摘要
造血干细胞(HSCs)能够耐受多种细胞应激，但常常因此丧失再生能力和淋巴细胞生成能力。这种功能下降也随年龄增长而发生，功能失调的线粒体受损HSCs在衰老过程中逐渐积累。然而，HSC应激反应与年龄相关的功能下降之间的分子联系仍不清楚。本文发现，多种应激反应汇聚到RIPK3-MLKL轴，诱导HSCs发生与年龄相关的变化。坏死性凋亡效应蛋白MLKL容易被炎症和复制应激激活，并在HSC线粒体中积累。因此，激活的MLKL不会导致细胞死亡，但会损害HSC的自我更新能力和淋巴细胞分化能力。在机体衰老过程中，MLKL介导的功能下降也发生在HSCs中，激活的MLKL主要介导与年龄相关的线粒体损伤和糖酵解流量减少。综上所述，我们的研究结果确立了RIPK3-MLKL轴作为HSC衰老的关键介导者，并揭示了MLKL在不依赖坏死性凋亡的情况下对线粒体造成损伤的新作用。
引言
衰老会损害造血功能并增加患血液系统疾病的风险。尽管血液和免疫细胞的终身生产依赖于造血干细胞(HSCs)的自我更新能力和多能性，但有力的证据表明，再生能力和淋巴细胞生成能力降低的HSCs会随年龄增长而积累。这种与年龄相关的HSC功能障碍与细胞器的有害变化相关，包括DNA损伤积累、表观遗传调控改变、自噬流量减少和线粒体功能受损，以及骨髓(BM)中HSC支持性微环境细胞的环境变化，如炎症和微环境变化。我们和其他研究团队最近发现，恢复年轻微环境不足以使衰老HSC功能恢复活力，这凸显了HSC衰老中细胞内在缺陷的关键作用。事实上，最近的研究表明，线粒体功能和代谢的改变会导致衰老HSCs的功能障碍。此外，反复暴露于炎症和复制应激会导致HSC功能出现不可逆的、与年龄相关的缺陷。然而，细胞内在和细胞外在变化之间的因果关系仍不明确。
HSCs的分子机制使其在不需要时防止凋亡，并且其抗凋亡能力通过年龄依赖性环境变化进一步增强。我们和其他研究团队先前发现，坏死性凋亡（一种由受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)–混合谱系激酶样(MLKL)轴介导的程序性坏死形式，通常发生在抗凋亡细胞中）可以发生在HSCs中，并在暴露于促炎配体和骨髓消融应激后限制其再生潜力。事实上，HSCs通过后转录修饰上调坏死性凋亡效应蛋白MLKL以应对炎症，最近的研究表明RIPK3–MLKL轴在介导HSC在特定应激后和衰老过程中的功能障碍方面起着关键作用。尽管这些研究将RIPK3–MLKL介导的细胞死亡归因于衰老HSCs的功能下降，但功能失调的HSCs应该在衰老过程中在骨髓中存活并积累，这使得RIPK3–MLKL轴如何介导与年龄相关的HSC变化的机制仍不清楚。有趣的是，新兴证据表明MLKL激活并不总是诱导坏死性细胞死亡，而是可能损害内体、自噬体和线粒体等膜结合细胞器，可能是通过破坏膜完整性造成的。
本文中，我们试图阐明坏死性凋亡途径在与年龄相关的HSC功能下降中的作用。我们发现RIPK3–MLKL轴在HSCs子集暴露于与年龄相关的应激后被轻易激活，并减少HSC的自我更新和淋巴细胞生成潜力，而不影响HSC的存活。
结果
MLKL在炎症暴露下的HSCs中优先激活
先前研究表明，MLKL蛋白在小鼠未成熟造血细胞中大量表达，并且在polyinosinic-polycytidylic acid (pIC)诱导的炎症中，其在HSCs中的表达水平升高。为了进一步评估炎症暴露下个体HSCs和其他造血祖细胞中坏死性凋亡途径的激活状态，我们使用了SMART-Tg小鼠，这些小鼠普遍表达一种基于Förster共振能量转移(FRET)的生物传感器，用于监测MLKL的激活和向细胞膜的转位。与我们先前观察到的坏死性凋亡在pIC诱导的炎症期间在HSCs中被选择性激活而在粒细胞/单核细胞祖细胞中未激活的结果一致，SMART信号在炎症暴露后在HSCs和多能祖细胞(MPPs)中增加，但在髓系或淋巴系祖细胞中没有增加。这一结果出乎意料，因为我们先前的数据表明pIC注射诱导了TNF-α和核因子κB (NF-κB)依赖的促生存信号，保护HSCs免于坏死性凋亡死亡。