
为评估BBB通透性，小鼠通过腹腔注射(i.p.)伊文思蓝(EB)染料(2%生理盐水，4 ml/kg)，在牺牲前12小时进行。小鼠使用咪达唑仑+美托咪定+芬太尼(腹腔注射；1 ml每100 g体重；5 mg、0.5 mg和0.05 mg每kg体重)深度麻醉，并打开胸腔进行心内注射，注射含小麦胚凝集素(WGA)与AlexaFluor 594偶联物(Thermo Fisher Scientific, W11262)0.25 mg/ml的150 μl PBS(pH 7.2)以标记功能性灌注血管。颈椎脱位后取出大脑，放入含4% PFA的5 ml管中6小时。
光学组织透明化
使用改良的3DISCO协议[48]对大脑进行光学透明化。简而言之，将它们浸入四氢呋喃(THF)梯度(50%、70%、80%、90%、100%水体积)中，室温下每个浓度12小时，然后二氯甲烷(DCM)中12小时以脱脂，最后在折射率匹配溶液BABB(苯甲醇+苯甲酸苄酯1:2比例)中至少24小时直至透明。每个浸渍步骤均在实验室摇床上进行。
光片荧光显微镜
使用配备浸入式校正浸没帽的4×物镜镜头(Olympus XLFLUOR 340)安装在LaVision UltraII显微镜上，耦合到白光激光模块(NKT SuperK Extreme EXW-12)进行成像。图像以16位深度和XY轴上1.625 μm/体素的标称分辨率捕获。脑血管通过Alexa Fluor 594(使用580/25 nm激发和625/30 nm发射滤光片)和伊文思蓝荧光染料(使用640/40 nm激发和690/50 nm发射滤光片)顺序可视化。我们为每个染料独立优化激发功率，使主要血管中的最强信号不超过相机的动态范围，从而最大化每个染料的信噪比(SNR)，避免当仅使用单通道时不同尺寸血管的饱和。为减少由于光束的高斯形状引起的失焦，我们每平面和侧面使用12步光片焦点位置顺序移动。扫描使用网格平铺进行，X和Y方向上有20%的重叠，以包含整个组织。在Z维度上，我们以3 μm步长使用左右两侧照明获取切片图像。
图像处理和量化
3D血管分析
使用TeraStitcher的自动全局优化功能(v1.10.10)进行3D数据重建。为将数据集注册到参考图谱，我们使用平均模板、注释文件和Allen小鼠脑通用坐标框架(CCFv3)[49]的本体描述。使用我们之前建立的血管分割和分析管道(VesSAP)[43]检测和量化脑血管。定量指标包括归一化到全脑体积的总血管长度、归一化到脑区体积的区域血管长度、分叉密度(归一化到区域体积的分支点数量)和血管半径。所有测量均通过常数因子校正，以考虑固定和透明化引入的组织收缩。使用Imaris 9.9(Oxford Instruments)制作3D渲染。
血管环检测
我们的分析基于先前发表并建立的血管图提取和分析管道[50]，该管道结合图提取[51]与后续的图修剪和特征合并后处理步骤。为评估和统计量化血管拓扑，我们通过实现进一步的处理步骤扩展了该管道。为此，我们使用PyTorch Geometrics[52]和NetworkX[53]框架将提取的图转换为无向图表示。在该无向图中，节点对应血管分叉，而边构成血管段。首先，我们通过修剪血管段预处理图，过滤掉短于5个体素的段，随后移除孤立节点和自环。最后，我们通过计算图的循环基，即形成循环空间基础的最小循环集合，来识别血管环，使用NetworkX中的实现。然后过滤检测到的循环，只保留包含3到15个血管段(边)的循环。
BBB渗漏量化
BBB渗漏分析是通过生成围绕血管分割掩模的三维同心壳，壳距离分别为2、4和6个体素，完成的。计算每个壳内EB通道的平均强度(排除零强度值)，并与主要脑区中血管掩模(表示为体素0处的壳)中的EB平均强度归一化。主要脑区的BBB渗漏在半球间取平均。
蛋白质组分析
空间脑组织蛋白质组学和数据分析
