生物物质的复杂结构因其对光的不必要散射和吸收而导致不透明，这限制了光学成像的穿透深度。在大多数组织中，散射系数比吸收系数大10至1000倍；因此，散射过程会严重限制传统显微镜的成像深度和空间分辨率。如果能够大幅减少光散射，这可能会显著增强明场、荧光、非线性和超分辨率成像技术。
组织中光散射的根源在于低折射率水基成分（如间质液和细胞质）与高折射率脂质和蛋白质基成分（如质膜、髓鞘和肌原纤维）之间的折射率差异。减少这种差异的现有方法通常用高折射率化学品替代水，或去除脂质以产生全水环境。尽管这些方法取得了一定成功，但由于涉及使用有毒物质（如四氢呋喃和丙烯酰胺）以及移除维持生命所必需的分子（如水和脂质），它们很少用于活组织。
我们报告了一种反直觉的观察结果：强吸收分子可以在活体生物组织中实现光学透明。具体而言，我们发现一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的常见食用色素酒石黄的水溶液，可以可逆地使活体啮齿动物的皮肤、肌肉和结缔组织变得透明。我们探讨了这一现象背后的物理原理。通过应用材料介电特性的Lorentz模型，我们将酒石黄以及其他吸收分子建模为Lorentz振荡器。我们的理论模型表明，在可见光谱（400至750纳米）中具有尖锐吸收共振的Lorentz振荡器在溶解于水中时，可以有效提高红色和红外部分光谱中实部折射率，这与Kramers-Kronig关系一致。因此，可见光谱中的水溶性染料可以有效减少水和脂质之间的折射率差异，导致活体生物组织的光学透明。我们通过在高散射组织模拟散斑凝胶和解剖的鸡胸组织中使用可见染料验证了诱导光学透明的有效性。这种方法与之前关于吸收增强分辨率的报道有着根本不同。具体来说，我们在研究中观察到的光学透明并非由染料分子吸收散射光子引起，而是由于组织中散射事件的减少。
吸收分子使活鼠皮肤和肌肉透明
酒石黄是一种黄色至橙色的水溶性单偶氮化合物，因其在光谱蓝色区域的高吸收而在食品制造中被广泛用作常见合成色素。它是一种吸湿性化合物，在水中具有高溶解度和最小反应性。欧洲食品安全局（EFSA）已得出结论，该分子在高达每千克体重2克的剂量下不显示任何不良影响或系统毒性。因此，它被广泛用作人工食用色素，例如用于调味薯片（如多力多滋）。
当溶解在水中时，酒石黄溶液显示其特征性的黄色至橙色，因此得名"FD&C Yellow 5"。酒石黄溶液的紫外-可见（UV-vis）吸收光谱在257和428纳米处有两个主要峰值，但在约600纳米以上几乎没有吸收。我们通过质谱验证了本研究中使用的酒石黄的化学成分。
我们首先证明了染料溶液能够消除原本不透明的含有胶体二氧化硅（折射率=1.43）颗粒分散在水溶液中的悬浮液的散射。具体而言，0.6 M酒石黄溶液在可见光谱的红色区域为这种原本不透明的介质实现了完全的光学透明。相比之下，常规光学透明剂（OCAs）如甘油（已在体内证明能适度减少散射）无法在相同浓度下在散射介质中达到相同的透明度。
我们将酒石黄溶液局部应用于剃毛的活鼠头部头皮，并使用激光散斑对比成像（LSCI）来可视化头部的脑血管。LSCI通常需要去除头皮，因为头皮不透明，对剃毛的鼠头成像并未揭示任何关于脑血管的有趣特征。相比之下，在应用酒石黄溶液后，LSCI揭示了代表脑血管的结构。为了确认这些血管在大脑中的位置，我们在去除头皮后进行了LSCI，识别出类似的结构。除了酒石黄外，几种其他吸收分子也显示出类似程度的头皮透明度。局部应用的染料分子可以通过水冲洗从头皮上移除，有效地以可重复的方式逆转透明效果。除了局部应用外，将染料分子注射到头皮中也能产生类似的LSCI图像，为在较厚皮肤中实现组织透明提供了替代方法。
