外泌体是大小与病毒相当的膜泡（50至150纳米）[1]。它们由肿瘤细胞以及许多其他细胞类型（免疫细胞、结缔组织细胞、血小板）大量生成并释放到血液中。外泌体携带来自其起源细胞的特异性脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白质片段[1-3]。通过外泌体转移蛋白质和核酸，细胞之间可以相互通信。因此，外泌体在生理和病理过程中的细胞间信号级联反应中发挥着重要作用[1]。外泌体既存在于健康人体内，也存在于疾病患者的多重体液之中，包括血清/血浆[3]、尿液[4]、腹水[5]和唾液[6]。由于其双层脂质结构，外泌体非常稳定且易于储存。在4°C的冷藏温度下，它们可以完好无损地保存96小时。在-80°C条件下，可保存数年[7]。这些特性使外泌体成为用于癌症或其他胃肠道慢性疾病诊断及病程监测的非侵入性或微创生物标志物。
外泌体在肿瘤生物学中的作用
外泌体的生物发生是在细胞内体（endosomes）中进行的。在此过程中，微小RNA和信使RNA分子、蛋白质及DNA片段被包裹进外泌体。随后，外泌体通过多囊泡内体被运输至细胞膜，并分泌到细胞外间质或血管中。那里，外泌体可被其他细胞摄取，其包含的核酸和蛋白质内容物也被转移至受体细胞。因此，肿瘤细胞能够借助外泌体将致癌特性传递给其他细胞。
Demory-Beckler及其同事的研究证明，外泌体可以传递突变的KRAS蛋白。这导致原本没有突变的受体细胞增殖显著增强[8]。Melo等人将非肿瘤性乳腺上皮细胞与来自乳腺癌细胞系的外泌体共孵育，结果这些处理过的乳腺细胞形成了肿瘤，而未处理的对照组则未出现肿瘤生长[2]。肿瘤外泌体在预转移微环境的形成中也扮演重要角色。Peinado等人发现，黑色素瘤细胞的外泌体可将c-MET受体传递给骨髓干细胞，从而引起这些骨髓干细胞动员并迁移至肺部。在那里，骨髓干细胞改变局部细胞微环境，导致肺部黑色素瘤转移灶数量增加[9]。
另一项研究表明，胰腺癌细胞的外泌体被肝脏中的巨噬细胞摄取，进而促使巨噬细胞分泌TGF-β。TGF-β导致肝脏中纤连蛋白沉积增加，从而促进肝转移[10]。综上所述，外泌体通过细胞间运输和转移核酸及蛋白质，在肿瘤进展和播散过程中发挥重要作用。因此，识别和表征肿瘤特异性外泌体具有潜在应用价值，可作为血清及其他体液的生物标志物。
肿瘤外泌体的诊断与治疗价值
外泌体几乎存在于所有体液中，且非常稳定。只需几滴血液即可测量其血清含量及分子生物学特征。这相比其他肿瘤标志物（如循环肿瘤细胞）具有明显优势——检测循环肿瘤细胞非常困难且需要抽取更多血液。这些特性是肿瘤特异性外泌体作为非侵入性生物标志物使用的重要前提[1]。
外泌体具有多种与细胞来源无关的典型细胞外和细胞内蛋白。此外，肿瘤特异性外泌体在血清或其它体液中还带有区别于非肿瘤外泌体的额外表面蛋白。例如，卵巢癌患者血清中发现EpCAM阳性外泌体增加；胃癌或乳腺癌患者血清中则检测到携带EGFR家族膜蛋白的外泌体增多[11]。胰腺癌外泌体以EGFR和EpCAM的过表达为特征[12,13]。此外，外泌体还可用于非侵入性获取原发肿瘤的突变状态。Skog等人证明，胶质母细胞瘤患者血清外泌体上存在着与原发肿瘤相同的突变EGFR受体[14]。由于受体状态在治疗中极其重要，未来或许可以借助这种微创技术避免进行高侵袭性的开颅活检。