成像后，透明化的大脑通过反向梯度四氢呋喃系列重新水化，在4%琼脂糖中嵌入，并使用振动切片机(Leica, Germany)切成100 μm厚的冠状切片。在Axio Zoom显微镜(Zeiss, Germany)下根据3D成像结果，使用Sterican 18G不锈钢注射针(Braun, Germany)解剖脑区域(海马体、躯体感觉皮层)。蛋白质组学分析的样品制备以前述略作修改的方式进行[44]。简而言之，样品首先在6% SDS缓冲液中重悬，在热振荡器中95°C加热变性45分钟，600 rpm，超声高模式30个周期(30秒关，30秒开)(Bioruptor Plus, Diagenode)，然后在-20°C下用80%丙酮过夜沉淀。第二天，这些样品被离心，颗粒在SDC裂解缓冲液(2% SDC，100 mM Tris-HCl pH 8.5)中重悬。在SDC缓冲液中的样品以高模式超声15个周期(30秒关，30秒开)。样品再次在热振荡器中95°C加热45分钟，600 rpm。样品在37°C下用胰蛋白酶和LysC(1:50，蛋白酶:蛋白质比例)消化过夜，1,000 rpm振荡。所得肽在1% TFA 99%异丙醇中酸化，体积比1:1，涡旋并离心以沉淀残留颗粒。上清液转移至新管，并进行自制StageTip清洁，由三层苯乙烯二乙烯基苯反相磺酸盐(SDB-RPS；Empore，3M)膜组成。肽在激活的(100% ACN，1% TFA在30%甲醇中，0.2% TFA)StageTips上加载，通过SDB-RPS膜，然后用EtOAc包括1% TFA、异丙醇包括1% TFA和0.2% TFA分别清洗。然后通过60 μL洗脱缓冲液(80% ACN，1.25% NH4OH)从膜上洗脱肽，并使用真空离心机干燥(40分钟，45°C)。最后，肽在8-10 μl负载缓冲液(2% ACN，0.1% TFA)中重悬，储存在-80°C直到进一步使用。
质谱数据在数据无关采集(DIA)模式下获取。LC-MS/MS分析使用EASY nanoLC 1200(Thermo Fisher Scientific)与捕获离子迁移谱四极杆飞行时间单细胞蛋白质组学质谱仪(timsTOF SCP，Bruker Daltonik GmbH，Germany)通过CaptiveSpray纳米电喷雾离子源耦合进行。肽(50 ng)装载到25 cm Aurora Series UHPLC柱与CaptiveSpray插入件(75 μm ID，1.6 μm C18)上，50°C，使用50分钟梯度(5-20%缓冲液B 30分钟，20-29%缓冲液B 9分钟，29-45%缓冲液B 6分钟，45-95%缓冲液B 5分钟，95%缓冲液B清洗5分钟，95-5%缓冲液B 5分钟)在300 nL/min流速下分离。缓冲液A和B分别为含0.1%体积甲酸的水和80:20:0.1%体积ACN:水:甲酸。MS数据在单次无库DIA模式下获取，timsTOF SCP在DIA/平行累积串行碎裂(PASEF)模式下操作，使用高灵敏度检测-低样本量模式。离子累积和斜坡时间均设置为100 ms，以实现近100%的占空比。碰撞能量随迁移率线性斜坡，从1/K0 = 1.6 Vs cm⁻²时的59 eV到1/K0 = 0.6 Vs cm⁻²时的20 eV。隔离窗口定义为m/z 400到1000的24×25 Th。使用DIA-NN[54]搜索diaPASEF原始文件，针对小鼠UniProt数据库。考虑长度至少为七个氨基酸的肽进行搜索，包括N端乙酰化。甲硫氨酸氧化设置为可变修饰，半胱氨酸羧甲基化设置为固定修饰。酶特异性设置为胰蛋白酶/P，允许2次错切。为预测库生成启用了FASTA消化用于无库搜索。FDR设置为前体和全局蛋白质水平的1%。启用了匹配间运行(MBR)功能，量化模式设置为"鲁棒LC(高精度)"。使用DIA-NN报告中的Protein Group列来识别蛋白质组，并使用PG.Max-LFQ计算差异表达。
血浆衍生细胞外囊泡(EV)蛋白质组学
小鼠血浆制备
