尽管衰老细胞可以被免疫系统消除，但它们往往随着年龄的增长而在各种组织中积累。本研究表明，衰老细胞可以通过在其表面增加双唾液酸神经节苷脂GD3的表达，从而逃避自然杀伤（NK）细胞的免疫清除。随着肝、肺、肾或骨骼中衰老细胞GD3表达水平的自然升高，NK细胞介导的免疫监视受到强烈抑制。在小鼠中，我们发现用抗GD3免疫疗法靶向GD3+衰老细胞可以减轻实验诱导或与年龄相关的肺和肝纤维化以及与年龄相关的骨重塑。这些结果表明，GD3的上调赋予了衰老细胞免疫特权。我们提出GD3作为衰老免疫检查点（SIC），使衰老细胞能够逃避免疫监视并在衰老过程中引发免疫无能。
为了了解衰老细胞如何逃避免疫系统，我们使用裸鼠体内Matrigel插件实验研究了人类复制性衰老细胞（SnCs）的免疫反应。具体而言，人类肺原代成纤维细胞（MRC5）被培养至复制性衰老，定义为至少90%的衰老相关β-半乳糖苷酶阳性（SA-β-Gal+）和10%的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷阴性（EdU-）细胞群；增加了DNA损伤反应，包括端粒处的反应；增加了_CDKN2A_和_CDKN1A_的表达；丰富了多个衰老特征；以及在转录组水平（定量聚合酶链反应（qPCR）和RNA测序（RNA-seq）分析）增加了可溶性和促炎分子的表达。与先前报道一致，人类复制性SnCs诱导的先天免疫招募广泛，增加了NK细胞（CD3-NK1.1+CD2+）和中性粒细胞（CD11b+Ly6G+Ly6C-）的浸润。这一招募取决于衰老相关分泌谱型（SASP），因为用相同SnCs的条件培养基进行的体内Matrigel实验或体外跨孔迁移实验增加了小鼠（扩展数据图2c）和人类（图1d）NK细胞的招募。值得注意的是，虽然Matrigel插件中的SASP略微增加了NK细胞的脱颗粒作用（扩展数据图2d），但在体内由人类SnCs招募的NK细胞的脱颗粒作用比由增殖细胞招募的NK细胞减少了两倍（图1e）。同样，在体外共培养实验中（图1f-j），人类SnCs强烈抑制了小鼠NK细胞的脱颗粒作用，而对干扰素-γ（IFN-γ）的产生没有影响（扩展数据图2f,g）。复制性人类SnCs也抑制了人类NK细胞的脱颗粒作用（图1h）和人类特异性NK细胞的杀伤力（图1i）。同样，在纯化的与小鼠SnCs（照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs））共培养的小鼠NK细胞中观察到了小鼠NK细胞脱颗粒作用的抑制（图1j）。因此，尽管人类SnCs的SASP增强了小鼠和人类NK细胞在体外和体内的招募，但人类复制性和小鼠辐射诱导的SnCs通过一种独立于SASP的机制抑制了小鼠和人类NK细胞的功能（脱颗粒和杀伤）。
由于SASP不足以模拟SnCs对NK细胞脱颗粒的免疫抑制作用（扩展数据图2d），我们假设细胞表面分子，主要由糖蛋白和糖脂组成，参与其中。我们使用质谱分析了增殖性和衰老MRC5细胞的糖萼组成，重点关注糖鞘脂（图2a）、O-聚糖（扩展数据图3a-c）和N-聚糖（扩展数据图3d,e）。质谱分析显示，增殖性MRC5 N-聚糖由寡甘露糖化（Man5GlcNAc2到Man9GlcNAc2）、中性和复杂唾液酸化LacNAc含N-聚糖组成，而O-聚糖仅由单唾液酸化和双唾液酸化短O-聚糖构成（扩展数据图3b,d）。与增殖性年轻MRC5细胞相比，复制性SnCs的N-聚糖和O-聚糖未发生显著变化（扩展数据图3c,e）。相比之下，复制性SnCs的糖鞘脂模式发生了变化。虽然年轻细胞含有中性球状体（Gb3和Gb4/GA1）和神经节苷脂（GM3、GM2和GM1唾液酸化），复制性SnCs主要含有神经节苷脂，尤其是双唾液酸化神经节苷脂（GD3）显著上调（图2a）。