dysferlin在心肌梗死后稳定心肌细胞膜纳米域
摘要
尽管急性监护医学取得了进步，但心肌梗死仍然是导致早逝和心力衰竭的主要原因。在心肌梗死边缘区，心肌细胞承受高生物力学应力，这会损害肌膜的完整性。因此，我们假设Ca²⁺敏感的膜修复蛋白dysferlin对于保存心肌梗死边缘区的肌膜纳米域（如横轴小管网络和闰盘膜折叠）至关重要，从而限制梗死后心肌功能的丧失。我们采用左前降支结扎诱导野生型与dysferlin基因敲除小鼠的心肌梗死。免疫组织化学显示，野生型心肌梗死边缘区心肌细胞中dysferlin表达上调230%，而基因敲除小鼠在梗死后一周呈现更大的梗死面积和降低的左心室收缩功能。为了解析dysferlin在梗死后左心室重塑中的作用，我们应用数据非依赖性采集质谱分析野生型与基因敲除心脏的空间蛋白质组学图谱。总共，DIA-MS在所有小样本中定量了5700种蛋白质，从而识别出梗死后一周左心室梗死区、边缘区和远隔区数百个基因型特异性的蛋白质组变化。结合我们的蛋白质组学结果，共聚焦和受激发射损耗超分辨率显微镜观察到心肌梗死边缘区心肌细胞中严重降解的TAT膜和增大的闰盘膜折叠。重要的是，大量dysferlin信号聚集在残留的TAT结构和闰盘处的连接蛋白43斑块附近，表明dysferlin在肌膜纳米域组织中起稳定作用。事实上，基于免疫共沉淀的DIA-MS和复杂组学分析解码了dysferlin的功能性心脏相互作用组，确认了TAT和闰盘纳米域处的主要dysferlin相互作用伙伴。总之，dysferlin代表了一个新的分子靶点，保护心肌梗死边缘区心肌细胞肌膜纳米域的完整性，从而减少梗死后收缩力的丧失。
引言
2019年，57个ESC成员国估计发生了580万例新发缺血性心脏病，通常首先表现为急性心肌梗死。尽管急性心肌梗死患者监护的进步显著降低了早期死亡率和事件率，但对长期生存的影响却不那么显著。心肌梗死后心力衰竭的进展不仅取决于即时心肌损伤的程度，还取决于关键应激心肌细胞的有效修复机制。在心肌梗死边缘区，心肌细胞面临缺氧、炎症和高生物力学应力，所有这些都可能损害高度组织的肌膜的完整性。因此，我们认为膜修复和重塑机制可能对于减少心肌梗死边缘区有丝分裂后心肌细胞的死亡并保持收缩力至关重要，最终降低患者缺血性心肌病的负担。
心肌细胞肌膜是一个动态的双层结构，承受周期性应变，提供重要的屏障，将胞质成分与细胞外环境分隔开，并在专门的纳米域中整合重要的细胞功能。外表面肌膜的规则内陷形成横轴小管内膜系统，由每个肌节Z线处的横管通过轴向小管组件相互连接组成。TAT网络与肌浆网的连接膜复合体，称为心脏二元体，介导心肌细胞中Ca²⁺诱导的Ca²⁺释放，但在心力衰竭中会降解。在心肌细胞侧面的细胞间接触位点，肌膜在闰盘处高度折叠，具有电和机械连接，将单个心肌细胞连接成一个功能合胞体。闰盘电连接或间隙连接由相邻细胞的两个相对连接子形成——每个连接子由心室心肌细胞中的6个连接蛋白43蛋白组装成孔道形成半通道。在闰盘的多种机械连接中，我们强调粘附连接，其跨膜蛋白N-钙黏蛋白组装了心肌细胞间的细胞间连接，并赋予细胞收缩装置的连续性。然而，关于心肌梗死边缘区心肌细胞中这些功能性膜纳米域的重塑和可塑性，以及可能保护和塑造它们的局部膜融合和修复机制，目前知之甚少。
Dysferlin是一种237 kDa的Ca²⁺结合跨膜蛋白，具有8个C2结构域，促进横纹肌细胞中Ca²⁺依赖的膜融合和修复事件。DYSF的功能丧失突变导致进行性骨骼肌疾病表型，称为肢带型肌营养不良R2，与轻度扩张型心肌病相关。在骨骼肌细胞中，dysferlin被认为与其他膜相关蛋白如mitsugumin-53和膜联蛋白家族相互作用，招募和融合修复性囊泡到受损膜区域。重要的是，dysferlin基因敲除小鼠的心脏似乎表现出从缺血/再灌注损伤中恢复受损。由于dysferlin最近被发现定位于TAT膜和闰盘膜折叠附近，我们假设dysferlin对于稳定心肌梗死边缘区心肌细胞中的这些纳米域至关重要，保护肌膜完整性，并最终减少左心室收缩功能的丧失。
