摘要
双等位基因变异在腺苷脱氨酶tRNA特异性3（ADAT3）基因中与一种独特的神经发育障碍有关，其特征包括畸形面容、生长迟缓、认知障碍以及可变的脑部异常。我们描述了来自16个不相关埃及家庭的24名患者，他们均患有ADAT3相关的神经发育障碍。所有患者都表现出发育迟缓、生长迟缓、认知障碍以及该疾病特有的面部特征，这些特征在年龄较大的患者中更容易识别。20%的患者出现癫痫发作并对治疗反应良好。脑成像显示大多数患者（91.6%）存在胼胝体异常，其次是髓鞘化延迟和皮质萎缩。外显子组测序鉴定出三种ADAT3变异，包括沙特创始变异c.430G>A（p.Val144Met），该变异在17名患者中检测到（70%）。此外，还发现了两种新变异：c.319G>A（p.Glu107Lys）和c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）。c.319G>A（p.Glu107Lys）在6名患者中复发（25%），且具有相似的单倍型，表明在我们的群体中可能存在创始效应。而c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）仅在一名患者中发现。我们的研究报道了一组来自埃及的大规模ADAT3相关神经发育障碍患者队列，并强化了对该疾病临床和脑成像特征的认识。我们群体中c.430G>A（p.Val144Met）的高频率强烈表明这种变异在中东和阿拉伯地区存在创始效应。此外，我们报告了一个新的创始变异，进一步扩展了这一罕见疾病的突变谱。
引言
作用于tRNA的腺苷脱氨酶（ADATs）是一类修饰转运RNA（tRNA）的酶，tRNA是将遗传密码翻译为蛋白质的关键分子。这些酶将腺苷转变为肌苷，使tRNA能够与多个密码子配对，在蛋白质合成过程中发挥重要作用。人类有三种ADAT酶（ADAT1、ADAT2和ADAT3），每种都有独特的作用，结构分析阐明了它们在tRNA编辑中的具体贡献。ADAT1在位置37处编辑tRNA-Ala，而ADAT2和ADAT3形成一个复合物，靶向多个tRNA的位置34（摇摆位置），这是在细胞应激下确保翻译保真度的重要机制。ADAT2/ADAT3复合物的结构研究表明ADAT3如何稳定该酶，突出其在哺乳动物中的重要性。这一过程的破坏可能导致蛋白质合成受损，从而引发神经功能障碍。
ADAT3位于染色体19p13.3上，由两个外显子组成。第一个外显子是非编码的，而第二个外显子编码367个氨基酸，包括高度保守的功能性脱氨酶域CMP/dCMP型。双等位基因变异与一种以生长迟缓、畸形面容和脑部异常为特征的神经发育障碍相关（OMIM# 615286）。患者表现出一系列临床特征，包括全面发育迟缓、小头症、肌张力低下、生长迟缓和智力障碍。斜视、前额突出、向上倾斜的眼裂和鼻梁凹陷是该疾病的典型面部特征。癫痫发作和脑部异常等神经系统表现常被报道，同时伴有行为问题。一些病例可能表现为内分泌功能障碍（如生长激素缺乏或肾上腺功能不全），进一步突显了ADAT3缺陷的系统性影响。
迄今为止，文献中共描述了来自29个无关家庭的60名携带ADAT3变异的患者。c.430G>A（p.Val144Met）是最常见的变异，出现在26/29个家庭中（频率约为90%）。这些家庭大多来自沙特阿拉伯，因此该变异被称为“沙特创始变异”。
在此，我们介绍了24名携带ADAT3变异的新患者的临床、脑成像和分子数据。据我们所知，这是埃及和北非首次报道的一个大规模ADAT3相关神经发育障碍患者队列。
患者与方法
患者
本研究包括24名来自16个无关家庭的患者，这些患者是从开罗埃及国家研究中心（NRC）神经遗传学/小儿神经病学诊所和临床遗传学系门诊招募的。该研究得到了NRC医学研究伦理委员会的批准，并符合1995年《赫尔辛基宣言》（2008年首尔修订版），并获得了父母关于研究参与和在线开放获取出版的照片的书面知情同意书。所有患者均接受了详细的病史采集、完整的体检、全面的神经评估和基本的人体测量，包括头围、身高和体重。通过摄影记录并记录了畸形特征。进行了核型分析、扩展代谢筛查、眼科评估、听觉脑干诱发电位、脑电图（EEG）、肌电图（EMG）、神经传导速度（NCV）和脑MRI等检查。当需要时还进行了甲状腺功能测试和生长激素测定（基础和刺激后）。使用斯坦福-比奈智力量表第5版对智力障碍进行评估。
方法
基因组DNA提取
使用PAXgene Blood DNA Kit（QIAGEN，德国）从患者及其父母的外周血淋巴细胞中提取DNA，按照制造商的说明进行操作。
外显子组测序