流式细胞术和免疫荧光（IF）分析（图2b,c和扩展数据图4a）证实了复制性SnCs中GD3表达的诱导。基于神经节苷脂生物合成途径基因的表达（图2d），我们发现只有编码ST8SIA1的基因在复制性SnCs中显著增加（图2e）。_ST8SIA1_的表达不是逐渐增加，而是在衰老开始时被诱导并大幅上调（扩展数据图4b）。GD3未在增殖性MRC5细胞或复制性SnCs的上清液中检测到，排除了GD3是SASP成分的假设（扩展数据图4c）。这种_ST8SIA1_表达的上调和高水平的GD3也在由多种应激源（图2f和扩展数据图4d）诱导的早衰人类SnCs以及照射的MEFs（图2f和扩展数据图4a）中观察到。
相比之下，当MRC5细胞的衰老是由癌基因激活（癌基因诱导的衰老（OIS）；扩展数据4e,f）引起时，_ST8SIA1_的表达相较于复制性衰老细胞有所下调（图3a-c）。类似的，结果在OIS WI38成纤维细胞或人乳腺上皮细胞（hMECs）中获得（扩展数据图4e,g,h）。相应地，在2个月大的KRasG12D表达小鼠的肺部，OIS细胞，定义为SA-β-Gal+细胞，不表达GD3（扩展数据图4i,j）。NK细胞的招募能力不受GD3表达的影响（图3d和扩展数据图2b-d），这表明SASP的趋化功能和GD3的免疫抑制作用之间存在解耦。与缺乏GD3表达一致，OIS细胞增加了NK细胞在体外（图3e）或体内Matrigel实验（图3f）中的脱颗粒作用，所有其他类型的SnCs通过诱导GD3消除了NK细胞在体内（图3f）或体外（图2g）的脱颗粒作用。
为了研究复制性SnCs和OIS细胞之间ST8SIA1/GD3差异表达的调控机制，我们通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析了潜在的_ST8SIA1_调节网络。该分析提示了包括NFκB、MAPK或PGC-1α通路在内的信号通路对_ST8SIA1_表达的调控（图3g,h）。为了提高候选通路调控_ST8SIA1_在衰老过程中的准确性，我们通过RNA-seq数据（图3b，扩展数据图1h和补充表1）丰富了通路分析（Enriched Network Analysis）。富集网络指出了PGC1α/ERRα通路是_ST8SIA1_基因表达的关键调节因子（图3g,h），已知该通路在与衰老相关的代谢变化和线粒体功能障碍中起作用。针对PGC1-α（SR18292）和ERRα（XCT790）的抑制剂处理复制性SnCs显示了ERRα在调节_ST8SIA1_和GD3表达方面的重要作用（图3i,j）。值得注意的是，与复制性SnCs相比，OIS细胞表达较低水平的_PGARCG1A_（PGC1-α）和_ST8SIA1_基因以及较高水平的_ESRRA_（ERRα）和_NRIP1_（RIP140）基因（图3k-m,o）。总体而言，复制性SnCs和OIS细胞之间存在相反的_PGARGC1A/ESRRA_和_PGARGC1A/NRIP1_比率（图3n,p）。这表明OIS细胞通过RIP140抑制_ST8SIA1_基因表达，而复制性SnCs通过增加PPARGC1A激活_ST8SIA1_基因表达（图3q）。