在这里，我们应用无标记数据非依赖性采集质谱，解析野生型与dysferlin基因敲除小鼠心肌梗死后心脏的梗死区、边缘区和远隔区的区域特异性蛋白质组学图谱。总体而言，DIA-MS定量分析了5700种蛋白质，在区域和基因型之间出现显著的蛋白质组学变化。虽然dysferlin蛋白表达在野生型心脏的梗死边缘区和远隔区上调，但dysferlin缺失高度影响了梗死后区域特异性蛋白质组重塑，导致更大的梗死面积和左心室收缩功能丧失。受激发射损耗纳米镜结合电子断层扫描可视化dysferlin信号累积在纳米级接近严重降解的TAT膜和增大的闰盘膜折叠处，显然在面临高生物力学应力时稳定和修复这些肌膜纳米域。最后，研究心脏dysferlin相互作用组的互补技术表明，闰盘蛋白连接蛋白43、N-钙黏蛋白和β-连环蛋白是功能性高分子量复合物中新的dysferlin相互作用伙伴。
方法
心肌梗死模型
所有动物实验均按照欧洲议会2010/63/EU指令关于保护用于科学目的的动物的指南进行，并经当地兽医州当局批准。该研究按照ARRIVE指南进行报告。使用成年性别混合的野生型和dysferlin基因敲除小鼠，均为C57BL/6J背景至少10代，年龄8至16周，体重17.5–29 g，用于心肌梗死与假手术。腹腔麻醉后，气管插管，通过左侧胸廓切开术打开胸腔，移除心包，用7-0聚酰胺缝合线以U形针穿过左前降支近端下方，永久性闭塞血管。通过前壁颜色变化确认心肌缺血。假手术动物不进行结扎。术后1周和4周，在1%异氟烷麻醉下进行研究者盲法经胸超声心动图测量，采用胸骨旁长轴和短轴视图并监测心电图。
小鼠心脏组织收集
小鼠用2%异氟烷麻醉后进行颈椎脱位。在心肌梗死后1周和4周收集小鼠心脏，使用改良Langendorff灌注系统以4 mL/min的流速逆行灌注0.9% NaCl 2分钟，以洗去心肌中的血液。用于定量SDS-PAGE、DIA-MS、免疫共沉淀蛋白质组学和复杂组学分析的左心室组织在双目变焦显微镜下解剖。
人类心内膜心肌左心室活检
左心室活检取自患有缺血性心肌病的患者。作为对照，使用因移植而被拒绝的非衰竭供体心脏的心肌活检。哥廷根大学医学中心机构伦理委员会批准了该研究，该研究符合赫尔辛基宣言的原则，并在纳入前获得所有患者的书面知情同意。
蛋白质分析
定量SDS-PAGE如前所述进行。每泳道20微克蛋白质在4%至20% Tris–HCl梯度凝胶上进行SDS-PAGE分离。完整的免疫印迹扫描见图S1。一抗的详细信息见补充表1。缓冲液组成见补充表2。
心肌梗死后区域分辨的组织蛋白质组学
心脏取出并经过2分钟Langendorff灌注后，在双目变焦显微镜下使用显微虹膜剪从梗死小鼠心脏中解剖出梗死区、边缘区和远隔区的心肌组织样本，立即在液氮中冷冻。胰蛋白酶消化后，心肌组织样本在2% SDS、100 mM HEPES缓冲液中通过压力循环技术裂解，使用SP3方案在胺包被的顺磁珠上进行胰蛋白酶消化，并在Bruker timsTOF Pro 2质谱仪上通过数据非依赖性采集质谱分析。详细信息见补充材料。
心脏dysferlin相互作用组
左心室心肌通过超速离心制备，并在含有0.15% CHAPS的缓冲液中溶解用于免疫共沉淀实验。将500微克来自野生型和dysferlin基因敲除左心室心肌的膜制备蛋白与4微克抗dysferlin抗体或非特异性兔IgG抗体孵育。随后，使用Dynabeads Protein G沉淀dysferlin和蛋白相互作用伙伴。经过三次洗涤和在95°C下SDS变性后，样品通过SDS-PAGE分离，在凝胶中用胰蛋白酶消化，并在Bruker timsTOF Pro 2上通过DIA-MS分析。
复杂组学分析
左心室心肌的膜沉淀（100,000 g）被溶解，并通过尺寸排阻色谱根据表观分子质量进行分级，如前所述。每个级分随后进行胰蛋白酶消化，然后进行自下而上的质谱蛋白质组学分析。光谱数据使用Spectronaut v16.3分析。对已发表数据集进行重新分析以研究所选蛋白质的共洗脱在Microsoft Excel上进行。
共聚焦显微镜和STED纳米镜
小鼠心脏和人心内膜心肌活检在4% PFA中固定过夜，石蜡包埋，切成5微米厚的切片。脱蜡和复水后，在柠檬酸钠缓冲液中暴露抗原表位，样品在0.1% Triton-X100和4%牛血清白蛋白中透化并封闭1小时。组织切片与一抗在封闭缓冲液中孵育过夜。一抗信息见补充表1。通过包括dysferlin基因敲除小鼠的实验验证一抗特异性。此外，仅使用二抗的对照用于区分真实靶标染色与背景。最后，样品与偶联荧光染料STAR635P和STAR580的二抗孵育2小时，并用ProLong Gold抗褪色封片剂封片。共聚焦图像使用Leica TCS SP8激光扫描显微镜采集，物镜为HC PL APO C2S 100x/1.40油镜、HC PL APO CS2 40x/1.30油镜和HC PL FLUOTAR 10x/0.30干镜，而STED图像使用HC-PL-APO-C2S 100x/1.40油镜采集。图像在ImageJ/Fiji中处理。