对每个家庭的一名患者进行了外显子组测序（ES）。使用xGen Exome Research Panel v2（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州科维尔）进行外显子捕获，并使用NovaSeq 600（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行测序。大约98.9%的目标碱基覆盖深度≥20x。获得的序列与UCSC人类基因组GRCh37/hg19对齐，并使用GATK流水线验证变异。使用BaseSpace Variant Interpreter Server对变异进行注释。根据遗传模式、对基因产物的影响、次要等位基因频率和多种计算机预测的致病性对变异进行优先排序。我们专注于与患者表型相关的罕见双等位基因变异（新发或≤0.001在公共遗传数据库中）。
分离分析
使用Sanger测序对三个已鉴定的ADAT3变异在父母和其他受影响的兄弟姐妹中进行分离分析。引物由Primer3 SOFTWARE设计。PCR循环条件为：96°C初始变性5分钟；30个循环，96°C变性30秒；62°C退火30秒；72°C延伸30秒；最后72°C延伸5分钟。使用Exo-SAP PCR Clean-up kit（Thermo Fisher Scientific，德国）纯化PCR产物，并使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）双向测序，并在ABI Prism 3500 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上按照制造商的说明进行分析。
新错义变异的计算机分析
通过各种基于网络的计算机工具评估检测到的新错义变异的致病性，包括SIFT、DANN、PrimateAI、Polyphen-2、MutationTaster和REVEL。进一步检查MetaDome webserver以了解变异的耐受性。应用HOPE项目研究变异对蛋白质结构的影响（HOPE，https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/）。使用I-Mutant2.0、MUpro和DynaMut2评估变异对蛋白质稳定性的影响。使用MusiteDeep预测与改变的氨基酸序列相关的可能转录后修饰（PTM）。使用RNAfold web服务器（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）研究突变序列的mRNA二级结构的最小自由能（MFE）变化与野生型相比的变化。
结果
24名患者的详细临床和分子数据总结在表1中。
表1 研究的携带纯合ADAT3变异的患者的临床、脑成像和分子发现。
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临床数据
患者中有16名女性和8名男性，年龄范围从10个月到40岁。所有患者（100%）均有近亲婚配。16/24名患者（66%）中观察到类似受影响的家庭成员。所有患者都有明显的发育迟缓。19/24名患者（79%）记录了严重的认知障碍。包括自闭症特征、多动/注意力缺陷多动障碍（ADHD）、类似手淫动作、恐慌发作、易怒和睡眠障碍在内的行为问题分别记录在6名患者（25%）、3名患者（12.5%）、4名患者（16.7%）、2名患者（8.3%）、1名患者（4.1%）和1名患者（4.1%）中。18名患者（75%）和5名患者（20%）分别记录了语言贫乏和无语言。5名患者（20%）记录了癫痫发作，并通过多种抗癫痫药物控制。
人体测量显示12名患者（50%）有小头症，15名患者（62.5%）体重不足，16名患者（66%）身材矮小。所有患者（100%）都注意到畸形特征。目前患者中最常见的面部特征是：高额头（100%）、斜视（100%）、内眦赘皮（100%）、前额突出（91%）、眼睑褶皱（87%）、鼻梁凹陷（87%）、大耳朵（83%）、向上倾斜的眼裂（75%）、突出的鼻子（70%）、短鼻子（66%）、低位耳（41%）和小颌畸形（37%）（图1）。神经系统检查显示11名患者（45%）有轴性低张力，11名患者（45%）有四肢低张力，12名患者（50%）有四肢高张力。我们的患者中没有发现神经病变或挛缩。以生长激素缺乏形式的内分泌功能障碍在6名患者（25%）中被注意到。在一个患者中观察到罕见的发现，包括巨齿症、牙齿萌出延迟和鸡胸。
图1
我们患者的面部特征。请注意高而突出的前额、斜视、内眦赘皮、向上倾斜的眼裂、突出的鼻子、小颌畸形、大而低位的耳朵，以及异常的牙齿（P3）和鸡胸（P7）。此外，随着年龄增长，面部特征变得更加明显，如P7所示。
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神经影像学结果包括胼胝体异常（缺失、发育不全或发育不良）在22名患者（91%）中，其次是白质异常，无论是髓鞘化缺陷（16名患者；66.6%）还是体积减少（13名患者；54%），以及轻度皮质萎缩（8名患者；33%）。值得注意的是，所有患者中除了一个患者外，均未发现小脑受累，该患者表现出轻度小脑和脑干发育不全，以及胼胝体缺失（Pt 24）（图2）。
图2