我们接下来试图证明吸收分子在鼠腹部实现组织透明的能力。具体而言，当将酒石黄溶液局部应用于麻醉状态下活鼠的腹部皮肤并轻轻按摩皮肤时，腹部皮肤不仅颜色变暗，而且在红色窗口中变得更加透明。这种透明效果可以用肉眼轻松观察到，不需要任何专业成像设备。几种吸收分子已被证明可以使鼠腹部变得透明。透明的腹部使我们能够直接观察内部器官，包括肝脏、小肠、盲肠和膀胱。此外，我们还可以分辨它们的运动，如蠕动以及与心跳和呼吸同步的运动。所实现的腹部透明度可以通过用水冲洗和按摩皮肤来逆转。
我们试图证明通过局部应用酒石黄溶液可以在深层组织中进行显微成像。我们选择鼠后肢中的肌节作为成像目标，因为它们在肌肉功能中的核心作用以及在神经肌肉疾病（如脊髓性肌萎缩症）中的意义。现有的活体肌节成像方法需要在肌肉组织内侵入性地植入微型内窥镜，以允许成像肌节中肌球蛋白杆的二次谐波生成（SHG）信号，这种情况下视野受植入位置限制。在我们的实验中，我们将酒石黄溶液局部应用于鼠后肢。虽然直接SHG成像（激发波长1040纳米；发射波长520纳米）通过完整皮肤在约220微米深度仅揭示模糊的微观特征，但与酒石黄接触的皮肤变得肉眼可见透明，使我们能够在相同深度识别肌节的周期性结构。具体而言，在较高激发数值孔径（NA）为0.5和0.8的情况下拍摄的图像证实，我们的方法与高分辨率显微镜兼容。在通过透明后肢组织的SHG图像中识别出2.60±0.28微米的特征周期性，这与肌节的长度相对应。SHG图像中肌节长度的平均周期性与已报道的数据一致，从而证实了酒石黄使组织透明并分辨肌肉中微观特征的能力。
吸收分子实现活组织光学透明的物理机制
尽管酒石黄在紫外和光谱蓝色区域具有强吸收，但在溶液中，即使在0.78 M的浓度下，它在600纳米以上仍保持最小吸收。≥600纳米光谱中的高透射率与我们在红色波长中主要实现组织透明的观察一致。因此，我们推测所观察到的透明性源于在显示透明性的波长较短波长处增加的吸收。
我们假设具有强吸收和优异溶解度的染料分子可以在溶解后在其吸收波长稍长的波长处显著增加水介质的折射率。我们通过Kramers-Kronig关系确认了这一点，该关系通过因果关系将材料折射率实部（n′）和虚部（n″）的光谱依赖性联系起来：
n′(λ) = 1 + (2/π)P.V.∫₀^∞ n″(λ′)[λ′(1-λ′²/λ²)]⁻¹ dλ′
其中λ是光的波长，P.V.表示积分的柯西主值。该方程表明，染料的光谱位置、光谱宽度和吸收强度都是控制n′(λ)可实现变化的参数。作为数值示例，通过溶解在428纳米处具有高斯吸收峰值、半高全宽（FWHM）为94纳米且峰值吸收系数为μₐ = 4πn″λ⁻¹ = 0.015 nm⁻¹（对应n″ = 0.5的值）的酒石黄分子，可以在可见光谱中实现溶液n′的实质性变化（约0.1的量级）。因此，水溶液的n′在λ > 428纳米时大幅增加，达到脂质和胶原纤维（n′ = 1.43至1.53）的水平。即使在n″基本返回零且吸收可忽略不计的波长处（例如>800纳米），n′仍高于纯水（n′ = 1.33）。可实现的n′变化与n″的增加成正比，这表明具有高n″的水溶性染料分子是有效增加水介质在溶解后吸收波长较长波长处n′的试剂。
这些发现与已报道的效应一致，表明当溶解或分散在介质中时，吸收分子可以增加介质的折射率。例如，已证明水溶性食用染料（如亮蓝、诱惑红、吡喃宁和喹啉黄）在溶解时可以显著改变水溶液的折射率。类似地，植物色素（如叶绿素、类胡萝卜素和花青素）可以在分散在其基质中时增强商用聚合物的折射率。此外，苏木精和伊红染色剂因改变细胞内成分的折射率而闻名。然而，这些研究都没有探索使用吸收分子来减少系统中的散射，更不用说在体内实现组织透明。
优化染料分子的光谱特性将能够在低且生理耐受的浓度下实现光学透明。为此，我们使用具有单一光学共振的Lorentz模型模拟染料分子的光学行为。我们表明，对于具有多个吸收峰的分子，多振荡器Lorentz模型可以简化为单振荡器模型。使用此模型，我们可以直接将OCA的相对介电常数εᵣ（和复折射率n = √εᵣ）与其等离子体频率ωₚ和阻尼常数γ联系起来：