电子断层扫描
小鼠心脏用等渗Karnovsky固定液灌注固定。从心肌梗死边缘区切除组织碎片，用100 mM二甲胂酸钠洗涤，在1% OsO₄中后固定，在梯度丙酮中脱水，并包埋在Epon-Araldite树脂中。半厚切片（300 nm）放置在formvar涂层的铜槽网格上，用2%乙酸铀酰水溶液和Reynolds柠檬酸铅后染色。切片使用300 kV Tecnai TF30成像。倾斜系列使用IMOD进行对齐、重建和组合，如前所述。
统计分析
数据以mean±SEM表示。P<0.05视为具有统计学显著性。统计分析使用GraphPad Prism 9.4.0或更新版本、IBM SPSS Statistics 29.0.0.0和R版本4.3.1进行。关于实验设计、样本量、标准化程序、正态性检验、命名统计检验、多重比较的事后校正以及精确P值的详细信息见补充表：统计细节和相应的图例。未应用实验范围内的多重检验校正。选择代表性图像以可视化每组平均值。
结果
心肌梗死边缘区dysferlin表达增加与梗死后心室功能丧失减轻相关
为了探索内源性膜修复蛋白dysferlin在心肌梗死后的作用，我们对8–16周龄的野生型与dysferlin基因敲除小鼠进行了永久性LAD结扎。野生型左心室组织裂解物在梗死后1周的免疫印迹（排除梗死区）显示，与假手术心肌相比，dysferlin蛋白表达增加至155%，雌性和雄性小鼠之间相似。值得注意的是，在小鼠心脏组织中仅观察到全长dysferlin，没有裂解产物。与dysferlin上调相反，我们检测到肌浆网Ca²⁺释放通道ryanodine受体2型表达下降，该受体最近被确定为心肌细胞中dysferlin的蛋白相互作用伙伴，在野生型和基因敲除心肌梗死后心肌中均如此。
为了定位dysferlin在左心室不同区域的局部表达以及梗死后随时间的变化，我们在术后1周和4周对左心室组织切片进行了dys由于局部dysferlin上调可能为心肌梗死边缘区缺氧和机械应激的心肌细胞提供生物学益处，我们试图分析dysferlin基因敲除动物梗死后死亡率和左心室收缩功能。我们预期，在手术前，野生型和dysferlin基因敲除小鼠的死亡率以及左心室壁厚度和功能没有差异。只有左心室舒张末期直径在dysferlin小鼠基线时略有升高。然而，在术后25天的观察期内，我们注意到dysferlin基因敲除小鼠与野生型相比死亡率有升高的趋势，这在雄性小鼠中尤为明显。此外，在梗死后一周进行的研究者盲法经胸超声心动图显示，dysferlin基因敲除小鼠的前壁和后壁厚度较野生型小鼠减少。这可能可以解释为dysferlin基因敲除心肌在左心室容量超负荷下的肥厚反应减弱，正如先前报道的左心室压力超负荷一样。此外，dysferlin基因敲除动物的左心室更扩张，如左心室舒张末期直径所示，并且在梗死后一周左心室射血分数显著降低（LVEF 21% vs 28%）。左心室收缩功能的差异可能部分归因于dysferlin基因敲除动物显著更大的梗死面积，如图1F所示。总之，在野生型小鼠中，dysferlin蛋白表达在心肌梗死边缘区的左心室心肌细胞中上调，这与基因敲除小鼠相比，梗死面积减小和梗死后左心室功能保留相关。
Dysferlin表达塑造左心室梗死后蛋白质组学图谱
为了剖析dysferlin缺失对梗死后左心室重塑的局部后果，我们应用了先前建立的无标记DIA-MS方案，分别分析野生型和dysferlin基因敲除心脏的梗死区、边缘区和远隔区的区域特异性蛋白质组学图谱。为了在DIA-MS分析中最佳分离梗死后左心室区域，我们使用双目变焦显微镜和显微虹膜剪，将边缘区作为紧邻清晰标记的梗死区的薄层心肌切除。基于每个基因型梗死后一周5个心脏和每个样本2个技术重复，我们定量分析了5700种蛋白质，其中4360种在所有样本中检测到。有趣的是，如主成分分析图所示，DIA-MS一方面基于梗死后左心室区域（水平轴，成分1；以下简称“蛋白质类型”），另一方面基于野生型与基因敲除基因型（垂直轴，成分2），将蛋白质组学图谱分开。从假手术左心室心肌到远隔区>边缘区>>梗死区梗死后蛋白质组学转变沿主成分1勾勒出来，反映了超过64%的两种基因型梗死区蛋白质类型与野生型对照蛋白质类型之间的总差异。此外，技术重复聚集在很近的位置，证实了我们方案的可重复性。
