研究亮点
• 细胞增殖阶段的细胞周期调控决定血小板生成能力
• KAT7抑制导致imMKCL中G0期停滞和免疫表型占主导
• 免疫型巨核细胞的主导地位由cGAS-STING通路介导
• imMKCL释放的促炎细胞因子可能抑制血小板生成
摘要
主细胞库(MCB)系统对再生细胞治疗至关重要。我们已开发基于诱导多能干细胞(iPSC)的永生化巨核细胞祖细胞系(imMKCLs)作为iPSC衍生血小板(iPSC-PLT)输注的MCB。然而，imMKCLs同时表现出血小板生成和免疫偏向特性，增强的免疫活性会损害血小板生产。免疫特性与血小板生成效率之间的联系尚不清楚。在此，我们证明处于G1和G2/M间期的增殖imMKCLs有助于血小板生成，而赖氨酸乙酰转移酶7(KAT7)通过抑制免疫偏向占主导来维持这些间期。使用WM3835抑制KAT7会增加G0期细胞，模拟imMKCL老化，并诱导cGAS-STING激活、染色质不稳定以及肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-β和其他促炎细胞因子的分泌。此外，TNF-α处理重现了KAT7缺失时观察到的向G0期转变。这些发现确定KAT7是通过防止免疫偏向特性来调控imMKCL增殖的关键调节因子，突显了其作为iPSC-PLT制造中质量控制标志物的潜力。
关键词
- 细胞周期
- 免疫型巨核细胞
- 赖氨酸乙酰转移酶7
- cGAS-STING
引言
血小板(PLTs)通过巨核细胞(MKs)细胞质的各种脱落机制产生。我们先前建立了使用永生化MK祖细胞系(imMKCLs)作为诱导多能干细胞(iPSC)衍生血小板(iPSC-PLT)生产的主细胞库(MCB)的体外PLT制造系统，并开发了依赖湍流的生物反应器。imMKCLs在强力霉素存在下(Dox-ON)表现出持续增殖，并在培养基中强力霉素耗尽后(Dox-OFF)产生iPSC-PLTs。这些技术进步的结合促成了首次人体临床试验iPLAT1，该试验使用患者自体imMKCLs。值得注意的是，当关注通过扩增能力估计的imMKCL质量与iPSC-PLT生成能力之间的关系时，我们注意到Dox-ON阶段的快速增殖率与后续Dox-OFF阶段的iPSC-PLT生成能力相关；相反，缓慢的增殖率会减少PLT数量。基于体内MK发育过程中出现免疫偏向亚群的新概念，我们最近发现imMKCL亚群同样具有免疫偏向特性，最终影响iPSC-PLT的生成能力。该亚群高表达免疫MK基因，如血小板因子4(也称为趋化因子[C-X-C基序]配体4)、前血小板碱性蛋白、白细胞介素-8和干扰素相关基因，这些都恶化了imMKCLs的整体MCB质量。尽管它们很重要，但免疫偏向占主导的分子机制以及imMKCLs内的免疫MK亚群如何影响iPSC-PLT生产中的质量控制在很大程度上仍未被探索。
赖氨酸乙酰转移酶7(KAT7，也称为HBO1和MYST2)是组蛋白乙酰转移酶MYST家族的关键成员，对染色质修饰和基因调控至关重要。它通过与MEAF6和支架蛋白形成复合物，使组蛋白H3在赖氨酸14和组蛋白H4在赖氨酸5、8和12处乙酰化。这些染色质修饰对调控基因转录、DNA复制和DNA修复过程至关重要。此外，通过乙酰化H3K14，KAT7促进H3周转和CENP-A整合，从而拮抗Suv39h1介导的失活，并促进着丝粒组装，以确保细胞分裂过程中的染色体准确分离和基因组稳定性。在血液系统中，KAT7是造血干细胞自我更新、T细胞扩增、胎儿肝脏红细胞生成和髓系白血病细胞所必需的。相比之下，在与早衰相关的常染色体隐性遗传病Werner综合征(WS)中，KAT7被报道可诱导间充质干细胞的细胞衰老。然而，KAT7在细胞衰老和增殖中的对立作用是否依赖于上下文，因细胞类型和生理条件而异，仍有争议。
在此，我们试图阐明imMKCLs中的细胞周期转换状态，发现KAT7在抑制imMKCLs的免疫偏向特性方面起着关键作用，这与细胞周期G1和G2/M期的保留有关，从而导致增强的PLT生产。
结果
细胞增殖阶段的细胞周期间期与巨核细胞成熟阶段血小板生成能力的关系
我们已证实Dox-ON阶段的快速增殖率与后续Dox-OFF成熟阶段的增强血小板生产密切相关，但细胞周期调控如何影响最终的血小板脱落事件一直不明。为了深入了解这一点，我们准备了短期培养(ST-C)(少于1个月)和长期培养(LT-C)(超过4个月)的imMKCLs，并验证了先前结果。由于异常糖基化已被认为是巨核细胞和血小板老化的标志，我们首先通过蓖麻凝集素I(RCA-1)凝集素染色确认LT-C imMKCLs具有老化巨核细胞的特征。