εᵣ = ε∞ + ωₚ²/(ω₀² - ω² - iγω)
这里，ε∞是高频介电常数，γ近似等于共振峰的半高全宽。选择工作频率ω在ω = ω₀ - Δω附近的共振频率处简化表达式为：
εᵣ ≈ ε∞ + ωₚ²/ω₀ · 1/(2Δω - iγ)
方程3揭示了控制吸收分子在溶解介质中提高n′效率的几个方面。首先，给定ω₀⁻¹的缩放，具有低共振频率（小ω₀）的吸收分子在提高介质n′方面更有效。战略上选择略高于成像所用频率的共振频率（小的正值Δω）也很重要。这确保了由于共振而获得折射率的最大增加，而不会产生有害量的吸收。因为光学成像通常在可见光谱中进行，这些要求表明在蓝色区域（400-500纳米）具有吸收峰的染料比在近紫外（NUV；300-400纳米）和更短波长具有吸收峰的染料更有效的OCAs。其次，吸收分子应该具有低阻尼常数γ，这反映在其吸收光谱中为窄峰和小的半高全宽。方程3预测，在其共振附近具有尖锐吸收峰的染料分子作为更强烈的Lorentz振荡器，具有更大的εᵣ值。我们还希望避免在成像波长处由于吸收而导致的显著衰减。对于本工作中考虑的强吸收染料，我们因此保持在离共振稍远的位置。经验上，我们发现所使用的染料分子在ω = ω₀ - γ处运行，以实现足够的透明度。
Kramers-Kronig关系（方程1）和Lorentz模型（方程2和3）预测，随着吸收分子的共振吸收波长增加，它们在提高介质n′方面将变得更有效。为了说明这一点，我们对三个Lorentz振荡器建模，其共振频率分别在100、250和400纳米。在100纳米处的Lorentz振荡器在n″中表现出弱吸收，导致可见光谱中n′的增加较小。相比之下，在400纳米处的Lorentz振荡器被预测为更强的吸收剂，具有更高的峰值n″，从而在更长波长处更有效地增加n′。这一理论预测通过实验得到验证，正如甘油（常见OCA）在84纳米处的小摩尔吸收系数α为0.012 M⁻¹所示，对应于溶解在水中时在可见光谱中的小摩尔Δn′系数β（β定义为每摩尔浓度溶解OCA引起的介质n′变化）为0.0129 M⁻¹。这一发现揭示了常规OCAs如甘油通过提高组织折射率起作用，因为它们本身是在极紫外（EUV）光谱（通常<150纳米）中的吸收分子。然而，由于它们在极短波长处吸收（可能旨在在可见光谱中完全透明），常规OCAs不是强吸收剂，因此在提高介质n′方面效率低下。例如，甘油的β值小（0.0129 M⁻¹），必须使用几乎纯甘油（11.6 M）的甘油浓度才能将水的基准n′提高到与脂质匹配的水平。这种要求，其根源在于物理学，解释了为什么甘油在作为OCA应用时必然导致组织脱水和收缩。
这一理论预测也与酒石黄的α和β光谱一致，在其峰值吸收428纳米处具有高达(2.04±0.02)×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹的吸收系数，同时在600纳米以上完全透射。酒石黄在提高水的n′方面比甘油有效15倍以上，在提高n′方面比其他常用OCAs有效两到三个数量级。我们通过绘制23种吸收分子的α和β与它们从84到800纳米的峰值吸收的关系进一步证实了折射率增加对共振频率的依赖性，随着波长增加，显示出更强的吸收和更有效的n′增加。这23种分子包括21种在可见光谱中的吸收分子，以及常见OCAs甘油和antipyrine，后者在短波长紫外光谱中吸收。Antipyrine代表了在筛选1600多种化学品后表现最佳的n′匹配剂之一；然而，它的β比可见光吸收分子低得多，证实了Lorentz振荡器模型所施加的可实现n′增加的波长依赖性。