由于已知GD3会触发抑制性免疫受体Siglec-7（或小鼠中的Siglec-E/H）20,21，我们测试了假设，即SnCs中这种神经节苷脂的高产介导了NK细胞抑制。可溶性重组Siglec-7受体与衰老MRC5细胞的结合显著增加，而在增殖性MRC5细胞中几乎不存在（图4a）。这种结合完全被酶处理（唾液酸酶，水解末端N-酰基或O-酰基唾液酸；图4a）所消除，揭示了唾液酸可以结合抑制性受体Siglec-7。一致地，OIS细胞（不表达GD3）增加了NK细胞在体外（图2d）或体内Matrigel实验（图2e）中的脱颗粒作用，所有其他类型的SnCs诱导GD3消除了NK细胞在体内（图2e）或体外（图2f）的脱颗粒作用。NK细胞的招募能力不受GD3表达的影响（图2g和扩展数据图2b-d），这表明SASP的趋化功能和GD3的免疫抑制作用之间存在解耦。相应地，唾液酸的消除使用唾液酸酶（图4a）或通过敲低_ST8SIA1_（扩展数据图5a,b）完全恢复了SnCs激活NK细胞脱颗粒的能力（图4a和扩展数据图5d），但未增加IFN-γ的产生（扩展数据图5i）。相反，过表达_ST8SIA1_导致年轻分裂细胞（扩展数据图5e-g）中GD3的表达抑制了NK细胞脱颗粒，这一过程被唾液酸酶处理所削弱（图4c和扩展数据图5h）。敲低SnCs中的_ST8SIA1_表达不会改变衰老状态，如相似比例的SA-β-Gal+细胞和缺乏增殖（扩展数据图5a-d）所示。相反，过表达_ST8SIA1_的增殖细胞不会进入衰老并保持增殖（扩展数据图5g）。这些观察结果表明，尽管GD3的上调可能与衰老程序有关，但GD3表达并不会诱导衰老。通过抗GD3单克隆抗体（mAb）靶向GD3足以以剂量依赖性方式恢复小鼠NK细胞脱颗粒（扩展数据图6a-d），以及人类原代NK细胞脱颗粒（图4e和扩展数据图6f）和杀伤（扩展数据图6e）。GD3+ SnCs的免疫抑制能力影响NK脱颗粒，但似乎并未显著影响IFN-γ的产生能力（扩展数据图2f,g, 5i 和 6b,d）。这与IFN-γ的产生可以由其他免疫细胞（如树突状细胞或巨噬细胞）的信号诱导相一致。这确认了GD3依赖的NK细胞抑制并不依赖于SASP或另一个免疫区室的作用。通过重新挑战NK细胞以强免疫原性癌细胞系YAC-1评估了SnCs中GD3诱导的NK细胞抑制的幅度（图4f）。SnCs中的GD3足以深度抑制NK细胞的功能，使其完全对YAC-1细胞无能（图4g）。这种效应完全被在共培养中添加抗GD3 mAb所缓解（图4f,g），表明GD3可以使SnCs中的癌症免疫逃逸。这表明，随着衰老，GD3+ SnCs的积累通过早期阻断NK细胞依赖的免疫监视促进了与年龄相关的癌症的出现。总的来说，这些结果表明，衰老细胞中GD3的水平决定了其被NK细胞消除的能力。
为了评估NK细胞监视因GD3表达的SnCs而减弱的病理生理影响，我们分析了受损肺中SnCs的GD3表达。最近的研究已建立了SnC积累、纤维化和肺疾病之间的明确联系17,22,23，这一过程可以通过在小鼠气管内注射博莱霉素进行研究24。如预期，博莱霉素治疗增加了胶原沉积（图5a,b）。纤维化区域含有表达GD3的SA-β-Gal+细胞（图5b,c和图6a）。荧光SA-β-Gal测定和GD3染色通过流式细胞术分析显示，与正常肺相比，纤维化肺中GD3+SA-β-Gal+细胞数量增加了两倍，总GD3+细胞数量增加了三倍以上（图6a）。与人类肺纤维化不同，博莱霉素诱导的纤维化会自发消退25。实际上，我们在第120天观察到纤维化病变部分消退（图5f,g），胶原沉积显著减少（图5g，左面板），但GD3强度相似（图5g，右面板），提示纤维化残余中GD3+ SnCs的存在。在纤维化肺的第27天，我们观察到整体免疫浸润略有改变，NK细胞更多（扩展数据图5j）。然而，这些NK细胞在离体再挑战实验中对YAC-1细胞的脱颗粒作用较其对照细胞更弱（图5d）。因为远离肺部的NK细胞（脾脏）的功能未受博莱霉素治疗影响（图5e），这表明肺部的GD3+ SnCs不太可能对NK细胞抑制产生全身性影响。这些观察结果表明，SnCs中GD3的上调足以使其逃脱NK细胞的清除。
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