所有5602个差异丰度蛋白的热图突出了梗死区蛋白质类型与所有其他存活心肌蛋白质类型（即边缘区、远隔区和假手术左心室组织）之间的显著差异。图2C中的心肌细胞示意图将这些蛋白质类型中差异调控蛋白的百分比投射到基于基因本体细胞成分注释的亚细胞器/区室上。大多数蛋白质归因于细胞核、线粒体和质膜。
为了更详细的分析，图2D至I中展示了成对区域和基因型特异性比较，补充数据：蛋白质组学提供了差异调控蛋白的完整表格，包含log2倍变化和P值。虽然我们重点展示了梗死区、边缘区和远隔区与假手术心肌相比的蛋白质组学变化（图2D、F、H），但在野生型与dysferlin基因敲除的直接比较中也出现了高度相关的变化（梗死区1286个，边缘区725个，远隔区132个调控蛋白）（图2E、G、I）。直接基因型比较中差异丰度蛋白的高数量强调了膜修复蛋白dysferlin在梗死后左心室重塑中的重要性。与免疫印迹和免疫组织化学发现梗死后dysferlin表达上调完全一致，dysferlin蛋白丰度在野生型心肌梗死边缘区和远隔区增加（图2F、H）。相反，SR和Ca²⁺调节蛋白RyR2和junctophilin-2以及心肌细胞表面和TAT膜蛋白caveolin-3，先前被确认为dysferlin相互作用蛋白，在梗死边缘区与假手术相比表达下降（图2F）。此外，闰盘蛋白β-连环蛋白和连接蛋白43，后者通过形成闰盘细胞间接触位点的间隙连接半通道对细胞间通讯很重要，在梗死边缘区显著下降（图2F）。最后，图2J总结了所有成对比较中上调和下调最多的前10种蛋白。
为了理解与上述蛋白质类型差异相关的潜在病理生理学过程，我们应用了京都基因与基因组百科全书通路富集分析。维恩图显示了梗死后一周野生型与dysferlin基因敲除比较中共享和特异性富集的KEGG通路。每个基因型的前50个富集KEGG通路的热图可以在补充图6-8中找到，与单个KEGG通路对应的蛋白变化总结在补充数据：蛋白质组学中。对于梗死区和边缘区的野生型与dysferlin基因敲除比较，我们分别突出了5个富集的KEGG通路，并在术语-基因图中显示了上调或下调的蛋白。在梗死区比较中，dysferlin缺失诱导了参与凋亡、缺氧诱导因子1信号传导以及B细胞和T细胞介导的炎症反应的蛋白变化，这与Evans等人之前的报告一致，该报告将持续性炎症与dysferlin基因敲除小鼠的膜修复无能联系起来。在梗死边缘区比较中，dysferlin基因敲除特异性差异与肾上腺素能和Ca²⁺信号传导、间隙连接组织和HIF-1信号传导有关（图S5C）。总之，DIA-MS解析了梗死区、边缘区和远隔区的蛋白质组学图谱，并鉴定了梗死后dysferlin基因敲除心肌中的大量蛋白质组学变化，这些变化可能构成了导致梗死后心室功能进一步丧失的病理生理学过程的基础。
横轴小管膜在心肌梗死边缘区心肌细胞中高度降解
膜融合和修复蛋白dysferlin被证明定位在管状膜上以及管状膜旁边的囊泡区室中，这些管状膜是心肌细胞中组织成3D TAT内膜系统的外表面肌膜的连续内陷。因此，我们假设梗死后dysferlin表达增加可能有助于稳定、修复和塑造TAT膜，以保留调控的兴奋-收缩偶联。值得注意的是，我们的区域分辨蛋白质组学分析显示，在梗死边缘区，TAT膜蛋白caveolin-3以及SR和Ca²⁺调节蛋白RyR2和junctophilin-2（后者通常定位于心脏二元体）的蛋白丰度下降（图2F）。对野生型小鼠左心室组织切片中dysferlin和caveolin-3的共聚焦共免疫荧光成像用于：a) 亚细胞定位dysferlin，以及b) 基于先前建立的方案，可视化和骨骼化caveolin-3阳性的TAT膜网络（图3A；参见图S2，dysferlin基因敲除用作免疫荧光特异性对照）。虽然假手术野生型心肌中的左心室心肌细胞显示规则、组织良好的TAT网络，主要由TT组件组成，但梗死后一周，野生型心肌远隔区的心肌细胞中TAT网络出现紊乱，并在边缘区严重降解（图3A，图S9）。有趣的是，我们在远隔区的TAT膜旁边观察到稍大的细胞内dysferlin信号（图3A）。在梗死边缘区的左心室心肌细胞中，膜装饰性dysferlin信号甚至更大且更强（图3A）。