Lorentz振荡器模型连同Kramers-Kronig关系预测，光学吸收分子可以比传统折射率匹配剂带来更实质性和更理想的光学特性变化。根据方程3和图2K、L中揭示的依赖关系，最有效的试剂应在其峰值吸收位于尽可能长的波长处，该波长上限由成像波长决定，以最大化n″和Δn′。同时，该试剂应在成像波长处具有单一窄吸收峰而无任何额外吸收。除了这些纯光学要求外，试剂还需要在水中显示高溶解度和扩散性以及优异的生物相容性，以促进体内应用。在采样21个候选物后，酒石黄成为满足可见光谱中光学透明所有要求的突出候选物。具体而言，酒石黄在可见光谱的短极端具有窄吸收峰，其溶液在600纳米以上最小吸收。此外，它在可见光谱中具有最高的β，同时保持较低的α，如在所有分子的β/α光谱中在最短波长处出现的"清晰窗口"所示。尽管在428纳米处的共振峰值附近吸收增加，但酒石黄实现光学透明后仍可检测到低至500纳米的发射。这一发现表明，散射的减少抵消了酒石黄在低至500纳米处的吸收增加。
染料筛选还揭示了几个其他发现。首先，除酒石黄外的14种染料在更长波长处提供类似甚至更大的实现组织透明的潜力，Dye-21在近红外（NIR）光谱中显示出最大潜力。其次，我们预测体内光学透明在NIR光谱中更容易实现，这归功于共振吸收剂在更长波长处获得的极高β值。具体而言，Dye-21在800纳米处表现出>1.2 M⁻¹的高β，比甘油和类似OCAs高约100倍，正如Lorentz振荡器模型在方程3中预测的那样。
最后，Lorentz振荡器模型还为长期存在的在体内实现组织透明的挑战提供了理论基础。尽管组织清除技术最近取得了进展，但大多数对离体组织有效，很少适用于体内。我们的理论框架，基于Lorentz振荡器模型和Kramers-Kronig关系，为这一挑战提供了见解。常规OCAs如甘油、蔗糖和苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）作为高折射率试剂，弥合了水和内源组织中其他高折射率成分（如脂质和蛋白质）之间的折射率差异。然而，我们的理论分析表明，这些分子通过在短波长、极紫外光谱中的吸收获得其高折射率。方程3预测这些分子是弱Lorentz振荡器，其特征是极小的β。这意味着它们在溶解时每单位浓度对水折射率的提高效率低下。这一见解阐明了为什么这些OCAs通常在非常高的浓度下使用（例如80%甘油或80%果糖）或以纯形式使用（例如纯甘油）。因此，常规组织清除需要几乎完全替代原始水含量与OCA，导致生物组织大量脱水和收缩。这些要求使这些传统的离体组织清除方法不适合用于活体生物组织。
验证吸收分子实现光学透明的机制
增加散射介质的吸收已被证明可以通过抑制对背景噪声有贡献的散射光子来改善成像分辨率。相反，我们的结果并非由于染料分子吸收散射光子，而是源于组织中散射事件的减少。为此，我们使用组织模拟散斑幻影进行了实验。我们通过将二氧化硅球（n′为1.43，接近脂质和胶原蛋白）均匀混合在具有背景n′为1.33（与水相同）的光学透明水凝胶中来制作这些散斑幻影。用于将水凝胶化的琼脂糖，在6 mg ml⁻¹的浓度下，对介质折射率的影响很小。我们优化了球的密度，以达到与肌肉组织相似的散射系数量级（约10 cm⁻¹）。
FDTD技术的波动光学模拟显示了平面波如何穿过包含散射粒子的介质。然而，当我们将水凝胶背景的n′提高到与散射器匹配时，入射波在二氧化硅颗粒存在的情况下传播而没有明显畸变。
我们将散斑幻影放置在显示毫米大小方格的方格纸上。通过将酒石黄溶解到水凝胶中来增加该幻影的吸收度，不透明的幻影逐渐在红色部分光谱（λ≥600纳米）中变得透明，看起来与没有任何散射器的水凝胶相似，如明场照片所示。将散斑幻影浸入0.6 M酒石黄溶液中进行的动态成像显示，随着酒石黄分子逐渐渗透，它变得越来越透明，然后随着分子退出而恢复为不透明。