FRET信号在给药后第1天增加，与生物性别无关，但在给药后第7天消失。此外，急性FRET激活在RIPK3缺陷(Ripk3–/–)背景下显著减弱，表明坏死性RIPK3–MLKL轴在HSCs中对炎症的响应是短暂激活的。我们将LPS处理后具有高和低FRET信号的HSCs (FRET/CFP hi和FRET/CFP lo)进行了移植，观察到与FRET/CFP lo HSCs相比，FRET/CFP hi HSCs的植入潜力和B淋巴细胞生成潜力有下降趋势。综上所述，这些结果表明坏死性凋亡途径在炎症暴露下选择性且短暂地在HSCs中激活，并且其激活状态与HSCs功能下降密切相关。
MLKL的非坏死性凋亡作用损害HSC功能
MLKL最广为人知的功能是通过质膜破裂诱导坏死性细胞死亡。为了研究炎症诱导的MLKL激活对HSCs的影响，我们评估了pIC处理的MLKL缺陷(Mlkl–/–)小鼠中HSC数量的变化。出乎意料的是，磷脂酰丝氨酸暴露（在坏死性凋亡和凋亡中细胞破裂前观察到的质膜完整性丧失的标志）在野生型(WT)和Mlkl–/– HSCs之间没有变化，表明炎症激活的MLKL对HSC存活的影响可以忽略不计。因此，pIC处理的WT和Mlkl–/–小鼠中HSC的绝对数量相当。如预期的那样，pIC诱导的炎症也导致HSCs退出静止状态，并从内皮蛋白C受体表达(EPCR+)的自我更新状态转变为CD41+的髓系倾向状态，但MLKL缺陷对这些变化没有明显影响。然而，另一个与年龄相关的髓系偏向HSC标记物neogenin-1 (NEO-1)的上调在MLKL缺陷下显著减弱。为了进一步评估RIPK3–MLKL轴的激活是否影响与年龄相关的HSC亚群，我们利用了MLKL-SA2敲入(MlklSA2)小鼠，其中由于Mlkl位点密码子345和347的两个丝氨酸到丙氨酸替换，MLKL不能被RIPK3依赖性磷酸化激活，并用PBS或pIC处理它们。除了NEO-1外，我们还评估了P-选择素和GPR183的表面表达，据报道这些分子分别富集髓系偏向和低分化亚群在衰老HSCs中。结果表明，RIPK3–MLKL轴的失活显著减弱了pIC诱导的NEO-1上调，对GPR183也有一定程度的减弱，但对P-选择素没有影响。由于HSC的总数在单次pIC注射前后没有差异，这表明RIPK3-MLKL轴促进了从NEO-1–谱系平衡到NEO-1+髓系偏向状态的转变。
与上述MLKL介导的表型变化一致，HSC移植实验表明，尽管MLKL缺陷本身赋予了PBS处理的对照HSCs选择性优势，但MLKL缺陷显著缓解了pIC诱导的植入和B淋巴细胞生成潜力的下降。此外，在pIC注射前通过UH15-38给药在体内阻断RIPK3激酶活性显示出缓解pIC诱导的HSC再生能力和B淋巴细胞分化潜力下降的趋势，表明RIPK3在MLKL上游介导HSC功能下降。从pIC处理的WT和MlklSA2小鼠中分离的NEO-1–和NEO-1+ HSCs的移植进一步表明，与WT对应物相比，MlklSA2 NEO-1– HSCs的植入有所改善，但NEO-1+ HSCs没有，这表明RIPK3–MLKL轴的阻断选择性保护了NEO-1–谱系平衡HSCs。这种MLKL介导的效果似乎是很大程度上细胞内在的且独立于环境坏死性凋亡的，因为MLKL缺陷对pIC诱导的骨髓炎症影响很小，并且pIC诱导的体外EPCR+ HSC扩增的抑制主要归因于造血细胞中的MLKL活性。
为了进一步研究MLKL在HSC功能中的非细胞死亡作用，我们使用了用N端FLAG标记的MLKL (FLAG-MLKL)重建的Mlkl–/– HSCs进行了HSC移植实验，该蛋白不能诱导细胞死亡但可以寡聚化并转位到细胞膜。与MLKL在HSCs中细胞内在、非坏死性凋亡调控一致，用FLAG-MLKL重建Mlkl–/– HSCs显著降低了它们的植入潜力。这些数据综合表明，炎症诱导的MLKL激活不会导致HSC死亡，但会独立于MLKL坏死性凋亡功能损害HSC再生和淋巴细胞生成潜力。