随后，caveolin-3膜骨架用于梗死后左心室心肌细胞中的详细TAT网络分析（图3B-D；每个测量值代表一个独立的小鼠心脏）。与假手术对照相比，梗死边缘区心肌细胞中的TAT网络密度显著下降（-35%），而单个组件的管状分支长度没有变化（图3B）。特别是，横管组件在心肌梗死边缘区心肌细胞中高度降解，而轴向小管组件的相对量略有增加趋势（图3C），这与心肌细胞病理生理学中的AT增殖一致。图3D中的直方图指出了梗死边缘区心肌细胞中TT的减少与AT组件的增加。值得注意的是，电子断层扫描和3D膜重建揭示了在梗死边缘区，残留的AT组件带有许多小膜突起和细胞内囊泡，直接位于管状膜附近（图3E），表明高度动态的局部管状膜重塑过程。总之，TAT膜网络在心肌梗死边缘区心肌细胞中降解，以TT组件的损失为代价，而残留的管状膜组件显示出动态的膜突起，并被大量细胞内囊泡包围。由于最近显示TAT膜旁边的细胞内囊泡含有dysferlin，我们提出dysferlin可能在心肌梗死边缘区心肌细胞中介导残留管状膜的膜重塑和修复事件。
STED纳米镜在心肌梗死边缘区心肌细胞中解析出紧贴残余TAT膜的大型dysferlin簇
为了克服共聚焦显微镜的衍射限制，我们应用STED成像在纳米尺度上解析梗死后一周TAT结构附近的dysferlin信号（图4，图S10A；参见图S2，dysferlin基因敲除用作免疫荧光特异性对照）。正如预期，对组织切片中左心室心肌细胞的dysferlin和caveolin-3共免疫染色的STED成像证实，在梗死远隔区，沿着肌节横纹有规则组织的caveolin-3阳性TT膜信号附近，存在零星的小型dysferlin簇，并伴有互连的AT组件（图4A，左）。形成鲜明对比的是，梗死边缘区心肌细胞中的残留TAT网络组件（主要是AT膜）被突出的dysferlin信号紧密装饰（图4A，右下）。值得注意的是，梗死边缘区左心室心肌细胞中的TAT网络降解与更紊乱和碎片化的SR Ca²⁺释放单元相关，如通过RyR2免疫染色所见（图S10B），这与梗死边缘区RyR2和junctophilin-2蛋白表达下降一致（图1和2）。
然后对dysferlin和caveolin-3的STED通道进行图像分割协议，使我们能够如前所述进行定量簇分析。为此，手动选择细胞内ROI，排除外表面肌膜和闰盘膜折叠处的dysferlin信号，以将重点放在TAT膜变化上。重要的是，与远隔区心肌细胞相比，边缘区心肌细胞表现出两倍的dysferlin簇密度、四倍的dysferlin簇面积分数、以及小而显著的簇平均强度增加，导致整体五倍的dysferlin信号强度加权簇面积分数增加。此外，我们的分析显示，梗死边缘区心肌细胞中dysferlin簇的平均大小加倍。图4G中的直方图说明了较大dysferlin簇的增加，以较小信号的减少为代价。
同样，两种类型的dysferlin簇，即与caveolin-3信号直接重叠和不重叠的，在梗死边缘区都增大，尽管与caveolin-3重叠的dysferlin簇通常更大。在梗死边缘区与远隔区心肌细胞中，dysferlin簇与caveolin-3重叠的百分比下降，可能是由于TAT网络降解。相反，我们发现残留的caveolin-3信号与dysferlin重叠的比例强烈增加。总的来说，在梗死边缘区心肌细胞中观察到从caveolin-3到dysferlin信号的距离显著减小。为了测试我们在小鼠心肌梗死模型中的发现的相关性，我们研究了3名缺血性心肌病患者与1例非衰竭供体心脏活检的左心室活检。重要的是，对缺血性心肌病患者样本中dysferlin和连续膜标记物麦胚凝集素的STED成像显示，在残留的轴向小管膜结构旁边，dysferlin簇积累并增大（图4L，图S10C）。综上所述，在梗死边缘区心肌细胞中，增多的、增大的dysferlin簇定位于残留管状膜结构附近。这支持了dysferlin作为Ca²⁺敏感膜融合和修复蛋白的假设，参与保护梗死后TAT纳米域的完整性和塑造其结构。
基于免疫共沉淀的相互作用组分析识别闰盘蛋白为新的dysferlin相互作用伙伴
先前的研究证明了dysferlin在心肌细胞闰盘细胞间接触位点的大量表达，并提示dysferlin与闰盘组件相互作用。值得注意的是，我们的蛋白质组学分析揭示了野生型与dysferlin基因敲除梗死边缘区中闰盘间隙连接组织的显著变化（图S5C）。因此，我们旨在阐明dysferlin在闰盘膜折叠处的定位和相互作用伙伴，然后研究梗死后dysferlin在闰盘膜处的病理生理学。因此，我们在缺乏和存在1 mM Ca²⁺的情况下，使用基于N端dysferlin抗体的免疫共沉淀实验，对小鼠左心室心脏组织裂解物进行实验，随后对沉淀物进行DIA-MS分析（图5）。为了控制非特异性蛋白结合，包括了dysferlin基因敲除样本和非特异性IgG对照。所有差异沉淀蛋白的主成分分析图和欧几里得聚类热图清晰地将抗dysferlin沉淀物与dysferlin基因敲除和IgG对照分开，而存在和不存在Ca²⁺的抗dysferlin沉淀物在很大程度上重叠。