我们通过测量幻影的正常入射光透射率（T）作为染料浓度的函数来量化光学透明的效果。在红色透明窗口（λ≥600纳米）中，随着酒石黄浓度的增加，T逐渐增加了60倍以上。在此浓度下，染料掺杂水凝胶的n′与二氧化硅球匹配，同时在≥600纳米范围内产生可忽略的n″。染料浓度的进一步增加导致最大透射率下降，我们将此归因于n′的超调，导致散射增加，这与图3B中的模拟结果一致。这些观察结果不同于由吸收引起的图像分辨率增强；后者显示整体透射率下降，没有表现出超调行为。
T测量使我们能够使用Bouguer-Beer-Lambert定律提取散射系数μₛ：
T = exp(-μₜd) ≃ exp(-μₛd)
其中散射对衰减系数μₜ的贡献占主导地位（μₜ = μₐ + μₛ ≈ μₛ，因为μₛ ≫ μₐ）在600纳米以上的波长。我们绘制了由增加浓度的酒石黄组成的散斑幻影的归一化μₜ。我们发现，在600纳米以上，具有高浓度酒石黄的散斑幻影的μₜ/μₜ,₀M显著减少，表明由于n′匹配而导致光散射减少。
我们使用真实的生物组织（如鸡胸）作为散射介质，验证了吸收染料实现光学透明的机制。鸡胸的μₜ在600纳米处为32.5±3.5 cm⁻¹，这与报道的在600至700纳米处的μₛ~30 cm⁻¹相似。浸泡在酒石黄溶液浓度增加的2毫米厚鸡胸组织切片显示，位于其下方的"Stanford"一词的图像越来越清晰。与散斑幻影中的演示类似，动态成像显示鸡胸组织随着酒石黄分子逐渐渗透而变得越来越透明。在红色波长的透明窗口（λ≥600纳米）中，随着酒石黄浓度的增加，T逐渐增加。此外，我们发现随着酒石黄浓度的增加，鸡胸的μₜ/μₜ,original在600纳米以上显著减少，表明由于n′匹配而非散射光子的吸收而导致光散射减少。
最后，我们测量了酒石黄通过常见组织类型的扩散速率，以评估其作为通用OCA的潜力。据报道，生物组织内流体扩散的动力学可以通过自由扩散来近似。通过跟踪染料浸泡过程中光学透射的时序演变，我们使用报道的方法从各种组织（包括鼠皮肤、鼠肌肉、大鼠皮肤和鸡胸）中提取了酒石黄分子的扩散系数，范围在0.067×10⁻⁶至~0.66×10⁻⁶ cm² s⁻¹之间。这个扩散系数范围高于其他常用OCAs（例如，据报道丙二醇具有0.021×10⁻⁶ cm² s⁻¹的小扩散系数）。因此，酒石黄实现光学透明所需时间更短（例如，2毫米鸡胸组织需要2小时），而其他OCAs需要更长的浸泡时间（例如，60%蔗糖需要24小时）才能达到相同的效果。我们将这种扩散速率差异归因于酒石黄比常规OCAs更高的摩尔Δn′系数β。因此，酒石黄可以在比常规OCAs低得多的浓度下实现所需的Δn′，导致更稀释的溶液具有更低的粘度，从而增强了其扩散动力学。动态光学透射测量显示，随着酒石黄分子扩散出去，这些组织恢复其原始不透明度，证明了诱导光学透明的可逆性。
染料分子可改善散射介质中显微成像的空间分辨率
染料分子可以改善在组织模拟散射介质中大深度处的显微成像空间分辨率。我们量化了通过含有不同酒石黄浓度的1毫米散斑幻影成像1951年美国空军（USAF）分辨率目标时可分辨的空间频率。我们将散斑幻影放置在目标和物镜镜头之间，目标被白光LED面板背光照明。通过没有二氧化硅颗粒的清晰幻影成像的显微照片揭示了最小特征，线宽为2.19微米。然而，散斑幻影的存在大大影响了成像分辨率。随着我们增加幻影中的染料浓度，空间分辨率逐渐提高，直到清晰分辨2.19微米的线宽。我们通过测量调制传递函数（MTF）在所有考虑的空间频率和波长上的逐渐增加来量化这种空间分辨率的提高。
这种波长依赖性行为与染料掺杂引起的折射率光谱依赖性变化一致。在较短波长下，一旦超过最佳浓度，图像会变得模糊，而在较长波长下，对MTF和空间分辨率的影响达到平台期。