从认知和干预动物队列中，血液样本从尾静脉收集到含有EDTA抗凝剂的血液采集管中(Sarstedt)。通过在4°C下2000×g离心10分钟将血浆从血液细胞中分离，然后储存在-80°C直到进一步处理。
Nano-Mag-Net捕获血浆粒子
使用简化Mag-Net[45]协议从鼠血浆中富集带负电荷粒子。简而言之，缓冲交换的强阴离子交换(SAX)珠在含50%(v/v)磷酸盐缓冲盐水和Tris-HCl(pH 8.5，250 mM)的NMN缓冲液中制备。鼠血浆(2.5 μl)与0.5 μl这些NMN缓冲液平衡的SAX珠孵育15分钟，以捕获带负电荷粒子。血浆粒子负载的SAX珠在20 μl NMN缓冲液中清洗四次。将珠子捕获在磁性96孔板上，弃去上清液。珠子通过摇动和离心回收。随后，珠子在含2% SDC、10 mM TCEP、40 mM CAA和100 mM Tris-HCl的RAD缓冲液中进行还原、烷基化和变性(RAD)，在热块上90°C 10分钟。使用SP3[55]进行蛋白质清洁，将蛋白质在30 μl乙醇中沉淀5分钟，随后进行三轮80%乙醇清洗。沉淀的蛋白质在SpeedVac中60°C干燥。最后，使用500 ng胰蛋白酶-LysC在含50 mM Hepes(pH 7.5)、1 mM CaCl2和0.015% DDM的25 μl消化混合物中消化蛋白质。
Evotip PURE清洁血浆粒子样品
执行迷你化、96孔可扩展C18清洁[56]。简而言之，Evotip PURE尖端用20 μl缓冲液B(含80% ACN、水和0.1%甲酸)冲洗，在800×g下离心60秒。Evotips用10 μl异丙醇冲洗，然后在100×g下短暂离心，1分钟孵育，再在100×g下额外4分钟以清空Evotips。PURE Evotips在20 μl缓冲液A(0.1%甲酸)中平衡，在酸化样品准备好加载前在800×g下离心60秒以储存。血浆粒子样品在1% TFA中酸化，并通过在800×g下离心1分钟清空PURE Evotips。酸化样品加载到PURE Evotips上，在800×g下离心1分钟。样品用20 μl缓冲液A清洗两次，在800×g下离心1分钟。洗脱收集在PCR条中，通过在450×g下用20 μl 45%缓冲液B(含45% ACN、水和0.1%甲酸)洗脱。肽在SpeedVac中干燥，并在含0.1% TFA补充0.015% DDM的缓冲液中重悬，用于如前所述[56]在timstofSCP平台上进行质谱分析，使用5.5 cm uPAC HT柱(Thermo Scientific)与EASY nLC色谱法耦合到Bruker timstofSCP，使用diaPASEF。
蛋白质组数据预处理
原始蛋白质组强度经过严格的预处理管道，使用scanpy[57]，以确保数据质量和统计稳健性。为最小化随机检测的影响，我们首先应用了严格的过滤标准，仅保留那些在每个实验组中至少在5个样本中一致识别的蛋白质。接下来，根据每个样本对数据进行归一化，以考虑总蛋白质负载和仪器灵敏度的变化。然后将归一化强度值进行log1p变换(log加一)，以实现正态分布并稳定方差。为解决底层蛋白质组学中固有的剩余缺失值，我们采用了k-最近邻(kNN)插补，利用蛋白质谱型之间的局部相似性提供生物信息估计。该预处理数据集作为所有后续差异表达和通路富集分析的基础。使用数据库进行注释、可视化和集成发现(DAVID)工具[58]进行生物过程(GOTERM_BP_DIRECT)的富集分析，蛋白质-蛋白质相互作用和组织表达分析使用STRING DB(搜索重复实例的邻近基因工具，v12.0)工具[59]进行。在这两个工具中，使用了Mus musculus标准背景数据集。
疾病关联分析