与ST-C imMKCLs相比，LT-C imMKCLs表现出略微增大的细胞尺寸，增殖能力和血小板生成能力下降，这是由多倍体化和前血小板形成受损造成的。接下来，我们使用FUCCI报告系统研究了细胞周期状态对imMKCLs血小板生成能力的影响。值得注意的是，ST-C imMKCLs主要处于G1或G2/M期，而LT-C imMKCLs主要处于G0期。随后，我们在Dox-ON条件下收集各细胞周期阶段的细胞，并启动Dox-OFF培养以诱导血小板生成。总体而言，G2/M期的细胞对ST-C和LT-C imMKCLs的血小板生成贡献最大。相应地，G2/M期分选的imMKCLs中>8N多倍体细胞占主导地位，而G0期分选的imMKCLs中为2N细胞。值得注意的是，ST-C但非LT-C imMKCLs在G1期也对血小板生成有显著贡献，并表现出更高的倍性。
有趣的是，在分选后Dox-ON培养3天后，所有三种分选的ST-C imMKCLs都转变为预分选模式，主要由G1期细胞组成，其次是G2M期。相比之下，大多数G0期分选的LT-C imMKCLs保持在G0期，而其他两个分选亚群中G0期细胞比例增加，高于ST-C imMKCLs。我们进一步研究了分选后Dox-OFF培养期间的细胞周期状态。在成熟的Dox-OFF imMKCLs中，无论来源是ST-C还是LT-C，大多数G0期分选的细胞都保持在G0期。同时，G1或G2/M期分选的群体保持或进展到G1、S和G2/M期，尽管更多的LT-C imMKCLs进入G0期。这些发现共同表明，虽然老化imMKCLs中增殖率低和血小板生成能力下降可能归因于G0细胞周期停滞，但年轻imMKCLs维持向G1或G2/M期的转换以生成血小板。
LT-C imMKCLs中KAT7和H3K14ac水平降低
细胞周期停滞也是细胞衰老的指标。此外，我们先前报道显示，血小板生成能力低或中等的克隆表现出衰老特征。鉴于KAT7被建议作为细胞衰老的新调节因子，我们试图检查imMKCLs中KAT7水平是否与增殖率和后续血小板生产相关。值得注意的是，蛋白质印迹分析显示，LT-C imMKCLs和WS imMKCLs与ST-C imMK相比，KAT7和下游H3K14ac修饰水平均较低。特别是，WS imMKCLs表现出降低的细胞分裂(增殖率)，导致与ST-C imMKCLs相比血小板产量下降。这些结果表明KAT7是imMKCL增殖的关键调节因子，年龄依赖性的KAT7水平可能影响细胞周期进展。
KAT7的药理学抑制导致细胞周期停滞，损害imMKCL增殖和成熟
为了确定KAT7在imMKCLs中的作用，我们评估了KAT6/KAT7抑制剂WM3835和WM1119抑制H3K14乙酰化的能力。WM3835(5 μM)与WM1119(5 μM)相比显著降低了H3K14ac水平，并显著降低了ST-C imMKCLs中的KAT7蛋白表达，支持其作为本研究中选择性KAT7抑制剂的适用性。在Dox-OFF阶段第1-5天给予WM3835不会影响血小板生产，表明KAT7在成熟阶段不起作用。相比之下，在Dox-ON阶段用WM3835预处理9天(而非3天或6天)，随后去除强力霉素并进行6天的血小板成熟，显著降低了血小板产量。使用FUCCI传感器，我们确认KAT7抑制增加了G0期细胞数量，同时减少了G1和G2/M期细胞。
为避免WM3835可能的脱靶效应，我们还使用短发夹RNA(shRNA)介导的KAT7敲低进行了实验，这显著降低了KAT7 mRNA表达。shKAT7 imMKCLs中的细胞增殖和血小板生成能力均明显降低。此外，shKAT7 imMKCLs中G0期细胞的比例增加了2倍，表明KAT7敲低后发生G0细胞周期停滞。这些结果展示了与WM3835处理观察到的相似表型。
相反，KAT7过表达并未改变增殖率、血小板产量或细胞周期状态。这些结果表明KAT7对维持imMKCLs在Dox-ON阶段的细胞周期至关重要，强调了其在维持imMKCL增殖潜力和影响后续成熟阶段血小板产量方面的作用。
KAT7抑制后的基因表达变化激活imMKCLs中的凝血和免疫相关通路