当我们将101.6线对每毫米（lp mm⁻¹）处的MTF绘制为不同波长下背景和颗粒之间n′差异的函数时，所有波长的数据都坍缩到相同的主曲线。这条主曲线，以及主要在红色部分光谱（λ≥600纳米）中的透明效果，验证了通过Kramers-Kronig关系由水溶性染料分子实现的折射率调节。
我们分析了散斑幻影中不同深度的MTF，发现0.6 M酒石黄可以在3毫米深度分辨微米级特征，而含有纯水和0.6 M甘油的散斑幻影在1毫米深度后无法分辨这些特征。鸡胸组织不同厚度的MTF分析显示了0.6 M酒石黄的类似性能，在1毫米深度以上分辨小至5微米的特征。同样，USAF分辨率目标在酒石黄溶液中的各种鼠组织下变得可分辨，巩固了在活鼠中观察到的透明效果。
最后，我们进行了数值波动光学模拟，以模拟入射光束与掺有和未掺酒石黄的散斑幻影的相互作用。在600纳米光束穿过1毫米厚的散斑幻影后，光束被理想透镜重新聚焦；对比点扩散函数突出显示，在酒石黄存在的情况下可以实现锐利的焦点，而相比之下，水中的原始焦点是模糊的。模拟揭示了酒石黄通过Kramers-Kronig关系引起的折射率调节导致600纳米光波散射减少，而不是通过吸收去除散射光子，作为观察到的光学透明的机制。总之，这些数据展示了通过光学模拟生物组织的毫米厚散斑幻影分辨空间频率高达228.1 lp mm⁻¹（线宽低至2.19微米）的能力。
通过透明腹部使用染料分子监测肠道运动
我们研究了光学透明是否能让我们从通常抵抗活体动物无创显微成像的深层组织中获得高分辨率结构和功能信息。我们关注位于腹部腔内深处的胃肠道（GI）道中填充的肠神经系统（ENS）。ENS控制GI功能，如蠕动、管腔分泌和吸收。ENS功能障碍与GI疾病有关，如肠易激综合征和便秘，以及自闭症和帕金森病等神经精神疾病的GI表现。ENS的神经元细胞体聚集在集群（神经节）中，并位于GI道壁内的两个网状层中：粘膜下神经丛和肌间神经丛。肌间神经丛位于环形和纵向肌肉层之间，包含局部反射微电路，感知肠腔扩张并启动蠕动，即管腔内容物的头尾推进。尽管ENS具有重要作用，但我们对肌间神经元如何协调肠道蠕动的理解有限。活体动物中肠道蠕动期间肌间神经元的直接成像是受到腹部壁不透明性的阻碍。监测肠道蠕动的现有技术通常涉及将解剖组织放置在离体器官浴中，或需要侵入性地植入腹部窗口。后一种方法不仅限制了正常的肠道运动，还可能导致结肠梗阻。这些限制突显了需要一种非侵入性方法来成像GI道和ENS在其最原始状态下的运动。
我们实现了活体胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre-tdTomato小鼠腹部的光学透明。ChAT-Cre-tdTomato小鼠在胆碱能神经元中特异性表达tdTomato，这些神经元在ENS中是兴奋性的。然后，我们对位于皮肤表面下500至~800微米的空肠中的肌间神经丛进行了荧光显微成像。在未经处理的动物中，由于上覆组织的散射，无法在此深度范围内获得可辨别的图像。然而，染料分子有效地使空肠上方的皮肤和肌肉变得透明，使我们能够直接可视化肌间神经丛中由红色荧光蛋白tdTomato标记的胆碱能神经元及其直径<10微米的神经纤维。我们通过解剖上覆皮肤、肌肉和空肠进行离体成像，确认了荧光源自空肠神经元。
与腹部窗口不同，使用染料分子实现的"透明腹部"不涉及任何限制自然肠道运动的外来刚性材料。因此，我们能够以28帧每秒的高帧率监测肌间神经丛的快速动态运动——反映了空肠的潜在蠕动。