差异丰度蛋白质转换为log2倍变化，用于生成每实验排序蛋白质列表。在指示的情况下，使用gprofiler[60]将小鼠符号映射到高置信度人类同源物，删除未映射条目，并通过保留具有最大绝对效应大小的基因来解析重复的人类映射。富集分析适应性地进行：具有足够大倍变化范围的数据集使用clusterProfiler[61]进行基因本体论(GO)生物过程、KEGG通路和DisGeNET疾病的基因集富集分析(GSEA)，应用Benjamini-Hochberg多重测试校正。对于效应大小小或广泛平局的数据集，使用过表达分析(ORA)替代，针对实验特定背景测试由log₂FC阈值定义的上调和下调基因集。所有分析均在R(v4.5.1)中使用以下包和版本进行：tidyverse(v2.0.0)、here(v1.0.2)、fs(v1.6.6)、glue(v1.8.0)、clusterProfiler(v4.16.0)、enrichplot(v1.28.4)、DOSE(v4.2.0)、org.Mm.eg.db(v3.21.0)、org.Hs.eg.db(v3.21.0)和gprofiler2(v0.2.4)。
UK Biobank分析
人类队列和蛋白质组学
我们利用UK Biobank(UKB)制药蛋白质组学项目中的Olink蛋白质组学数据。总共测量了约54,219名参与者EDTA血浆样本中的高达2,923种蛋白质，使用Olink Explore 3072平台。蛋白质丰度以对数2标度报告为归一化蛋白质表达(NPX)值。
统计模型
我们使用Cox比例风险回归来评估每种蛋白质与三个痴呆结局的关联，这些结局从UKB算法定义的结局中获取：全因痴呆(ACD；字段42018)、血管性痴呆(VaD；字段42022)和阿尔茨海默病(AD；字段42020)。模型根据基线年龄和性别调整，参与者随访至2022年10月31日的痴呆诊断。缺失值不插补，每种蛋白质仅使用完整案例进行分析。
跨物种比较
我们将小鼠血浆蛋白质组学结果(载体治疗vs. AKB-9778治疗)与人类痴呆Cox模型进行比较。首先使用UniProt标识符将小鼠蛋白质映射到人类同源物；仅包括在两个平台上的量化蛋白质纳入比较。如果蛋白质在人类数据中与疾病风险显著相关(p<0.05)，则视为"匹配"。然后评估"一致的方向性"，定义为小鼠倍变化(FC)和人类风险比(HR)均>1或均<1。
统计分析
除非另有说明，统计分析使用GraphPad Prism(v10.5)或Python的(v3.8)scipy.stats包(v1.10.0)进行。使用scikit-learn(v1.1.2)包中的无监督聚类方法(MiniBatch KMeans、Ward、Agglomerative Clustering、OPTICS、BIRCH、Gaussian Mixture)。两组之间的比较使用带Welch校正的非配对学生t检验进行。使用Pearson或稳健线性回归评估相关性。数据表示为平均值±标准误，显著性设定为p<0.05。
致谢
本工作得到了血管痴呆研究基金会、德国研究基金会(DFG, German Research Foundation)在德国卓越战略框架内慕尼黑系统神经学集群(Excellence Strategy within the framework of the Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy, ID 390857198))、CRC 1744(ID 548585053)的支持；Leducq基金会(22CVD01 to MD)；ERA-NET Neuron(MatriSVDs, to MD)；ERC Consolidator Grant(A.E., GA 865323)；Nomis心脏图谱项目赠款(A.E., Nomis Foundation)。手稿中使用的部分图形插图使用BioRender.com准备。作者使用了ChatGPT v4(OpenAI)和Gemini v2.5(Google)大型语言模型来改进本工作的语言和风格，然后仔细审查和编辑文本，准确负责最终内容。
【全文结束】