自噬调节剂对多潜能间充质基质细胞治疗效果的影响Влияние модуляторов аутофагии на терапевтическую эффективность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток - Иванов - Казанский медицинский журнал

引言

恢复受损组织和器官仍是现代医学的核心任务之一。人口寿命延长、慢性疾病增多以及创伤数量上升，要求开发再生医学领域更有效的方法[1]。在辐射事故或军事冲突等紧急情况下，这类研究尤为关键，因为可能发生急性放射病[2–4]。

急性放射病是机体受到高剂量电离辐射急性照射后出现的严重疾病，其特征是各器官和系统受损，尤其是增殖水平高的组织[5]。造血系统最为脆弱，其损伤会导致造血抑制并发生危及生命的并发症[6–8]。

当然，用于诊断和治疗目的的剂量不会引发急性放射病，但电离辐射可能对周围组织产生远期不良效应，包括因氧化应激导致的致癌风险增加、退行性疾病以及随后的器官纤维化[9]。电离辐射可能破坏造血，导致循环造血细胞剂量依赖性减少，并可能引发白血病[10]。

基于干细胞应用的细胞疗法被视为解决上述问题最有前景的方向之一，因为它能够恢复或替代受损的细胞和组织[11]。

多潜能间充质基质细胞（MMSC）尤其引人关注，它们具有自我维持、分化、为造血干细胞构建“微环境”以及分泌生物活性物质等特性，使其成为再生医学中极具前景的工具[12–13]。

尽管细胞技术领域取得了显著成就，但其临床应用中仍面临一系列根本性限制：迁移和归巢能力下降、免疫学特征差异[14]。一个特别限制因素是移植细胞在氧化应激和炎症条件下的低存活率[15]。

自噬是一种能够提升MMSC应用潜力的机制——它是细胞内分解代谢过程，负责清除受损细胞器和蛋白质分子。自噬在干细胞适应应激条件中的作用正成为现代研究者密切关注的课题[16]。

因此，尽管细胞疗法潜力巨大，但在许多情况下其效果受限。其中一个有前景的工具是MMSC，它们表现出高可塑性和再生活性，并且免疫原性低。然而为达到最大效果，需要进一步研究以提高这些细胞的功能活性。

本综述的目的是系统整理关于MMSC和自噬的现代数据，以及通过调节自噬提高MMSC治疗效果的可能性。

编写本综述时，使用PubMed、Scopus、Web of Science、eLibrary.Ru数据库搜索并分析了俄语和英语科学出版物。

现代关于多潜能间充质基质细胞的认识

MMSC于1968年由苏联科学家A.J.弗里登斯坦首次描述。这是一组多能干细胞，可以从成体以及产前和胎儿发育阶段的已部分或完全分化组织中分离[17]。

根据国际细胞与基因治疗学会（ISCT）的建议，MMSC的主要识别标准见表1[18–24]。

表1. 多潜能间充质基质细胞的主要表型和遗传特征

| ISCT表型 | 必需阳性标志物 (>95%)：CD105 (内皮糖蛋白), CD73 (外核苷酸酶), CD90 (Thy-1)

MMSC的主要特性

多能性：能够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉组织细胞，以及骨髓基质细胞和其他中胚层衍生物。

MMSC表达一系列维持多能性和可塑性的因子：

• OCT4、SOX2、NANOG — 经典的“干性”因子，尽管在MMSC中其浓度可能低于胚胎干细胞。
• SNAI1、TWIST1、BMI1 — 维持增殖并抑制分化。
• KLF4 — 有助于保持MMSC的未分化状态，增强自我维持能力。
• c-MYC — 细胞周期刺激物，加速G1期进程并促进MMSC分裂。c-MYC影响氧化磷酸化和糖酵解之间的转换，这在体外MMSC群体扩增时尤为重要。

与多能性或全能性细胞不同，MMSC的分化潜力有限但仍相当广泛[20–21]。

自我更新：干细胞在体外或体内无限分裂并保持未分化表型的能力[20]。MMSC的自我更新机制多样，由以下通路调节：

• Wnt激活有助于维持干细胞特性和细胞增殖。BMP增强成骨分化，但在早期阶段也可能支持多能性[23]。
• Notch通路参与维持干细胞状态，调节MMSC自我更新与分化之间的平衡[24]。