MLKL介导由复制和致癌应激驱动的与年龄相关的HSC变化
复制应激被认为是HSC衰老的驱动因素。有趣的是，MLKL在5-氟尿嘧啶(5-FU)给药后也优先在HSCs和MPPs中激活，而在髓系或淋巴系祖细胞中没有激活，5-FU会诱导HSC增殖和与年龄相关的改变。同样，阻断RIPK3–MLKL轴在5-FU诱导的骨髓消融期间不会改变HSC死亡或其绝对数量。因此，为了评估MLKL激活在复制诱导的HSC衰老中的相关性，我们给WT和Mlkl–/–小鼠注射了多轮5-FU。尽管5-FU注射后造血恢复在WT和Mlkl–/–小鼠之间相当，但我们观察到5-FU处理的Mlkl–/–小鼠中与年龄相关的造血变化显著减弱，如髓系偏向造血和表型HSCs的扩增。此外，HSC移植实验表明，MLKL缺陷缓解了5-FU诱导的HSC植入和淋巴细胞生成潜力的下降。在也诱导体内HSC大量增殖的连续HSC移植过程中，HSCs中的MLKL缺陷减弱了其再生潜力和淋巴细胞产生能力的逐渐下降。作为骨髓增生异常综合征(MDS)易感性增加是造血系统衰老的另一个标志，我们接下来通过引入RUNX1的C端截断突变体（模仿小鼠MDS，导致髓系偏向分化和无效造血）使WT和Mlkl–/– HSCs暴露于致癌应激。移植突变RUNX1转导的WT或Mlkl–/– HSCs显示，造血细胞中MLKL缺陷不影响HSC植入但缓解了致死性MDS的发展。对受体小鼠的进一步分析显示，MLKL缺陷对突变RUNX1诱导的造血细胞发育不良没有可检测的影响，但主要由于严重的红细胞生成缺陷而改善了致死率。这些数据支持这样一种观点，即由复制和致癌应激驱动的与年龄相关的HSC变化至少部分是通过MLKL的细胞内在活性介导的。
MLKL介导机体衰老过程中的HSC功能障碍
上述发现促使我们研究MLKL是否介导了机体衰老过程中HSC的功能下降。我们分析了3个月和12个月大的WT和Ripk3–/–小鼠中的SMART信号，发现FRET/CFP hi HSCs的频率随年龄增长以RIPK3依赖性方式增加，尤其是在雄性小鼠中。此外，对3个月和18个月大的WT和Mlkl–/–小鼠的骨髓分析显示，MLKL缺陷很大程度上挽救了髓系偏向造血，并且骨髓中共同淋巴祖细胞(Lin–/c-Kitlo/Sca-1lo/Flk2+/IL-7Rα+)的损失也得到改善。尽管衰老Mlkl–/–小鼠中骨髓HSC数量和细胞死亡频率基本不受影响，但衰老Mlkl–/– HSCs中γH2AX焦点（HSC衰老的标志）的积累显著减轻，表明衰老过程在Mlkl–/– HSCs中减弱。因此，使用3个月和18个月大的WT或Mlkl–/–小鼠HSCs的移植实验显示，与衰老WT HSCs相比，衰老Mlkl–/– HSCs具有更好的再生和B/T淋巴细胞生成潜力，进一步证明与年龄相关的HSC功能下降至少部分是通过MLKL依赖性机制介导的。
MLKL可以通过释放损伤相关分子模式促进炎症。因此，观察到的HSC衰老减弱可能是由于坏死性凋亡介导的炎症的继发效应。为了评估这种可能性，我们分析了3个月和18个月大的WT和Mlkl–/–小鼠骨髓中各种炎症细胞因子的水平。Luminex多重细胞因子分析显示，与年龄相关的炎症细胞因子和趋化因子（包括白细胞介素-1 (IL-1)和活化正常T细胞表达和分泌的调节物(RANTES)）没有明显变化，这些因子与HSCs的髓系偏向相关。与此一致，将3个月大的WT骨髓细胞移植到18个月大的WT和Mlkl–/–小鼠中的相互移植显示，衰老Mlkl–/–环境对WT骨髓细胞的髓系分化没有明显影响，表明MLKL对与年龄相关的骨髓炎症影响最小。
为了进一步评估MLKL介导HSC衰老的机制，我们分析了WT和Mlkl–/– HSCs中与年龄相关的转录组变化。令人惊讶的是，尽管我们能在WT HSCs中检测到与年龄相关的差异表达基因，包括Selp、Mt1和Nupr1作为前三个衰老特征基因，但在衰老WT和Mlkl–/– HSCs之间几乎没有基因显著改变。由于表观遗传变化可以在没有转录组变化的情况下影响HSC命运，我们还评估了WT和Mlkl–/– HSCs中与年龄相关的染色质可及性变化。同样，尽管许多基因组位点在WT HSCs中随着年龄增长显示出可及性改变，但在衰老WT和Mlkl–/– HSCs之间检测到的差异可及位点很少，表明MLKL在衰老过程中对HSC转录组和染色质可及性影响最小。
