摘要
亮点
- 合成了一种电荷可逆脂质DOP-TMDEDA
- 使用DOP-TMDEDA开发了无聚乙二醇脂质纳米颗粒[TM LNPs PEG (−)]
- TM LNPs PEG (−)表现出高胶体稳定性和储存稳定性
- TM LNPs在体内诱导的炎症细胞因子产生低于商业LNPs
- TM LNPs PEG (−)在体内表现出比聚乙二醇化TM LNPs更高的蛋白表达
摘要
mRNA脂质纳米颗粒(LNPs)的发展促进了mRNA药物在COVID-19大流行期间的临床成功应用。传统LNPs依赖于可离子化脂质进行mRNA封装和内体逃逸。然而，可离子化脂质的高疏水性导致这些LNPs在生理条件下聚集，需要聚乙二醇(PEG)修饰来稳定。可离子化脂质和PEG分别在肌内给药后引起炎症和超敏反应。因此，开发低炎症LNPs对于mRNA治疗药物的安全应用至关重要。在本研究中，我们合成了2-{[2-(二甲氨基)乙基]甲氨基}乙基1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(DOP-TMDEDA)，一种结构类似于天然甘油磷脂的新型电荷可逆脂质。与使用市售可离子化脂质制备的LNPs相比，后者在磷酸盐缓冲液中不进行PEG修饰时分散性差，而基于DOP-TMDEDA的LNPs(TM LNPs)无需PEG修饰即可均匀形成并表现出高分散性。无PEG的TM LNPs [TM LNPs PEG (−)]在体内诱导的炎症细胞因子产生明显低于使用市售脂质制备的LNPs。此外，TM LNPs PEG (−)在体内的蛋白表达水平略高于聚乙二醇化TM LNPs。综上所述，这些结果表明TM LNPs PEG (−)为mRNA治疗提供了一个有前景且生物相容的mRNA递送平台。
引言
mRNA治疗药物相较于传统蛋白质药物(如重组酶、激素制剂和细胞因子)具有显著优势，特别是在快速生产和设计灵活性方面。这种灵活性源于几乎可以通过改变mRNA序列使用相同生产平台生产任何蛋白质的事实。此外，与质粒DNA不同，mRNA直接在细胞质中翻译成蛋白质，从而最小化了意外插入突变的风险。因此，mRNA治疗药物已引起广泛关注，用于预防和治疗各种疾病，包括传染病、癌症和遗传疾病。然而，裸mRNA容易被细胞外核糖核酸酶(RNases)降解且细胞膜通透性低。尽管修饰核苷(如N1-甲基假尿苷)可减少先天免疫激活并提高翻译效率，但RNases的细胞外降解仍然是一个关键障碍。为克服这些限制，脂质纳米颗粒(LNPs)已广泛用于mRNA递送。LNPs保护mRNA免受RNases降解并通过包封有效将其递送到细胞中。最近，两种mRNA-LNP治疗药物(COMIRNATY肌内注射®和Spikevax肌内注射®)已取得临床成功。然而，mRNA-LNP制剂的肌内给药会引起超敏反应；注射部位的炎症反应，如疼痛、红斑和肿胀；以及发烧。因此，开发低炎症mRNA递送载体对于推进mRNA治疗药物的实际应用非常理想。
LNPs通常由四种脂质组成：可离子化脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)缀合脂质。其中，具有pH响应特性的可离子化脂质在mRNA递送中起核心作用。这些脂质在生理pH(如血液中)下表现为中性电荷，但在酸性条件下(如内体中)变为正电荷。这种特性使它们能够在低pH下与带负电的mRNA发生静电相互作用并促进内体逃逸，从而使mRNA释放到细胞质中。然而，小鼠中LNPs的给药会诱导炎症细胞因子水平升高，主要由LNP组分中的可离子化脂质引起。此外，LNPs上的PEG诱导抗PEG抗体，激活补体并增加重复静脉给药后发生过敏反应的风险。
到目前为止，已探索了几种改进LNP配方安全性的策略，包括减少可离子化脂质的比例和开发生物衍生可离子化脂质(如基于肽的脂质)。此外，我们开发了一种pH响应二肽缀合脂质以减少LNP诱导的炎症。然而，这些LNPs仍需要PEG-脂质来保持胶体稳定性，引发了对PEG相关免疫反应和增加过敏反应风险的担忧。为了制备不含PEG-脂质的LNPs，已研究了聚合物替代物，如多聚肌氨酸(N-甲基甘氨酸)和聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PMPC)。尽管多聚肌氨酸预期具有高生物相容性，但其长期安全性尚未得到充分验证。PMPC模拟细胞膜磷脂并形成类似于PEG的亲水层，也已应用于LNPs；然而，尽管在体外实现了增强的mRNA转染，但PMPC缀合LNPs的体内功效尚未得到证明。我们先前开发了一种电荷可逆脂质，二油酰甘油磷酸-二亚乙基二胺(DOP-DEDA)，它作为pH响应可离子化脂质发挥作用，并且无需PEG稳定即可形成均匀颗粒。其电荷可逆行为源于头基中存在一个伯胺和一个仲胺。DOP-DEDA还类似于天然甘油磷脂，表现出低毒性，同时支持体外有效的RNAi诱导。然而，DOP-DEDA LNPs在生理条件下聚集，可能是因为单一的两性离子部分提供的水化不足。因此，我们假设在LNPs之间引入静电排斥将防止生理条件下的聚集。
在本研究中，我们合成了一种新型电荷可逆脂质，2-{[2-(二甲氨基)乙基]甲氨基}乙基1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(DOP-TMDEDA；图1A)。由于DOP-TMDEDA含有一个磷酸基团和两个叔胺，基于DOP-TMDEDA的LNPs(TM LNPs)在酸性条件下表现出正电荷，从而促进mRNA保留和内体逃逸。相反，在生理pH下，TM LNPs获得净负电荷。由于阴离子纳米颗粒比中性纳米颗粒具有更高的稳定性，DOP-TMDEDA通过静电排斥增强胶体稳定性，无需PEG修饰。因此，DOP-TMDEDA能够制备PEG-free LNPs，可在体内实现高效、低炎症的mRNA递送。
结论
我们设计了一种新型电荷可逆脂质DOP-TMDEDA，由于其类甘油磷脂结构和通过静电排斥实现的无PEG化高颗粒分散性，它表现出增强的生物相容性。DOP-TMDEDA在生理条件下形成了表面带负电荷的均匀颗粒，即使在没有PEG的情况下也是如此。重要的是，基于DOP-TMDEDA的LNPs(TM LNPs)表现出明显低于市售LNPs的炎症细胞因子水平。
资金来源
本研究获得AMED资助，项目编号JP21ak0101171。
作者贡献声明
Peihan Sha: 撰写原始稿件、可视化、验证、调查、正式分析、数据整理。Sumika Maeshima: 撰写原始稿件、可视化、验证、调查、正式分析、数据整理。Hiroyuki Koide: 审阅与编辑、撰写原始稿件、监督。Soya Kanetaka: 验证、调查。Tomoyuki Koge: 资源、项目管理。Toshio Kurosaki: 资源、项目管理。Tomohiro Asai: 审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能影响本论文报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
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