为了阐明KAT7抑制导致细胞周期停滞和血小板产量下降的潜在机制，我们进行了RNA测序(RNA-seq)。差异基因表达分析显示，WM3835处理后imMKCLs中许多基因的表达谱发生改变(1,539个上调和1,258个下调基因)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)富集表明，KAT7抑制加速了血小板激活、补体、凝血级联和免疫相关通路，如肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、核因子(NF)-κB信号通路、炎症反应、对细胞因子的反应以及对I型干扰素的反应，并且TNF-α、PPBP、包括PF4在内的CXCL家族基因和干扰素相关基因突出，表明一致的多层次免疫反应导致人巨核细胞分泌这些分子。事实上，RNA-seq读数和RT-qPCR分析证实，RAS样原癌基因B(RALB)表达在WM3835处理和shKAT7 imMKCLs中均上调，表明KAT7抑制诱导imMKCLs中免疫激活状态，其特征是RALB调控的免疫相关基因(包括IRF7和ISG15)升高。与此免疫偏向转录谱一致，KAT7抑制还导致免疫相关标志物(包括CD53、CD54/ICAM-1、CD32和HLA-A/B/C)的表面表达增加，从而在蛋白水平上提供了KAT7缺失扩增免疫偏向MK群体的直接证据。
为进一步验证RNA-seq观察到的免疫反应，我们进行了RT-qPCR以量化I型干扰素和NF-κB信号通路中涉及的基因表达。一致地，imMKCLs在WM3835处理后显示出IFI27、IFIT1、IRF7、ISG15和IFNB1(I型干扰素-β)的更高表达水平。同时，RELB表达上调而非RELA和NFKBIA强烈提示非经典NF-κB信号通路激活。同样，shKAT7克隆表现出I型干扰素和NF-κB通路的上调，表现为IFI27、IFNB1、NFKBIA、IL8和TNF表达增加。我们还通过ELISA量化了imMKCLs培养上清液中促炎细胞因子的水平。与RNA-seq数据一致，WM3835处理显著增加了TNF-α、白细胞介素(IL)-8和PF4的蛋白水平，表明免疫偏向imMKCLs的激活可能是炎症细胞因子的来源，这些细胞因子对巨核细胞成熟产生负面影响。此外，有研究表明TNF驱动的炎症可诱导血小板过度反应性，这可能与一项关于COVID-19患者的报告有关，该报告揭示TNF依赖性免疫MKs增加是细胞因子风暴的可能原因。这些结果强烈表明KAT7抑制驱动imMKCLs中的免疫偏向表型。
KAT7缺失导致着丝粒功能障碍并通过cGAS-STING通路触发imMKCL免疫表型
我们最近证明免疫-MK的主导地位受RALB调控。在那项工作中，我们揭示了免疫-MK与下调的CBX5(也称为HP1α)相关，CBX5对异染色质组织至关重要，通过与H3K9me3组蛋白标记结合促进染色质压缩。CBX5缺乏已被报道会诱导染色体不稳定性，导致微核形成和着丝粒功能受损而造成染色体分离缺陷。此外，KAT7通过拮抗Suv39h1介导的失活来协调着丝粒组装，确保细胞分裂过程中的染色体准确分离和基因组稳定性。Suv39h1的缺失会破坏哺乳动物异染色质结构并损害基因组稳定性。正如预期，药理学抑制和KAT7敲低降低了CBX5和Suv39h1，从而降低了负责调控核心着丝粒结构的基因。此外，免疫组织化学分析显示KAT7抑制后imMKCL中微核增加。为提供染色质不稳定性的直接证据，我们进行了细胞内γH2AX染色以评估DNA损伤。ST-C imMKCLs在KAT7抑制后表现出显著升高的γH2AX水平，即使在没有外源性DNA损伤的情况下，表明KAT7抑制导致自发性DNA损伤，并可能损害丝裂霉素C诱导损伤后的DNA修复能力。
鉴于我们发现染色体不稳定性与通过环状鸟苷酸单磷酸-AMP合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激物(STING)激活的I型干扰素之间的已建立联系，我们假设KAT7缺失参与了这一通路。与此一致，KAT7抑制增加了STING磷酸化。为确定KAT7抑制触发的I型干扰素和NF-κB级联是否特异性依赖于cGAS-STING激活，我们用H-151(一种选择性STING抑制剂)处理细胞。结果显示，H-151部分抑制了KAT7抑制依赖的I型干扰素信号激活和NF-κB通路相关基因(RELB、NFKBIA和RELB靶点如IL-8和TNF)。总之，我们的结果表明KAT7通过抑制cGAS-STING通路在细胞周期调控中发挥重要作用，这与imMKCLs的免疫偏向MK特性相关。