综上所述，这些结果表明MLKL介导了机体衰老过程中HSC的功能障碍，可能通过独立于骨髓炎症和转录调控的机制。
MLKL介导HSC衰老过程中的线粒体损伤
尽管转录组变化很小，但基因集富集分析确定了几个可能在衰老Mlkl–/– HSCs中改变但在年轻Mlkl–/– HSCs中未改变的候选途径。其中一个候选途径是线粒体氧化磷酸化，它在HSCs衰老过程中上调并与衰老HSCs功能下降密切相关。事实上，透射电子显微镜显示，线粒体延长和肿胀且嵴结构紊乱（在经历复制应激的HSCs历史中观察到的功能失调线粒体的标志）在衰老WT但不在衰老Mlkl–/– HSCs中富集。与这一观察结果一致，免疫电子显微镜分析和邻近连接实验独立显示，活化的、磷酸化的MLKL在丝氨酸345位点(p-MLKL)在衰老HSCs的线粒体中积累。值得注意的是，炎症暴露和FLAG-MLKL过表达也在HSC线粒体中诱导p-MLKL积累。如先前报道的，HSCs中活性氧(ROS)的水平随着年龄增长而降低，但在衰老WT和Mlkl–/– HSCs之间没有观察到ROS水平的变化。自噬体频率和饥饿诱导的自噬通量在衰老WT和Mlkl–/– HSCs之间也相似，表明MLKL对衰老HSCs中的自噬影响最小。然而，与衰老WT HSCs相比，衰老Mlkl–/– HSCs中与年龄相关的线粒体膜电位下降显著缓解。Seahorse分析显示，这些变化与衰老Mlkl–/– HSCs相比衰老WT HSCs中线粒体ATP产生和糖酵解流量的改善相关。虽然年轻动物中HSCs的稀有性使我们无法直接比较年轻和衰老Mlkl–/– HSCs之间的线粒体代谢，但这可能反映了从糖酵解到氧化磷酸化的与年龄相关的代谢重编程的减弱。使用分离的线粒体和重组MLKL蛋白的体外实验表明，线粒体膜电位被重组小鼠MLKL蛋白的N端四螺旋束结构域(MLKL-NTD)降低，该结构域可以在没有刺激的情况下寡聚化并在细胞膜上形成孔，而重组小鼠MLKL-NTD的N端FLAG标记物(FLAG-MLKL-NTD)保留寡聚化能力但不能在细胞膜上形成孔，对线粒体膜电位有较小程度的影响，而重组小鼠MLKL蛋白的C端假激酶结构域(MLKL-CTD)不能寡聚化或在细胞膜上形成孔，对线粒体膜电位没有影响。综上所述，这些结果确定了MLKL是HSCs中与年龄相关的线粒体功能障碍和代谢重编程的关键介导者。
讨论
多种细胞应激和自然发生的机体衰老会导致共同的HSC变化，如再生能力下降、髓系偏向分化和线粒体功能障碍，但共享机制尚不清楚。本文中，我们确定坏死性凋亡效应蛋白MLKL的非经典激活是介导此类与年龄相关的HSC变化的机制。我们的结果表明，对各种与年龄相关的应激（如炎症、复制应激和致癌应激）的响应最终汇聚在HSCs中MLKL的非坏死性凋亡激活上。这种应激诱导的MLKL激活对与年龄相关的细胞内在变化（如HSC存活、HSC转录组和染色质可及性）或细胞外在变化（如骨髓炎症）的影响很小。相反，我们发现活化的MLKL定位于线粒体并直接损害线粒体功能，导致HSCs功能下降。
我们的研究结果描述了一种在HSCs和MPPs中优先激活的共同分子途径，导致累积的线粒体损伤。多项证据表明HSCs可以对压力产生不可逆的细胞变化。对标签保留细胞的终身追踪表明，HSCs通过与分裂历史相关的机制逐渐丧失再生潜力。因此，反复暴露于pIC诱导的炎症对具有分裂历史的HSCs产生累积抑制效应。同样，多轮化疗和移植诱导退出静止状态并导致不可逆的与年龄相关的HSC功能障碍。值得注意的是，功能失调的线粒体在HSCs经历此类复制应激并重新进入静止状态后积累，作为驱动HSC功能障碍的不可逆细胞内在变化。