在图5C、D中，火山图突出了野生型与dysferlin基因敲除比较中1302个相互作用候选物（图5C），以及野生型与IgG比较中743个相互作用候选物（图5D），两者均在缺乏Ca²⁺的情况下。在存在Ca²⁺的情况下，野生型与dysferlin基因敲除比较揭示了1077个沉淀候选物。图5F中的维恩图说明了504个蛋白相互作用伙伴在所有3种条件下均富集，而一些特异性候选物仅在3种比较之一中观察到。
在所有3种比较中发现的dysferlin相互作用候选物中，我们：i) 确认了长期已知的相互作用伙伴，如caveolin-3和三基序蛋白72；ii) 检测到管状-SR连接蛋白如RyR2和junctophilin-2，这些最近被鉴定为dysferlin相互作用蛋白；iii) 鉴定了新的dysferlin相互作用候选物，这些是闰盘纳米域的已知整合组件。这些包括间隙连接蛋白连接蛋白43、粘附连接蛋白N-钙黏蛋白以及粘附连接的其他组件，如α-/β-连环蛋白和纽蛋白，它们介导N-钙黏蛋白与收缩装置的偶联。作为另一个有趣的dysferlin相互作用伙伴，我们检测到跨膜蛋白65，该蛋白最近被描述为对闰盘的结构和功能至关重要。KEGG富集分析基于所有3种比较中发现的504个相互作用候选物识别出63条通路，其中一些在图5G中可视化。相应的术语-基因图显示在图5H中。此外，单个比较的KEGG通路提供在图S11-15中。最后，图5I总结了成对比较中沉淀最多的前10种蛋白。总之，我们基于免疫共沉淀的分析揭示了闰盘膜折叠的粘附连接和间隙连接中先前未知的dysferlin相互作用蛋白，这可能为dysferlin的局部积累提供基础。
Dysferlin定位于连接蛋白43斑块和闰盘膜折叠粘附连接附近
为了详细阐明dysferlin与闰盘组件的空间关系，我们对共免疫标记的野生型左心室心肌细胞进行了STED成像。事实上，STED共免疫荧光显示，许多小的dysferlin簇直接位于粘附连接蛋白N-钙黏蛋白和β-连环蛋白附近，两者都覆盖了闰盘膜折叠的大部分区域。确定为各个肌节处的横管，并伴有轴向小管连接组件。在远隔区，心肌细胞中的TAT网络开始出现紊乱，而在边缘区则严重退化。值得注意的是，在远隔区的TAT膜附近观察到稍大的细胞内dysferlin信号，而在边缘区，膜上的dysferlin信号甚至更大且更强烈。
通过对caveolin-3进行骨架化处理，我们对TAT网络进行了定量分析。与假手术对照相比，边缘区心肌细胞的TAT网络密度显著降低了约35%，而单个分支的长度没有变化。重要的是，横管组件在边缘区高度降解，而轴向小管组件的相对比例则有轻微增加的趋势，这与心肌细胞病理生理学中轴向小管增殖的现象一致。直方图清晰地显示了边缘区心肌细胞中横管比例下降而轴向小管比例上升。电子断层扫描和三维重建进一步揭示了边缘区存在残留的轴向小管组件，其表面有许多小膜突起，并在管状膜附近存在大量细胞内囊泡，这表明局部存在高度动态的管状膜重塑过程。由于最近的研究表明TAT膜附近的囊泡中含有dysferlin，我们推测dysferlin可能在心肌梗死边缘区心肌细胞中参与残留管状膜的膜重塑和修复过程。
STED纳米显微镜显示，在心肌梗死边缘区，增大的dysferlin簇紧密嵌合在残留的TAT网络结构上。通过STED成像，我们在远隔区观察到，在规则排列的caveolin-3阳性的横管膜信号附近，存在零星的小型dysferlin簇。相反，在边缘区，残留的TAT网络组件（主要是轴向小管膜）被大量突出的dysferlin信号紧密包裹。值得注意的是，边缘区心肌细胞的TAT网络降解也与SR Ca²⁺释放单元的紊乱和碎片化相关，这与RyR2和junctophilin-2蛋白表达下降相一致。