因此，与胚胎或诱导多能干细胞相比，MMSC的增殖活性有限，但它们具有足够的体外培养潜力，可以获得大量细胞用于临床应用。

免疫调节：MMSC在本质上是体外同种异体T细胞反应的弱刺激物，不会引起同种异体T细胞的激活[25]。因此MMSC不作为抗原呈递细胞，不会启动完整的免疫反应。它们不表达CD80、CD86或CD40，因此无法提供T细胞激活所需的第二信号。这使得即使T淋巴细胞以某种方式与MMSC相互作用，也不会被激活，反而可能进入无能或凋亡状态[26]。

因此，MMSC调节先天和适应性免疫功能，免疫原性低，使其可用于同种异体移植。

迁移和归巢：MMSC参与组织再生的关键过程。基于MMSC的疗法效果很大程度上取决于它们向受损或病变部位迁移的能力。MMSC迁移可在外部因素作用下增强，这些因素增加细胞内钙浓度并激活FAK/Rho GTPase信号通路，促进细胞骨架重组和黏着斑形成[27]。趋化因子（如SDF-1、MCP-1）及其受体（CXCR4）起着关键作用，引导MMSC前往骨髓、炎症区域等。然而只有一小部分MMSC表面表达CXCR4，限制了迁移效率[28]。此外，细胞内调节因子如BAP1蛋白通过抑制ERK信号通路抑制MMSC迁移：其降低通过增加骨桥蛋白表达而增强迁移[29]。

分泌活性：MMSC的分泌活性是其治疗潜力的关键机制之一。MMSC分泌转化生长因子β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、角质形成细胞生长因子（KGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以及干细胞因子（SCF）和FLT3配体，为造血干细胞提供支持和增殖[30]。MMSC的大部分治疗效应不是通过直接分化为特化细胞类型实现的，而是通过旁分泌活性——释放信号分子调节周围细胞和组织的行为[13]。

来源多样性：MMSC可以从多种来源分离：骨髓、皮下脂肪组织、脐带、胎盘和牙髓[31]。这允许选择最易获取且伦理上可接受的细胞来源。在所有MMSC来源中，胎盘来源的MMSC占有特殊地位，因为它们具有一系列独特优势：非侵入性获取、高增殖活性以及高表达血管生成因子[32]。

多潜能间充质基质细胞的实验和临床应用

在体内研究中已显示出其对心血管系统[33]、神经系统[34]、肺部[35]、肝脏[36]、自身免疫性疾病[37]以及移植物抗宿主病[38]等病理状态的有效性。

MMSC在造血系统损伤（尤其是电离辐射照射后）中的应用也引人关注。MMSC能够通过分泌G-CSF、SCF和Flt3配体等细胞因子支持造血干细胞生长及其子代细胞分化[39]。MMSC及其外泌体刺激生长因子生成，支持血管新生，减少细胞凋亡，改善肠道上皮屏障恢复，这对于急性放射病的胃肠型尤其重要[40]。临床和临床前研究还注意到MMSC通过增加集落形成单位数量[41]和血白细胞计数[42]带来的积极效应。

然而MMSC的临床应用受到一系列因素限制：

• 移植后滞留和存活率低——由于凋亡和免疫反应，尤其是在静脉内给药后，MMSC迅速被清除，降低了效果并需要重复给药[43]。
• 制剂的异质性——组织来源、分离方法（酶法或机械法）、培养条件（培养基成分、氧气、传代、表面）、冷冻保存方案以及供体的年龄、性别、健康状况和遗传背景均影响MMSC的功能特性[44]。
• 体外不稳定性——长期培养过程中增殖和分化潜力下降，分泌谱改变，遗传异常积累，给生产的标准化和规模化带来困难[45]。

因此，尽管MMSC具有独特特性，但提高其存活率、植入率和靶向递送需要新策略。在此背景下，细胞内机制（尤其是自噬）的调节受到特别关注，自噬在保护细胞免受应激和维持稳态中起着关键作用[46]。

