引言
在内侧基底下丘脑(MBH)中，终丝细胞作为放射状胶质样细胞排列在第三脑室(3V)周围，形成了下丘脑室带(HVZ)，即下丘脑神经发生区域(Xu等人，2005)。作为成体下丘脑神经干细胞(htNSCs)(Kokoeva等人，2005；Lee等人，2012)，终丝细胞调节能量稳态和体重(Li等人，2012；McNay等人，2012；Zhang等人，2017)。α-终丝细胞和β-终丝细胞(后者位于中位隆起(ME))均具有神经发生能力(Haan等人，2013；Robins等人，2013)，分别生成促黑皮质素表达(POMC+)或刺豚鼠相关肽(AGRP+)/神经肽Y(NPY+)神经元，后者抑制或促进进食行为(Kokoeva等人，2005；Robins等人，2013)。
下丘脑成体神经发生(htAN)已被证明受到运动和饮食的影响。虽然短期高脂饮食(HFD，持续1-2周)增加了MBH细胞增殖，可能是一种适应性反应(Gouaze等人，2013；Jorgensen等人，2024)，但长期HFD(超过1个月)通过增加细胞凋亡减少了成体生成的下丘脑神经元的存活率(Jorgensen等人，2024；Li等人，2012；McNay等人，2012)。这表明长期HFD对成体生成的下丘脑神经元的分化和存活是有害的。
运动已知可以上调海马齿状回亚颗粒带(SGZ)的成体神经发生，主要通过在两周内增加细胞增殖实现(Kronenberg等人，2003)。虽然HVZ也对运动产生反应，但其对短期或长期HFD条件下htNSC增殖或新神经元存活的影响仍不清楚。以往关于运动和htAN的研究有限。一项为期7天的强制跑步方案增加了新MBH细胞的存活率，但其中只有0.5%是神经元(Borg等人，2014)。相反，长期(8-12周)自愿运动挽救了HFD引起的MBH增殖减少(Klein等人，2019；Laing等人，2016)，并可能增加了新神经元的比例(Laing等人，2016；Niwa等人，2016)。
然而，这些研究缺乏关键要素：增殖细胞或新神经元的表型分析、谱系追踪、体视学量化或区域特异性分析，这损害了其可靠性和特异性。因此，运动和HFD对离散htAN细胞阶段的影响及其潜在机制需要进一步严格研究。
运动因子，即运动反应中释放的信号分子，是主要的机制候选者(De Miguel等人，2021)。作为运动因子，硒最近被发现对运动诱导的海马神经发生至关重要(Leiter等人，2022)。抗氧化硒转运蛋白SEPP1及其受体LRP8介导运动驱动的海马NSC增殖和激活(Leiter等人，2022)。在下丘脑中，硒蛋白在AGRP+和POMC+神经元中高表达，调节它们的氧化还原状态和活性氧信号(Henry等人，2015)，表明其对能量稳态的重要性。事实上，不健康饮食会减少下丘脑硒蛋白表达(Schriever等人，2017)，而其功能缺失会导致肥胖(Zheng等人，2020)。综上，这些发现表明硒对能量稳态至关重要。尽管如此，硒在htAN中的作用，特别是与运动和饮食相关的作用，尚不清楚。
在此，我们研究了自愿运动与对照饮食或HFD相结合，对不同下丘脑区域中htNSCs及其后代的影响，使用了标记保留和谱系追踪策略。我们的研究结果表明，htAN对长期而非短期运动有反应。运动可以挽救HFD引起的htAN，但无法改善长期HFD导致的成体出生神经元存活率降低。此外，我们的结果表明硒模拟了运动的一些神经发生效应。总体而言，我们的研究表明，运动和饮食对下丘脑神经发生区域的影响与海马区域不同。
结果
跑步增加对照饮食和HFD组的海马成体神经发生
为评估自愿运动和饮食对成体神经发生的影响，我们设计了定制的并列饲养笼(Figure 1A和1B)，可进行个体活动监测(Figure 1C和1D)。小鼠接受自由获取的对照饮食或HFD(Jorgensen等人，2024)，这对跑步距离没有显著影响(Figure 1E)。然而，跑步显著降低了两组饮食小鼠的体重(Figure 1F，双向ANOVA)。为确认自愿运动上调海马成体神经发生(如先前所示，Kronenberg等人，2003)，我们量化了SGZ中标记细胞增殖(Ki67)、未成熟神经元(双皮质素，DCX)和神经干细胞(胶质纤维酸性蛋白，GFAP)的细胞(Figures S1A-S1D)(Jorgensen等人，2024；Kempermann等人，2004)。我们的结果显示，两周的跑步增加了对照组和HFD组的SGZ细胞增殖(Figures S1E和S1F)，但仅增加了对照组中神经母细胞或NSCs的增殖(Figures S1G-S1J)。这些发现表明短期跑步增强了海马成体神经发生，并验证了我们的实验方法。