TNF-α诱导imMKCLs中G0细胞周期停滞
最后，我们检查了免疫偏向imMKCLs释放的细胞因子对细胞周期调控的直接影响。虽然TNF-α给药导致增殖呈剂量依赖性减少，但IFN-β未表现出此类效应。TNF-α处理还导致G0间期细胞增加以及G1和G2/M期细胞相应减少，这通过FUCCI系统得到证实。此外，TNF-α和IFN-β处理在强力霉素去除后均显著降低了血小板生成能力。这些结果表明KAT7是通过抑制imMKCLs中的免疫MK程序来实现G1/G2/M亚群最佳细胞分裂和高效血小板生产的关键调节因子。
讨论
我们先前建立了imMKCLs作为体外iPSC-PLT制造的稳健平台。考虑到从MCB库存解冻后或衍生工作细胞库存的大规模最终细胞产品制造，控制增殖率至关重要。Dox-ON阶段imMKCL细胞分裂的增殖阶段对于在随后的Dox-OFF阶段获得具有优化特性的足够细胞数量以实现高效血小板生产是必不可少的。尽管我们已认识到增殖减少会导致血小板生产受损，但细胞增殖如何最终决定血小板生成能力仍是一个谜。在此，我们展示了一个关键机制，即增殖阶段KAT7介导的染色体稳定性通过抑制imMKCLs中的免疫偏向特性来调控后续血小板生产能力。这一机制尤为重要，考虑到我们最近的发现突出了imMKCLs的异质性，其中免疫偏向imMKCLs的失调导致增殖停滞和血小板生产受损。
本研究的一个关键发现是增殖阶段的细胞周期动态严格调控血小板生产。具体而言，Dox-ON阶段G1和G2/M期的细胞对血小板生成至关重要，而G0期停滞增加(特别是在老化imMKCLs中)会损害此过程。Becker等人证明，来自小鼠胎儿肝脏的巨核细胞的血小板生产依赖于G1期的中心体聚类以启动前血小板形成。我们的研究在此基础上，重点关注巨核细胞发育的早期阶段，揭示了维持细胞在G1和G2/M期如何为巨核细胞成熟做准备，从而将此框架扩展到包括G1和G2/M期细胞对更高血小板产量的更广泛贡献。
此调控的分子机制集中在KAT7在维持染色体稳定性方面的作用。在正常细胞增殖和分裂过程中，KAT7通过促进着丝粒处CENP-A的沉积和对抗Suv39h1介导的异染色质扩散来调控染色体稳定性。KAT7和Suv39h1之间的这种平衡对于维持着丝粒完整性和准确的染色体分离至关重要。实际上，KAT7缺乏会降低Suv39h1和CBX5表达，导致染色体不稳定性并随后激活cGAS-STING通路。这种效应反过来将DNA损伤与先天免疫反应联系起来，从而促进促炎因子(如IL-6、IL-8和TNF-α)的产生。在这些因子中，TNF-α直接触发从G1或G2/M间期向G0的转变，可能建立一个有害的反馈回路，进一步损害imMKCLs的血小板生成能力。然而，在我们的实验设置中，需要≥10,000 pg/mL的TNF-α浓度才能对细胞周期分布和增殖产生明显影响，这远高于KAT7抑制后检测到的内源性TNF-α水平(约100 pg/mL)。这种差异表明，生理水平的TNF-α单独无法完全解释观察到的表型。鉴于KAT7抑制诱导多种细胞因子，我们假设这些因子之间的协同相互作用导致细胞周期停滞和血小板生成能力受损。
尽管我们没有详细比较原代巨核细胞和iPSC衍生imMKCLs的异质性，但我们的发现为这种巨核细胞异质性提供了重要见解。最近基于单细胞RNA-seq的证据确定了不同的巨核细胞亚群，包括具有免疫偏向特性的亚群。一致地，我们已证明imMKCLs也表现出异质性，免疫偏向亚群的失调损害iPSC-PLT生产。在此背景下，KAT7可能作为调节血小板生成型和免疫偏向型巨核细胞之间平衡的分子开关。年龄依赖性KAT7水平降低可能通过激活炎症通路使这种平衡向免疫偏向亚群转移，这让人联想到调控imMKCLs中免疫偏向亚群的let-7/RALB轴。
总之，我们的研究确立KAT7作为通过维持染色体稳定性将细胞周期动态与体外/体外血小板生成潜力联系起来的关键调节因子。这些发现不仅解释了增殖与血小板生产之间的相关性，还为监测iPSC-PLT生产的质量控制提出了新策略。旨在维持KAT7活性或减轻其缺乏的下游效应的干预措施有望提高iPSC-PLT制造的效率和临床适用性。
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