我们的结果与这些观察结果一致，并进一步确立MLKL在这些应激响应下游被共同激活并介导线粒体损伤。已知在HSCs中上游作用于RIPK3–MLKL功能的分子包括RIPK1、Toll-白细胞介素-1受体结构域适配蛋白诱导干扰素β (TRIF)和Z-DNA结合蛋白1 (ZBP1)。这些可能解释了暴露于各种炎症配体时HSCs中MLKL的汇聚激活。我们的数据显示，只有一小部分HSCs在系统性炎症暴露后激活MLKL，这可能是由于异质性HSC池中相关蛋白的可用水平或状态的细胞间差异，或HSCs周围微环境的差异造成的。这与炎症后MLKL激活的短暂性质一起支持这样一种假设：间歇性激活的MLKL在机体衰老过程中对HSCs子集产生累积负面影响，最终导致具有不同程度功能障碍的HSCs积累。转座元件的转录在复制应激时被激活，ZBP1可能感知这些以激活RIPK3–MLKL轴。DNA损伤和不平衡的蛋白质稳态也激活坏死性凋亡途径并损害HSC功能，表明许多已知的与年龄相关的应激源最终可能在HSCs中激活MLKL。由于新兴证据表明MLKL有其他非致死功能的上游调节因子，RIPK3是否绝对需要导致机体衰老过程中MLKL依赖性线粒体损伤值得进一步研究。
我们的结果突显了MLKL在与年龄相关的HSC功能障碍中的非坏死性凋亡作用。先前，我们表明TNF-α–p65轴的激活保护HSCs免于pIC诱导的炎症暴露后的坏死性凋亡细胞死亡。与此一致，我们没有检测到pIC处理后MLKL介导的死亡和死亡HSCs的增加，但我们确实在存活的HSCs中检测到MLKL的激活。这反映了一项最近的研究报告，即强NF-κB活性是TRAF2缺陷肝细胞中坏死性凋亡途径非致死性激活的先决条件。一种对抗MLKL依赖性细胞死亡同时允许活化MLKL在线粒体中定位的促生存机制（如ESCRT-III依赖的质膜修复）应该存在于HSCs中。我们的数据表明，活化的MLKL可以直接通过在线粒体膜上形成孔或间接通过募集其结合伙伴来破坏线粒体功能。后者机制可能涉及观察到的MLKL依赖性代谢重编程，从糖酵解到HSCs中的氧化磷酸化，因为活化的MLKL将RIPK3募集到线粒体并通过RIPK3介导的丙酮酸脱氢酶复合物磷酸化促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A。我们的结果还表明，MLKL依赖性HSC功能障碍可能独立于与年龄相关的转录组和染色质可及性变化。尽管我们的批量测序方法可能会遗漏单细胞测序可能检测到的差异，但这至少部分解释了我们先前关于转录组年轻化对已经衰老的HSCs功能恢复影响有限的发现，并强调了研究不涉及转录调控的分子机制的重要性。MLKL缺陷的部分挽救强烈表明存在其他导致HSCs在衰老过程中线粒体损伤的机制。
最后，尽管我们的结果显示活化MLKL在HSC衰老背景下有害，但这种机制可能在HSCs中因其他背景下的有益特征而被进化保留。尽管我们没有正式分析Mlkl–/–小鼠的寿命，但我们没有注意到它们在发病率和死亡率方面的任何明显差异，这与先前的观察结果一致。鉴于MLKL在HSCs中相比髓系祖细胞的优先激活，MLKL的非致死性激活将使其他可能死亡的HSCs产生足够数量的血液和免疫细胞，帮助清除病原体和组织碎片并解决相关炎症。事实上，最近的一项研究表明，RIPK3和MLKL中的功能丧失突变在裸鼹鼠中被自然选择，裸鼹鼠以其对与年龄相关的组织功能障碍和癌症发展的抵抗力而闻名，但对病毒感染极为敏感。此外，尽管我们表明MLKL可以加速MDS发展，但其他人报告称MLKL可能通过促进白血病干细胞分化来抑制白血病发展。由于人类和小鼠之间执行MLKL依赖性坏死性凋亡所需的因素不一定相同，我们的小鼠HSCs研究结果是否可以直接应用于人类HSCs应在将来进行研究。了解这些MLKL非致死性激活的潜在相反效应及其与人类HSC生物学的相关性将为更好地控制造血系统衰老和与年龄相关的血液疾病提供新机会。
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