通过图像分割技术对dysferlin和caveolin-3的STED通道进行定量分析发现，与远隔区相比，边缘区心肌细胞内的dysferlin簇密度增加了约一倍，簇面积分数增加了四倍，平均簇强度也略有增加，导致强度加权簇面积分数整体增加了五倍，平均簇大小增加了一倍。直方图显示，边缘区较大的dysferlin簇数量增多，而较小的信号减少。无论是与caveolin-3重叠还是不重叠的dysferlin簇，在边缘区都增大了，虽然重叠的簇通常更大。在边缘区，与caveolin-3重叠的dysferlin簇百分比下降，可能是由于TAT网络的退化；相反，残留的caveolin-3信号与dysferlin重叠的比例则显著增加。总体而言，从caveolin-3到dysferlin信号的距离在边缘区显著减小。为了验证这些发现与人类疾病的相关性，我们分析了缺血性心肌病患者和健康供体的左心室活检样本。STED成像显示，在缺血性心肌病患者样本的残留轴向小管膜结构附近，dysferlin簇也出现了积累和增大。这些结果支持了dysferlin作为Ca²⁺敏感膜融合修复蛋白，在保护梗死后TAT纳米域完整性方面发挥作用。
通过免疫共沉淀分析，我们发现了闰盘蛋白是dysferlin新的相互作用伙伴。蛋白质组学分析显示，在野生型和dysferlin基因敲除小鼠的梗死边缘区之间，闰盘间隙连接组织存在显著差异。因此，我们研究了dysferlin在闰盘膜折叠处的定位和相互作用。通过免疫共沉淀结合DIA-MS分析，我们鉴定出许多候选相互作用蛋白。主成分分析和热图清晰地显示，抗dysferlin沉淀物与对照样本分离，而是否存在Ca²⁺对沉淀结果影响不大。
在鉴定出的相互作用候选物中，我们确认了已知的伙伴如caveolin-3和MG53，以及最近发现的RyR2和junctophilin-2。更重要的是，我们发现了新的相互作用候选物，它们是闰盘纳米域的整合组件，包括间隙连接蛋白连接蛋白43、粘附连接蛋白N-钙黏蛋白及其相关蛋白α-/β-连环蛋白和纽蛋白。我们还检测到了跨膜蛋白65，它对于闰盘的结构和功能至关重要。KEGG通路富集分析将这些相互作用蛋白与多种功能通路联系起来。
STED成像进一步证实了dysferlin与闰盘蛋白的共定位。结果显示，大量小型dysferlin簇位于N-钙黏蛋白和β-连环蛋白附近，并围绕大型连接蛋白43斑块分布。定量分析表明，dysferlin簇的大小约为连接蛋白43斑块的三分之一，但密度是其三倍，且dysferlin簇与连接蛋白43斑块的距离非常接近。复杂组学分析发现，dysferlin与N-钙黏蛋白、β-连环蛋白和连接蛋白43在约10 MDa的高分子量复合物中共同迁移，表明它们可能形成功能性蛋白复合物。
在心肌梗死边缘区，dysferlin表达增加并稳定了增大的闰盘细胞间接触位点。由于边缘区心肌细胞面临高生物力学应力，我们分析了dysferlin在边缘区闰盘处的表达和定位。STED成像显示，与假手术和远隔区相比，边缘区心肌细胞的闰盘面积相对于细胞宽度增大，dysferlin信号强度增加126%，且dysferlin簇密度、面积分数和强度加权面积分数均显著增加。同时，在边缘区和远隔区，连接蛋白43斑块到最近dysferlin簇的距离都减小了。虽然边缘区dysferlin簇与连接蛋白43重叠的百分比下降，但更多的连接蛋白43斑块与dysferlin信号直接重叠。与连接蛋白43重叠的dysferlin簇通常更大。电子断层扫描在边缘区闰盘膜折叠附近观察到大量细胞内囊泡，这可能与增加的dysferlin簇密度相对应。在缺血性心肌病患者样本中，STED成像也观察到增大的闰盘膜折叠和更多、更大的dysferlin簇。这些发现表明，dysferlin可能通过稳定闰盘细胞间接触位点的完整性，来防止梗死后功能的进一步丧失。
讨论
本研究通过应用压力循环技术组织裂解和无标记DIA-MS分析小样本心肌组织，定量分析了5700种蛋白质，揭示了小鼠心肌梗死后左心室各区域的蛋白质组学特征。DIA-MS数据集清晰地分离了梗死区、边缘区和远隔区的不同蛋白质型，显著扩展了当前对心肌梗死后空间重塑机制的认识。重要的是，膜融合修复蛋白dysferlin的缺失显著影响了梗死后一周的蛋白质组重塑，在梗死区和边缘区的野生型与基因敲除比较中分别发现了1286和725个差异丰度蛋白。Dysferlin本身在边缘区和远隔区的蛋白丰度增加，这已通过免疫印迹和免疫组织化学得到证实。
在亚细胞层面，共聚焦显微镜显示，心肌梗死边缘区心肌细胞的TAT网络严重退化，以横管组件的损失为代价，这与衰竭心脏中TAT膜的丢失一致。利用STED纳米显微镜的高分辨率，我们解析出在边缘区心肌细胞残留的TAT膜附近存在异常巨大的dysferlin信号，这很可能有助于密封、稳定或塑造TAT结构。值得注意的是，几乎所有TAT组件都被强烈的dysferlin信号直接装饰。我们的结果在缺血性心肌病患者左心室活检样本中得到了证实。电子断层扫描证实了残留TAT组件存在高度动态的膜突起，并被大量膜囊泡包围，表明局部膜重塑事件的发生。