短期跑步挽救HFD引起的中位隆起区域神经发生
接下来，我们确定了短期(2周)运动和饮食如何影响MBH中的成体神经发生。我们使用BrdU"标记保留"策略追踪成体生成的细胞(Xu等人，2005)。对染色脑切片的共聚焦量化(Figures 2A-2I)显示，在ME中，HFD增加了BrdU+DCX+神经元的密度，但未增加BrdU+GFAP+星形胶质细胞的密度(Figures 2J-2L)。重要的是，运动逆转了HFD引起的BrdU+神经元增加。在弓状核(ARH)中，HFD降低了BrdU+细胞的密度，而运动无法挽救这一现象(Figure 2M)，而运动减少了BrdU+神经元的数量(Figure 2N)，但对BrdU+星形胶质细胞没有影响(Figure 2O)。这表明这些干预措施对不同MBH区域有差异性影响。为更深入了解这些干预措施如何影响htAN，我们研究了跑步距离与细胞密度变化之间的相关性(Figures S2A-S2F)。线性回归显示，对照组或HFD跑步者中ME、ARH或MBH的BrdU+细胞或神经元密度之间没有统计学显著相关性。为确定干预是否改变了新成体生成神经元的表型，我们量化了表达厌食标记POMC的BrdU+细胞的密度(Figures 2P-2R)或食欲刺激标记NPY(Figures 2S-2U)。运动或HFD均未显著改变BrdU+POMC+神经元的密度，而运动显著增加了BrdU+NPY+细胞的密度。我们还分析了BrdU+DCX+细胞的神经突(Figures S3A-S3H)。在ME和ARH中，HFD缩短了主要分支；这一效应在ME中被运动挽救，但在ARH中则未被挽救。最后，我们分析了MBH实质中活化caspase 3阳性(AC3+)细胞的密度(Figures S3I-S3K)，发现治疗组之间没有统计学显著差异。
HFD对下丘脑实质和HVZ中的增殖产生不同影响
ME中未成熟神经元密度的上述变化可能源于下丘脑细胞增殖的改变。为此，我们量化了短期方案动物MBH中的增殖细胞(Figures 3A-3E)。在ME中，HFD显著增加了Ki67+细胞的密度(Figures 3F和3G)，表明细胞增殖增加。相反，ARH在任何组中均未显示细胞增殖的统计学显著变化(Figures 3H和3I)。ME中新神经元和细胞增殖的变化也可能反映了htNSCs细胞动力学的改变。为此，我们量化了HVZ中htNSCs的数量和密度，通过终丝细胞标记视网膜和前神经折叠同源框转录因子(RAX)进行鉴定(Figures 3J和3K)(Miranda-Angulo等人，2014；Yoo和Blackshaw，2018)。对照饮食下的跑步和HFD静息小鼠均增加了RAX+细胞的数量和密度(Figures 3L和3M)，而HFD显著降低了HVZ中的细胞增殖(Figure 3N)。总体而言，这些发现表明干预可能扩大了htNSC池。
长期跑步增加下丘脑神经发生，但无法抵御长期HFD
为进一步阐明运动和饮食对htAN的影响，我们使用了一个为期三个月的长期方案，结合BrdU"标记保留"策略和GRT转基因报告小鼠中htNSCs的谱系追踪(Petrik等人，2018)。在GRT小鼠中给予他莫昔芬诱导了GLAST+ htNSCs及其后代中依赖重组的tdTomato(tdTom)表达，使我们能够区分"累积神经发生"(3个月内tdTom+细胞)和"急性神经发生"(方案最后2周生成的BrdU+细胞)。对tdTom+细胞阳性表达成熟神经元标记NeuN+的量化(Figures 4A-4I)显示，HFD在静息和跑步小鼠中均显著降低了整个MBH、ARH和MBH实质中tdTom+NeuN+细胞的密度(Figures 4J-4L)。相反，长期跑步增加了NeuN+BrdU+神经元的密度(Figure 4M)和MBH中BrdU+细胞的密度(Figure S4A)。然而，这种跑步的神经发生效应在暴露于HFD的小鼠中缺失(Figures 4N和4O以及Figures S4B-S4F)。这些结果表明，长期跑步在生理条件下增加急性神经发生，但其神经发生效应被HFD阻断。