患者的MRI：矢状面切片（A-H）显示胼胝体异常（细白箭头）：胼胝体薄（A、B、D、E）、胼胝体发育不良（C、F、G）、胼胝体缺失（H）以及小脑蚓部和脑干轻度发育不全（H）（粗白箭头，P24）。横断面切片（I-P）显示轻度皮质萎缩变化（I、J、L、N、O）（黑边白箭头）、深部白质变化（K、L、M、P）（黑箭头）、侧脑室轻度扩张和胼胝体缺失（P）（白箭头）、侧脑室轻度扩张（I、K、L、M）。
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分子数据
外显子组测序在所有患者中鉴定了三种ADAT3（NM_138422.4）的纯合变异。先前报道的致病性错义变异c.430G>A（p.Val144Met）在17名个体中检测到，来自11个不相关的家庭（频率70%）。一个新的错义变异c.319G>A（p.Glu107Lys）在6名患者中反复出现，来自四个不相关的家庭（频率25%）。此外，一名患者（患者21）被发现携带一个框内重复变异，c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）。这三种变异在所有家庭中与表型共分离（图3A）。c.319G>A（p.Glu107Lys）和c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）在公共遗传数据库（gnomAD v.4、千人基因组数据库、GME Variome或ClinVar）或我们的内部数据库中未找到。根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）分类，c.319G>A（p.Glu107Lys）应被归类为“可能致病”变异，而c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）为“意义不确定变异”。这两个变异已提交至ClinVar，登录号为SCV005373787。
图3
（A）部分测序电泳图显示我们研究中鉴定的三种ADAT3变异。箭头指示变异位点。（B）示意图显示ADAT3编码外显子、蛋白质结构域和迄今为止报告的所有变异，包括我们的两个新变异（红色）。
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错义变异的计算机预测
通过使用计算机预测工具，c.319G>A（p.Glu107Lys）被SIFT、DANN和PrimateAI预测为有害，而被PolyPhen-2、MutationTaster和REVEL预测为良性。MetaDome web服务器显示该变异位于对错义变异略不耐受的区域。根据HOPE，蛋白质结构可能会受到影响，并且由于突变赖氨酸的不同大小和电荷，预测会破坏野生型谷氨酸和95位精氨酸残基之间的盐桥。此外，MUpro、I-Mutant2.0和DynaMut2显示突变蛋白的稳定性降低（图4）。MusiteDeep工具预测突变赖氨酸的甲基化作为PTM（阈值：0.532）。突变序列的mRNA二级结构显示最小自由能相对于野生序列发生变化（MFE= −785，−788）（图S1）。计算机结果汇总在（表2）中。
图4
（A）根据HOPE项目，ADAT3中野生型和突变残基的结构变化。放大新检测到的变异（p.Glu107Lys），蛋白质呈灰色，野生型（谷氨酸）和突变型（赖氨酸）残基的侧链分别为绿色和红色。（B）根据DynaMut2，野生型107位谷氨酸和95位精氨酸残基之间盐桥的放大图（黄色虚线表示）。
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讨论
ADAT3相关的神经发育障碍非常罕见，文献中仅报道了来自29个无关家庭的60名患者。我们的研究报道了另外24名患者，并显著加强了临床和神经影像学特征。我们所有的患者都共享了该疾病的核心临床特征，包括畸形面容、运动迟缓、言语延迟或缺失以及中度至重度的认知障碍。斜视、前额突出、内眦距离宽、内眦赘皮、鼻梁凹陷和向上倾斜的眼裂是我们识别出的最常见的面部特征。这些面容在较年长的患者中更为明显且容易识别。小头症、生长迟缓和低张力是我们患者的常见发现，与之前的报道一致。尽管癫痫发作在携带ADAT3变异的患者中并不常见，但在我们的队列中有5名患者（20%）出现了癫痫。有趣的是，这5名患者对抗癫痫药物反应良好。与之前的报道不同（表2），行为问题（自闭症、多动、注意力缺陷多动障碍和恐慌发作）在我们的患者中很常见，13/24名患者（54%）出现了这些问题。
表2 新ADAT3变异的计算机分析。
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表3 报告的携带双等位基因ADAT3变异病例的临床和分子特征。