在梗死后边缘区增大的闰盘膜折叠处，dysferlin的局部表达量增加了一倍，这在缺血性心肌病患者的心肌细胞样本中也得到了证实。这可能有助于维持细胞间接触位点的完整性。有趣的是，免疫共沉淀质谱相互作用组分析和复杂组学分析揭示，间隙连接蛋白连接蛋白43和粘附连接蛋白N-钙黏蛋白、β-连环蛋白与dysferlin在功能性高分子量复合物中相互作用。这很可能解释了dysferlin簇在闰盘膜下的积累，并为梗死后闰盘肌膜的重塑和修复提供了局部基础。
最后，dysferlin缺失与显著增大的梗死面积和降低的左心室收缩功能相关。这可能归因于dysferlin基因敲除小鼠心肌梗死边缘区受到严重应激的心肌细胞因肌膜纳米域可塑性和修复能力有限而丧失。
Han等人首次研究了dysferlin在心脏组织中的作用，并观察了野生型与基因敲除小鼠LAD结扎后的效果。与我们的研究不同，他们未观察到基因型间在梗死面积、射血分数或左心室重塑程度上的显著差异，但他们的样本量较小。此外，先前的离体研究提示dysferlin基因敲除心脏从急性缺血/再灌注损伤中恢复的能力受损，这已在体内得到证实。与这些缺血/再灌注研究数据一致，我们在dysferlin基因敲除动物中进行的永久性LAD结扎导致了更大的梗死面积、更明显的左心室扩张和降低的左心室收缩力。虽然缺血/再灌注模型可能更好地反映当今的急性监护医学，但本研究为了在区域特异性蛋白质组学分析前清晰界定梗死边缘区，不得不采用永久性LAD结扎。原则上，dysferlin在缺血/再灌注模型中的作用可能比永久性结扎更显著。我们的研究设计不足以检测dysferlin基因敲除小鼠死亡率的显著差异，因为梗死后死亡率本身很高，且雌雄动物间差异很大。
通过免疫组织化学和dysferlin表达增加可见，心肌梗死边缘区在空间上局限于梗死区外侧的几排心肌细胞。虽然这一狭窄区域使得分离心肌细胞进行活细胞Ca²⁺成像变得困难，但先前的研究表明，dysferlin基因敲除小鼠心室肌细胞的L型Ca²⁺通道电流减小，而自发性SR Ca²⁺释放事件增加。然而，边缘区心肌细胞TAT膜网络的严重退化和RyR2簇的孤立将进一步损害细胞内Ca²⁺信号，这与该区域富集的“Ca²⁺信号”KEGG通路一致。此外，来自骨骼肌细胞的数据表明，dysferlin可能通过缓冲边缘区残留管状-SR连接处的Ca²⁺，来保护细胞免受病理性Ca²⁺火花和波的影响，这超出了其对膜可塑性和修复的影响。未来需要研究dysferlin缺失对边缘区心肌细胞SR Ca²⁺释放、泄漏和缓冲的影响，以确定潜在的治疗意义。
与dysferlin在横向主动脉缩窄诱导的左心室压力超负荷中表达上调一致，梗死远隔区的非缺血心肌也表现出dysferlin蛋白表达的增加。野生型小鼠在梗死后容量超负荷下表现出前壁和后壁厚度增加，作为代偿性左心室肥厚的指标，而dysferlin基因敲除动物则表现出较少的肥厚。推测dysferlin介导的管状膜增殖可能是压力或容量超负荷诱导的心肌细胞肥大的前提，并且可能影响梗死后结局，其作用超出了对梗死边缘区的影响。这些数据共同强调了dysferlin对分化心肌细胞肌膜可塑性的重要性。
本研究存在一些局限性。我们的dysferlin和caveolin-3共免疫荧光STED成像方案只能部分揭示dysferlin在管状或闰盘膜上或膜旁的定位，特别是在缺乏连续膜标记物的情况下。此外，未来需要研究阐明dysferlin阳性囊泡区室的具体性质以及dysferlin介导的TAT和闰盘膜融合修复事件的分子机制。我们期望本研究提供的相互作用组数据能够指导此类研究。为了最大化DIA-MS在梗死边缘区测量的蛋白数量，我们决定在显微镜下使用虹膜剪切除组织。未来，激光显微切割技术有望分析更小、更明确的心肌区域甚至单个细胞的蛋白质组学图谱。
总之，我们的研究结果表明，dysferlin是稳定、修复和塑造心肌梗死边缘区心肌细胞肌膜纳米域（即TAT内膜网络和闰盘膜折叠）的关键角色，可防止有丝分裂后心肌细胞的丢失和梗死后左心室收缩力的进一步降低。未来的研究需要确定在具有高心肌梗死风险或急性心肌梗死的患者中激活或上调dysferlin的策略，以将我们的发现转化为个体化的医疗干预措施。
【全文结束】