长期跑步和HFD降低未成熟下丘脑神经元的密度
我们随后的实验研究了干预对MBH中成体生成的未成熟神经元存活和细胞增殖的影响(Figure 5A)。细胞量化显示，对照和HFD条件下的长期跑步均显著降低了成体生成的DCX+细胞的密度。双向ANOVA表明，这两种干预几乎完全消除了ARH和MBH实质中源自GLAST+ htNSCs的tdTom+DCX+BrdU+细胞(Figures 5B-5H)，但在MBH或ME中则不然(Figures S5A、S5B和S5E)。相反，长期跑步增加了tdTom+BrdU+细胞的密度，但仅限于MBH实质中(Figure 5I)，而不在其他区域(Figures S5C、S5F和S5H)。值得注意的是，无论是跑步还是HFD都未改变在三个月方案最后两周内通过急性神经发生生成的未成熟神经元的密度(Figures S5D、S5G、S5I和S5J)。为确定这些变化是否与细胞增殖有关，我们量化了MBH中的Ki67+细胞。量化显示，长期HFD增加了ARH中Ki67+细胞的密度(Figures 5J和5K)；然而，HFD或跑步均未改变MBH中Ki67+DCX+或Ki67+tdTom+细胞的密度(Figures 5L和5M)。这些结果表明，干预对神经源性增殖没有显著影响。
跑步增加硒蛋白受体LRP8的表达，而硒增加htNSCs的激活
接下来，我们研究了硒是否可以模拟运动对htAN的影响。我们首先检查了下丘脑中LRP8的表达，LRP8是硒蛋白P(SEPP1)的表面受体，对成体海马中硒的外分泌效应至关重要(Leiter等人，2022)。我们的分析显示HVZ中的几乎所有RAX+细胞都表达LRP8(Figures 6A-6C)，两周的硒-L-甲硫氨酸暴露降低了HVZ中LRP8和RAX信号的归一化像素密度(Figures 6D和6E)。重要的是，两周的HFD降低了Sepp1表达(Figure 6F)，而运动增加了MBH中Lrp8的表达(Figure 6G)。这些发现表明htNSCs表达LRP8，跑步上调了其下丘脑表达。为确定硒是否在饮食或运动背景下改变htNSCs及其增殖，我们量化了HVZ中的RAX+和Ki67+细胞(Figure S6A)。两周的HFD和跑步增加了RAX+细胞数量，但硒没有增加(Figures S6B和S6C)。然而，这些干预均未显著改变HVZ中的Ki67+细胞数量(Figures S6D和S6E)。因为HVZ表现出低增殖率，为适当地评估干细胞动态，我们进一步在体外探索了硒的影响。naive htNSCs原代培养物暴露于硒-L-甲硫氨酸，并进行4天时间推移成像(Figures 6H和6I)。单个细胞克隆分析显示，硒处理的细胞中活跃分裂克隆的数量和比例更大(Figures 6J和6K)，但每个克隆生成的细胞数量没有变化(Figure 6L)。在htNSC衍生的神经球中，硒增加了它们的大小，但不影响Rax或Lrp8表达(Figures 6M-6Q)。总体而言，这些结果表明硒增加了htNSCs的细胞增殖和激活，但不影响其效力。
硒挽救HFD引起的中位隆起区域神经发生，模拟短期跑步
为进一步探索硒对htAN的影响，我们给小鼠补充硒-L-甲硫氨酸两周，同时给予对照饮食或HFD，并量化新细胞和神经元密度(Figures 7A和7B)。硒未改变ME或MBH中BrdU+细胞的密度(Figures 7C和S7A)。然而，在ME中，它显著降低了HFD小鼠中BrdU+DCX+细胞的密度，使其达到与HFD跑步者相似的水平(Figure 7D)。三向ANOVA显示饮食和硒显著影响BrdU+DCX+细胞的密度。重要的是，硒在对照小鼠中也降低了ME和MBH中BrdU+DCX+细胞的密度(Figures 7E、7F和S7B-S7D)。这些结果表明，在HFD条件下，硒通过挽救ME中HFD引起的成体生成神经元增加来模拟跑步的效果。相反，硒在对照饮食下降低了新未成熟神经元的存活率。干预的主要效应总结在Figures 7G和7H中。
讨论