我们使用粒子图像测速法（PIV）分析肌间神经丛的动态运动，这是一种常用于可视化用示踪粒子播种的流体流动的技术。具体来说，通过对视频进行PIV分析并排除与心跳和呼吸相关的全局运动帧，我们生成了一个时变向量图。在此图中，每个子区域被分配一个向量，表示组织运动的方向和大小。我们首先通过计算平均运动方向和幅度来研究肌间神经丛的全局运动模式。这种全局运动模式显示了运动方向的周期性变化以及偶尔的大运动幅度爆发。为了可视化这种周期性运动，我们选择了一个代表时间序列，突出显示不同的运动方向和幅度。这些时变向量图显示了几个有见地的发现。首先，全局平移方向存在周期性振荡，并在相对无特征的低位移图与显示明显运动的图之间切换。其次，视场内各个子区域显示偏离单向平移的组织运动模式。例如，我们观察到了收缩、扩张和旋转。为了突出这些局部运动模式，我们计算了向量图的散度，以识别收缩和扩张中的"汇"和"源"区域。同样，我们还计算了向量图的旋度，以可视化旋转中心。第三，这些运动模式的多样性在同一时间共存于更大的视场中，有效地排除了它们仅由小鼠呼吸和心跳引起的可能性。这些生理过程通常会在整个视场中引起全局垂直平移运动。我们的方法提供了在活体动物中以其最原始状态可视化深层组织活动的能力。
讨论
我们报告了一个反直觉的发现：当局部应用于生物组织时，强吸收染料分子可以减少这些组织内的固有光散射。这种效果使各种生物组织——包括头皮、肌肉和腹部——变得透明。我们基于Lorentz振荡器模型构建了一个理论框架来解释这一现象。该模型预测，在低共振频率（长波长）处具有吸收的分子在分散时比在高频率处具有共振的分子更有效地提高水的折射率。为了证实这一假设，我们使用组织模拟散射水凝胶和离体生物组织进行了广泛的实验和分析。这些测试证实了我们观察背后的机制，并展示了在实现透明后通过毫米散射介质可实现的空间分辨率。这种方法使我们能够以可逆和可重复的方式将活鼠通常不透明的腹部和皮肤转变为透明介质。这种"透明腹部"允许直接可视化荧光蛋白标记的肠神经元，捕捉它们反映活鼠中潜在肠道蠕动的运动。
这种方法在当前阶段仍存在一些限制。具体而言，与其它类似的体内组织清除方法一样，该方法基于将水介质的折射率与脂质和蛋白质匹配。然而，由于这些脂质和蛋白质的折射率是异质的（范围从1.4到1.5），为给定组织找到完美的折射率匹配的最佳染料溶液浓度仍然具有挑战性。因此，在离体和体内组织中观察到的光学透明是由于散射减少，但并未完全消除。此外，由于折射率匹配是由溶解在水介质中的吸收分子引起的，可实现的穿透深度取决于这些分子在合理时间内的扩散。对于更厚且渗透性更低的组织，吸收分子的注射提供了在更大深度实现组织透明的替代方法。
我们的理论框架预测，通过寻找或合成在近紫外和蓝色光谱区域吸收的染料分子，可以识别出更高效的OCAs。尽管这看起来反直觉，但这些分子作为具有更强共振强度的Lorentz振荡器，从而在每摩尔基础上更有效地匹配生物组织中的折射率。与常规清除剂相比，酒石黄在折射率匹配方面效率高出>15倍，而Dye-21在近红外光谱中实现折射率匹配的效率高出>100倍。因此，酒石黄可以在局部应用时以安全浓度和可接受的渗透压实现体内光学透明。具有更低共振频率、更尖锐吸收峰和更丰富离域电子的分子预计在实现活体组织光学透明方面比酒石黄更有效。
实现光学透明所需的安全浓度也在其与荧光蛋白的兼容性中得到体现。例如，在ChAT-Cre-tdTomato小鼠的肌间神经丛中表达的tdTomato在浸入用于空肠组织透明的有效酒石黄溶液前后，荧光强度没有降低。此外，酒石黄可以在固定前后实现组织透明。技术级（90%）和分析试剂级（98.7%）的酒石黄在去质子化形式下表现出类似的组织透明效果。我们的药代动力学研究表明，系统给药的酒石黄在24小时内通过尿液和粪便从鼠体中排出。皮肤组织学表明，局部应用的酒石黄引起的炎症最小。最后，评估小鼠体重和血液面板的长期研究显示，局部应用的酒石黄对系统毒性最小。
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