多潜能间充质基质细胞的自噬机制

自噬（来自希腊语auto- “自身”和phagy “吞噬”）是一个进化上保守的细胞内分解代谢过程。该过程在维持细胞稳态、清除受损线粒体（线粒体自噬）方面起关键作用，并在能量和氧气缺乏时提供资源用于能量代谢[47]。

自噬的作用机制

MMSC中的自噬是一个高度有序的细胞内过程，确保稳态维持和受损细胞器的清除。MMSC自噬的主要阶段包括：吞噬泡的起始、延伸和闭合形成自噬体，随后与溶酶体融合并在自噬溶酶体中降解内容物。自噬调节的核心是ULK1复合体（Unc-51-like kinase 1），它在外界信号（如饥饿、缺氧或氧化应激）抑制mTORC1时被激活。ULK1的激活有助于在电离辐射条件下维持细胞活力和增殖潜力[48]。随后形成PI3K复合体III，包括VPS34、Beclin-1和ATG14L，催化磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）的合成——这是招募吞噬泡膜成分的关键信号。吞噬泡的延伸和闭合依赖于两个泛素样系统：ATG12–ATG5–ATG16L1和LC3（MAP1LC3）/ATG8，后者与磷脂酰乙醇胺连接后转化为LC3-II形式——这是MMSC中自噬体最常用的标志物[49]。

_BECN1、ATG5、ATG7、MAP1LC3B_和_SQSTM1/p62_基因的表达与基础和诱导自噬水平相关，并直接影响细胞功能特性[49–51]。例如，ATG7表达降低会削弱MMSC的迁移和成骨分化，并加速细胞衰老[52]。

自噬在多潜能间充质基质细胞中的生物学意义

在氧化应激、缺氧或DNA损伤等辐射后微环境特征条件下维持稳态和存活[51, 53]。

调节分化潜力：自噬对成骨、成软骨和成脂分化是必需的，因为它确保细胞内结构重塑和能量平衡维持[49]。

控制分泌活性：通过自噬调节携带mRNA和蛋白质（参与造血旁分泌调节和组织修复）的外泌体的包装和分泌[54]。

此外，自噬过程减少受损线粒体和蛋白质聚集体的积累，这对长期培养中保持MMSC功能至关重要[49]。

自噬与造血

造血是造血干细胞分化为成熟血细胞的严格调控过程。自噬在此发挥关键作用。静止干细胞基因表达分析显示自噬标志物水平较高，包括Ulk2、Pink1、Gabarapl1、Map1lc3a和FOXO3。尤其重要转录因子FOXO3A不仅维持造血干细胞静止，还诱导自噬基因（Atg4b、Map1lc3b、Bnip3）的表达，在应激时保护细胞[55]。造血干细胞龛中的缺氧通过HIF1α依赖性诱导Bnip3增强线粒体自噬，减少线粒体质量、耗氧量和活性氧形成[56]。线粒体磷酸酶缺陷还会导致未分化造血干细胞积累和造血抑制[57]。

自噬在红细胞生成中已经完全细化。长期培养中多能性下降，而全身性照射后骨髓中ALDH活性（代表造血干细胞功能）持续低下。因此，通过自噬调节来增强MMSC功能是一个有前景的方向，但需要针对具体损伤类型和微环境进行优化。自噬的双重作用——保护细胞存活或促进细胞死亡——使得其调节必须精准，以最大化治疗收益并避免潜在风险。

自噬在红细胞生成中尤为重要：在幼红细胞成熟过程中，几乎所有细胞器都被清除。自噬在多染性幼红细胞阶段即被激活。_Ulk1、Atg7、Bnip3L_和_Fip200_基因的突变会扰乱红系分化并导致贫血[58]。

自噬调节剂在提高多潜能间充质基质细胞治疗效果中的作用

最深入研究的机制与mTOR依赖性和mTOR非依赖性通路有关，也涉及使用特异性抑制剂。主要调节剂见表2。

表2. 使用自噬调节剂增强多潜能间充质基质细胞的治疗效果

注：MMSC — 多潜能间充质基质细胞。

mTOR依赖性自噬激活通路

mTOR蛋白作为细胞生长和代谢的中心调节器，其激活会抑制自噬。西罗莫司与FKBP12蛋白结合，形成复合物抑制mTORC1，从而激活自噬。这导致自噬关键组分（如ULK1）的磷酸化降低，并启动一系列形成自噬体的事件。研究显示，西罗莫司对MMSC的存活有积极影响，尤其是在氧化应激和缺氧条件下[50]。