本研究调查了运动和饮食对不同下丘脑区域和两个不同时间点的htAN的影响。我们定制的笼子促进了并列饲养动物之间的社交互动，同时提供个体监测的跑步轮访问。这种设计减轻了社交隔离压力，已知社交隔离压力会对成体神经发生产生负面影响(Stranahan等人，2006)。如前所示(Gouaze等人，2013；Niwa等人，2016)，短期HFD未改变体重，但短期运动增加了SGZ中对照组和HFD组的增殖细胞数量。这证实了短期运动作为成体海马中强大神经发生因子的既定范式(Kronenberg等人，2003)，从而验证了我们的实验模型。
与SGZ相反，短期跑步在对照条件下未显著改变下丘脑中的细胞增殖或神经发生。这一发现与Borg等人的一项先前研究不同，该研究报道称7天跑步增加了下丘脑增殖，但估计新细胞中少于0.5%是神经元(Borg等人，2014)。差异可能源于实验设计的变化，如Borg等人使用6天BrdU追踪和强制跑步，后者可能引起压力(Leasure和Jones，2008)并影响细胞动态。跑步对海马和下丘脑神经发生区域的不同反应性表明需要更长时间来刺激下丘脑。事实上，我们的实验中长期跑步增加了对照饮食下的"急性神经发生"，可能受到htNSCs缓慢增殖的影响(McNay等人，2012)，其细胞周期比海马NSCs显著更长(Jorgensen等人，2024)。
与跑步不同，跑步未影响神经发生，短期HFD增加了ME中的神经发生，这一效应被跑步逆转。这表明两种可能性：要么这种增加是对HFD的补偿性反应，由于运动作为保护性干预而变得不必要，要么HFD引起异常神经发生，跑步可以挽救。相反，HFD降低了ARH中新神经元的密度，跑步无法缓解这一现象。这些发现突显了下丘脑对干预的区域特异性反应，证实了先前观察到的HFD增加ME和减少ARH神经发生(Lee等人，2014)。值得注意的是，我们的研究首次证明跑步逆转了HFD引起的ME中神经发生变化，可能是因为其位于血脑屏障(BBB)之外的特殊位置(Lee等人，2012，2014)。事实上，ME比BBB保护的ARH更暴露于循环因子。在ME中，短期HFD会破坏终丝细胞和血液-CSF界面(Ramalho等人，2018；Severi等人，2021)，而ARH显示炎症但早期无BBB渗漏(Rijnsburger等人，2019)。相比之下，运动减少了HFD引起的ARH中炎症和小胶质细胞激活(Sasaki等人，2024)，但其对ME的直接影响尚不清楚。BBB保护和反应性的这些差异可能是我们观察到的区域特异性成体神经发生效应的基础。
有趣的是，HFD降低了HVZ中的增殖，但增加了MBH实质中的总体增殖，进一步强调了HFD对增殖的细胞特异性效应。值得注意的是，这些干预均未改变MBH中AC3+细胞的数量，表明观察到的神经发生变化不受凋亡改变的影响。综上，这些结果表明短期跑步影响ME中的神经元分化或存活，而非细胞增殖。
我们观察到短期运动增加了BrdU+NPY+但未增加BrdU+POMC+细胞的密度，这表明跑步促进MBH中的新食欲刺激神经元，而非厌食神经元，这与先前发现运动刺激NPY+神经元的发现一致(Landry等人，2022)。相比之下，HFD缩短了ME和ARH中BrdU+DCX+细胞的主要过程，首次表明它可能损害新下丘脑神经元的树突发育。
与短期方案相反，长期跑步在对照饮食条件下未增加MBH或ARH中3个月的累积神经发生，证实了下丘脑神经发生对长期运动的习惯化(Klein等人，2019)。然而，长期跑步增加了最后两周的"急性"下丘脑神经发生。这种差异反应可能源于多种因素。首先，长期跑步可能耗尽了神经源性htNSC和祖细胞池。事实上，我们观察到tdTomato+DCX+BrdU+细胞密度降低，但对Ki67+DCX+细胞没有影响，但我们不能排除跑步可能在中间时间暂时增加GLAST+ htNSC神经发生。其次，我们的数据不能完全解决htNSC异质性的影响。累积神经发生源自GLAST+ htNSCs，而急性神经发生则来自任何未被终端分化耗尽的神经源性htNSCs或祖细胞，包括β-终丝细胞(Robins等人，2013)。事实上，我们在HVZ的腹侧方面(在漏斗隐窝中)也发现了tdTomato+终丝细胞，表明这些是β1-终丝细胞。但由于这些很少在最腹侧ME中被发现，可能表明在急性神经发生期间产生的部分BrdU+ tdTomato阴性神经元可能源自BBB外的GLAST阴性Nestin阳性β2-终丝细胞(Haan等人，2013；Lee等人，2012；Robins等人，2013)。