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在我们的患者中注意到的罕见发现包括巨齿症、牙齿萌出延迟和鸡胸。相反，足内翻、手指和手腕挛缩、神经病变、子弹形远端指骨和喂养困难在我们的任何患者中均未发现，尽管在携带ADAT3变异的患者中曾有报道。
令人惊讶的是，脑部MRI显示胼胝体异常的普遍性，范围从完全胼胝体缺失到压部发育不全和体部发育不良，在22/24名患者（91%）中发现。在有可用脑成像数据的报告患者中，胼胝体异常较少见，仅在9/27名患者中发现（表2）。66.6%的患者发现髓鞘化缺陷，突显了ADAT3活性在白质发育中的关键作用。值得注意的是，我们的一名患者有轻度小脑蚓部和脑干发育不全，这在之前的报告中未记录。
迄今为止，仅描述了五种不同的ADAT3变异。它们分别是三种错义变异[c.430G>A（p.Val144Met）、c.587C>T（p.Ala196Val）和c.586_587delinsTT（p.Ala196Leu）]、一种无义变异（c.820C>T，p.Gln274）和一种移码变异（c.99_106dup，p.Glu36Glyfs44）（图3B）。c.430G>A（p.Val144Met）是由蛋白质第144位缬氨酸被甲硫氨酸替代引起的，是在几乎所有90%的患者中最常见的变异。该变异最初在几个沙特阿拉伯家庭中描述，并发现其携带频率为1%。随后的研究在也门、阿拉伯以色列、科威特和苏丹的散发病例中报告了p.Val144Met。有趣的是，其余两种错义变异（p.Ala196Val和p.Ala196Leu）影响密码子196，表明在这个残基上的改变会破坏ADAT3功能并导致神经发育表型。值得注意的是，p.Ala196Val在两名不相关的欧洲患者中以杂合状态与另一种变异一起被描述。其他ADAT3变异（p.Glu36Glyfs44、p.Ala196Leu和p.Gln274）非常罕见，每种变异仅在一个患者中发现。
在当前研究中，我们描述了来自埃及的24名携带纯合ADAT3变异的新患者。有趣的是，我们在队列中观察到一种同质的突变模式，因为仅鉴定了三种变异。其中，c.430G>A（p.Val144Met）在17/24名患者中被发现，频率为70%。我们人群中p.Val144Met的高频率与之前的报道一致，并表明它很可能在中东和阿拉伯国家中具有创始效应。然而，确认这一假设需要识别该地区的其他国家的额外病例。
除p.Val144Met外，我们还鉴定了两种新变异，c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）和c.319G>A（p.Glu107Lys）。c.1013_1018dup（p.Arg338_Ile339dup）是一种框内重复两个氨基酸的变异，在一名患者中发现。该变异影响CMP/dCMP型脱氨酶域，这对ADAT3功能至关重要。据我们所知，这是首次在携带ADAT3变异的患者中报告的框内插入缺失变异。总体而言，gnomAD v.4数据库中不存在纯合框内插入缺失变异，支持我们变异的致病性。
c.319G>A（p.Glu107Lys）变异在来自四个不相关家庭的6名患者中发现（频率25%）。这种变异在我们人群中的相对高频率使我们怀疑存在创始效应，这一点通过携带该变异的患者中存在一个共享的3.89 Mb纯合区域（从chr19:625,198到chr19:4,511,647）进一步证实，该区域包含ADAT3。c.319G>A（p.Glu107Lys）不在所有公共遗传数据库或我们的内部数据库中，并影响一个适度保守的残基。大多数计算机预测工具（主要依赖进化保守性、序列同源性和氨基酸物理性质等参数）对其致病性的解释存在冲突。然而，研究变异对蛋白质结构和稳定性的影响推测其具有负面影响。此外，突变mRNA的MFE评分的轻微变化可能会影响RNA稳定性。总体而言，c.319G>A（p.Glu107Lys）被认为会对ADAT3的自然结构和功能产生负面影响。然而，需要通过实验室实验进一步验证以确认其在疾病病理生理学中的作用。
ADAT3变异与临床表型之间的关联仍然复杂，因为受影响个体之间观察到广泛的表型谱和表达变异性，以及报告的变异数量有限。错义变异通常导致斜视和中度至重度智力障碍。在一名携带无义变异p.Gln274和p.Ala196Val的患者中观察到更严重的表型，可能是由于蛋白质功能的完全丧失，影响ADAT2/ADAT3结合。然而，一名携带纯合移码变异（p.Glu36Glyfs44）的患者与较轻的表型相关。因此，表型-基因型关联难以建立，不能排除涉及其他因素如表观遗传因素或基因修饰的可能性。
结论
我们描述了一组携带纯合ADAT3变异的大规模患者队列，并强调了临床和脑成像特征。斜视、畸形面容、智力障碍和胼胝体发育不全的组合似乎具有诊断意义，并指向ADAT3相关障碍的诊断。c.430G>A（p.Val144Met）的高频率证实了之前的报道，并表明在中东和阿拉伯地区存在创始效应。我们还鉴定了两种新变异，包括一种独特的埃及创始变异，扩展了该疾病的突变谱并丰富了群体遗传数据库。
(全文结束)