在A. Sheppard及其同事的研究中，使用西罗莫司通过降低细胞大小和颗粒度以及减少凋亡水平来减轻MMSC的衰老迹象。西罗莫司增加了MMSC中的自噬活性，这与保持其存活和再生潜力有关。西罗莫司降低了IL-6水平并增加了IL-8水平，同时激活了TGF-β信号通路。这可能增强MMSC吸引促进组织再生细胞的能力[50]。

在A. Awadalla等人的工作中，也证实西罗莫司可以激活MMSC中的自噬。在顺铂肾毒性模型上，MMSC中自噬的这种激活增强了细胞迁移和损伤部位的抗炎活性。此外，它还增强了细胞向受损肾脏的归巢，刺激了血管生成，并降低了促炎细胞因子的产生[53]。

在Z. Li等人的实验中，预先用西罗莫司处理的MMSC通过提高移植干细胞在心肌梗死不良微环境中的存活和分化，促进了心肌修复[51]。

然而，也应该考虑到这种方法的局限性：西罗莫司具有免疫抑制作用，且不影响mTORC2，这可能限制自噬调节的完整性。相关风险包括改变分化潜力和影响细胞周期，尤其是在高剂量或长期暴露下[59]。

此外，西罗莫司在肿瘤细胞中的应用受到限制。在X. Li等人对多发性骨髓瘤细胞的研究中，西罗莫司与其他自噬诱导剂（如苦参碱）联合使用，通过激活ROS/AMPK/mTOR轴和自噬，增强了抗肿瘤效果。这证实西罗莫司也可增强肿瘤细胞中的自噬[60]。

mTOR非依赖性自噬激活通路

除了mTOR依赖性通路，mTOR非依赖性自噬激活机制也越来越受到关注，这在经典信号通路受损或不足的情况下可能尤其重要[61]。

锂作为提高MMSC在再生医学中效率的药物正在被积极研究。其影响涵盖MMSC的增殖、迁移、分化和神经保护，以及改善其外泌体的治疗特性[62]。

锂通过激活GSK-3β依赖的β-连环蛋白/Wnt信号通路刺激MMSC增殖，增加S期细胞数量和细胞周期蛋白D1的表达。这促进了MMSC的更快生长而不诱导凋亡[62]。

在L. Tsai等人的工作中，这种效应是通过抑制GSK-3β实现的。锂促进MMSC的成骨和神经元分化，增加与骨形成（Runx2、ALP、BSP）和神经元标志物相关基因的表达[63]。

用锂预处理MMSC可增强其对神经退行性疾病和中风的治疗效果。这样的MMSC存活率更高，减轻炎症，促进功能恢复并减少神经元损失。锂处理后MMSC释放的外泌体具有更高的神经保护活性，部分是通过改变mRNA谱和抑制炎症通路（TLR4/NF-κB）实现的[59]。这些效应通过多种信号通路实现，使锂成为优化细胞治疗的有前景的药物。然而，该物质在造血恢复方面的应用尚未被研究。

另一个mTOR非依赖性自噬激活剂的例子是海藻糖。海藻糖是一种天然二糖，由两个葡萄糖分子通过α-1,1-糖苷键连接而成。它具有在细胞中诱导巨自噬的独特能力，据报道对一系列自噬功能受损的疾病有效[64]。有趣的是，海藻糖诱导自噬的机制尚未完全阐明。一种提议的机制是其激活TFEB（转录因子EB）的能力，TFEB是自噬和溶酶体生物发生的主要转录调节因子。海藻糖通过内吞作用被细胞吸收并积累在内吞-溶酶体系统中。这会导致轻微的溶酶体应激，伴随溶酶体pH值略有升高，从而强有力地激活TFEB并促使其转位到细胞核。这个过程似乎与mTORC1的失活有关，mTORC1是TFEB的已知负调节因子，对溶酶体pH值变化敏感[64]。