我们的结果证明长期HFD对下丘脑神经发生有害，显著降低了通过累积和急性神经发生生成的新成熟下丘脑神经元的密度，跑步无法挽救这一效应。此外，长期HFD降低了tdTomato+DCX+BrdU+但未降低DCX+BrdU+细胞的密度，表明GLAST+但非GLAST阴性htNSCs的神经元存活和分化减少，证实了先前关于长期HFD对htAN的负面影响的研究(Jorgensen等人，2024；Li等人，2012；McNay等人，2012)。然而，因为我们没有立体学量化MBH中所有NeuN+神经元的绝对数量，我们的结果并未显示BrdU+NeuN+细胞相对于总NeuN+细胞的比例减少，长期HFD也可能减少总NeuN+细胞。
之前有研究调查了长期运动对下丘脑的影响，但其实验范式使它们无法与我们的结果进行比较。例如，Laing等人(2016)发现跑步可以挽救HFD引起的POMC+神经元减少，但未区分成体和胚胎生成的细胞。类似地，Niwa等人(2016)显示，在对照饮食条件下，跑步5-8周后，大鼠ARH和ME中新的下丘脑神经元比例更高。相反，Klein等人使用3个月运动和HFD，使其范式直接可与我们的进行比较(Klein等人，2019)。然而，与我们的发现相反，他们的研究报告称HFD对新下丘脑神经元数量或亚型的影响与对照组或跑步相比没有影响，但观察到HFD跑步者下丘脑细胞增殖更高。与我们的研究一样，Klein等人也注意到跑步导致成体生成细胞减少。然而，Klein等人范式与我们的关键区别在于：他们使用群居雌性小鼠、无锁定跑步轮的静息对照，以及用于追踪3个月旧细胞的BrdU标记保留策略。因此，Klein等人只能监测存活率，而非分化，得出结论认为干预不改变早期生成细胞的长期存活。
接下来，我们调查了运动如何挽救HFD引起的ME神经发生增加的机制。我们的研究首次关注硒作为成体下丘脑中神经发生的运动因子。我们发现HVZ细胞中RAX和LRP8共定位，首次表明终丝细胞(作为htNSCs)表达Lrp8。尽管Sepp1或Lrp8均未被列入终丝细胞中表达最丰富的300个基因(Chen等人，2017)，但各种血脑界面表达LRP8(Vargas-Caraveo等人，2017)，且终丝细胞确实表达碘甲状腺氨酸脱碘酶2(DIO2)，一种对甲状腺激素合成至关重要的硒蛋白，这表明终丝细胞表达其他硒蛋白或其受体(Gong等人，2018)。重要的是，我们的结果显示HFD降低而运动增加MBH中Lrp8的表达，这可能影响硒补充对htAN的作用。
为确定硒对htAN的作用，我们将小鼠或原代htNSCs在体外暴露于升高的硒-L-甲硫氨酸。我们假设硒补充会挽救HFD引起的ME神经发生，模拟运动。事实上，与HFD联合使用的硒降低了ME中BrdU+DCX+细胞的密度，达到跑步加HFD小鼠中观察到的水平。值得注意的是，硒对ME和新成体生成神经元的这种运动模拟效应是特异性的，不影响所有细胞。尽管运动和硒都降低了ME中BrdU+DCX+细胞的数量，但如果HFD增加这些细胞是一种补偿性反应，则这种效应可能不是有益的。在对照饮食下，硒也显著降低了BrdU+DCX+细胞的密度。这表明虽然硒在不健康饮食下可能有益，但在生理条件下可能对htAN有害，这与硒的有益作用仅限于狭窄浓度范围一致(Genchi等人，2023)。
接下来，我们研究了硒补充是否改变下丘脑中的NSC增殖和激活，如海马中所观察到的(Leiter等人，2022)。我们的结果表明硒在体外增加了htNSCs和祖细胞的激活和增殖，但在体内未观察到，可能是由于HVZ中低增殖动态。这些结果表明，硒对HFD引起的ME神经发生的挽救可能由分化驱动，因为硒增加了而非减少了htNSC激活和增殖。
未来实验应关注硒的长期效应以及硒蛋白对下丘脑神经发生和htNSCs的分子机制。鉴于SEPP1对海马成体NSC激活至关重要，需要代谢变化(Knobloch等人，2013；Leiter等人，2022)，硒可能同时影响htNSCs的氧化还原和代谢状态。未来工作还应建立运动和硒蛋白调节htAN之间的因果关系，进一步确立硒作为主要下丘脑运动因子的地位。
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