目前未发现使用海藻糖激活MMSC中自噬的实验数据；海藻糖最常用作冷冻保护剂中的组分，用于冷冻和储存细胞。它有助于提高解冻后MMSC的存活率并保持其功能特性[65]。然而，存在将海藻糖应用于其他模型的实验工作[66–67]。

例如，在A. Pupyshev等人的研究中，使用海藻糖降低了促炎细胞因子的表达并提高了抗氧化系统的活性。也未观察到对人类的毒性效应[66]。

在Z. Li等人对顺铂诱导的耳蜗损伤模型研究中，海藻糖通过抑制凋亡、减轻氧化应激和恢复线粒体功能障碍来减少毛细胞损伤。此外，海藻糖显著提高了毛细胞中的自噬水平。海藻糖的效应归因于增强了TFEB的核转位[67]。

然而，在严重病理或强细胞应激下，海藻糖的效应可能不足。海藻糖也可能降低细胞分裂速度，这在再生任务中必须考虑。一些效应是通过改变溶酶体pH值和激活TFEB介导的，但作用机制尚未得到验证[68]。

获得这些实验结果反映了研究海藻糖作为MMSC中自噬诱导剂的高潜力。

自噬的抑制

3-甲基腺嘌呤（3-MA）是一种经典的自噬抑制剂，广泛用于研究该过程在MMSC中的作用。3-MA在MMSC中抑制自噬的机制与其对III类PI3K的作用有关：3-MA抑制III类磷脂酰肌醇-3-激酶，而该激酶是自噬体形成（自噬起始的关键步骤）所必需的[69]。这导致自噬标志物（如LC3-II）水平降低和自噬流减少。在MMSC中，3-MA会降低其迁移和分化能力（例如成骨和神经元分化），同时减少存活并加速细胞衰老[49]。

大多数研究表明，用3-MA抑制自噬会导致MMSC的再生、免疫调节和保护性能降低，削弱其分化、迁移、免疫抑制和存活能力[70]。然而，其对其他模型的损害作用方面仍知之甚少。

例如，在S. Molaei等人的实验中，在缺氧或氧化应激条件下，自噬诱导会导致细胞死亡[52]。另一项研究表明，自噬激活与细胞活力降低（直至细胞死亡）相关，其机制是基于自噬依赖性细胞死亡[71]。

这些研究强调了自噬在各种疾病中复杂且矛盾的作用，以及缺乏统一的调节方法。

结论

本综述系统整理了关于自噬作为决定MMSC功能活性的关键细胞内机制的最新观点。研究表明，自噬调节MMSC的存活、迁移、分化潜力和免疫调节特性，尤其是在辐射损伤特征性的氧化应激条件下。文章探讨了药理学自噬调节剂：mTOR依赖性（西罗莫司）和mTOR非依赖性（锂、海藻糖），并展示了它们在MMSC预条件化策略中的潜力。目前，所有方法都处于临床前研究水平，但获得的数据为开发新一代标准化细胞制剂开辟了可能性，这些制剂不仅能够支持，而且能够主动恢复造血和骨髓基质功能。

附加信息

作者贡献：I.V.A. — 概念构思、数据处理、手稿初稿撰写、手稿审阅与编辑；G.D.Yu. — 概念构思、项目管理、手稿审阅与编辑；M.I.Yu. — 验证、手稿审阅与编辑。所有作者均批准了手稿（待发表版本），并同意对本文所有方面负责，确保与本文任何部分的准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。

资金来源：无。

利益冲突披露：作者声明在过去三年中不存在可能受本文内容影响的第三方（商业和非商业）关系、活动和利益。

原创性：在创建本作品时，作者未使用先前已发表的信息（文本、数据）。

数据获取：本研究获得的所有数据均可在本文中找到。

生成式人工智能：在准备本文时未使用生成式人工智能技术。

同行评审：本手稿是主动提交给期刊编辑部的。评审过程包括两名外部评审员、一名编辑委员会成员和一名期刊科学编辑。

【全文结束】