通过表面标志物可以从血清中识别肿瘤特异性外泌体，并将其用作高灵敏度和高特异性的诊断标志物。在一项研究中，Madhavan等人检测了胰腺癌患者外泌体中的一组蛋白质和微小RNA[13]，能够以高灵敏度（1.00，95%置信区间：0.95-1）和良好特异性（0.80，95%置信区间：0.67-0.90）区分肿瘤患者与健康人。在食管癌患者中，外泌体微小RNA的分析也可能发挥重要的诊断作用。Karen Chiam等人利用由十种外泌体微小RNA组成的多标志物组合，能够以近乎完美的灵敏度和特异性区分食管癌患者与健康供体及非发育不良性Barrett食管患者（曲线下面积：0.99，95%置信区间：0.96-1.00）[15]。Gummireddy等人对肺癌患者的试验也得出了类似前景广阔的结果。通过检测血清中外泌体mRNA转录本AKAP4，他们以92.8%的灵敏度和100%的特异性实现了恶性肿瘤患者与良性肺病患者的鉴别[16]。然而，这些检测方法非常复杂，并且由于涉及多种蛋白质或多重（微小）RNA的组合，容易出现误差。
GPC-1阳性外泌体：用于胰腺早期癌非侵入性诊断的高灵敏度血清标志物
在我们的一项研究中，我们首次证明外泌体含有双链基因组DNA片段。这些DNA（除线粒体DNA外）与其起源细胞的DNA完全相同。此外，我们还证实，通过测序胰腺癌患者血清外泌体中的DNA，可以检测到KRAS和p53突变[3]。不过，我们最初研究中描述的这种方法存在一个缺点——外泌体从血液中富集时特异性不足。通过超速离心获取外泌体，除了肿瘤源性外泌体外，还会富集来自免疫细胞或血小板等非肿瘤细胞的外泌体。我们在后续研究中试图解决这个问题[17]。为此，我们探究是否存在肿瘤特异性表面标志物，可用于从恶性肿瘤患者血清中有针对性地富集肿瘤特异性外泌体。我们发现，糖蛋白Glypican-1（GPC-1）特别富集于胰腺癌的肿瘤外泌体上。在包含约250名胰腺癌患者和140名对照供体的两个独立队列中，我们证明GPC-1阳性外泌体能够以100%的灵敏度和特异性区分肿瘤患者与健康人或非恶性胰腺疾病（慢性胰腺炎和良性囊腺瘤）患者（图1）。
这甚至对于原位癌（pTis）或极早期肿瘤（UICC I期）患者也成立。此外，我们还发现GPC-1阳性外泌体可能适合用作高灵敏度的病程监测标志物。在胰腺癌肿瘤切除术后仅7天，30名患者中有29名血液中Glypican-1阳性外泌体水平显著下降。在同一队列中，标准肿瘤标志物CA 19-9只在30名患者中的19名出现下降。此外，单变量和多变量生存分析显示，GPC-1阳性外泌体明显下降的患者总生存期显著更长。因此，GPC-1阳性外泌体也可能用作非侵入性预后标志物，例如用于患者风险分层，以提供个性化治疗。最后，我们的研究证明，通过表面蛋白GPC-1可以富集肿瘤特异性外泌体。这些外泌体可采用特殊方法（FACS分选）进一步纯化，用于后续分子生物学分析。例如，我们在当前研究中显示，从GPC-1阳性外泌体中分离出的RNA可以推断原发肿瘤的KRAS突变状态（图1）。
图1：GPC-1阳性外泌体潜在应用示意图。胰腺癌患者（上行）血清中可检测到GPC-1阳性外泌体。这些外泌体可用于进一步的分子生物学分析，例如通过非侵入性血液检测确定原发癌的突变状态。患有良性胰腺疾病的患者（下行）血液中没有GPC-1阳性外泌体，因此最初不需要进一步的肿瘤学处理。
结论
我们以及其他研究团队均已证明，通过外泌体的分子生物学特征分析，可以显著提高非侵入性血清肿瘤标志物的诊断精确度。尤其糖蛋白GPC-1在胰腺癌患者中似乎具有高度特异性和敏感性。因此，未来GPC-1阳性外泌体可能在胰腺癌早期检测中发挥作用。如果我们的研究结果能在更多包括前瞻性队列的多中心研究中得到证实，那么GPC-1阳性外泌体将有助于改善胰腺癌的预后。胰腺癌或其癌前病变发现得越早，手术完整切除肿瘤的可能性就越高，从而显著提高治愈机会——目前该疾病在初次诊断后五年内死亡率高达95%。
参考文献
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原文引用来源：Kahlert C./Rahbari N./Reißfelder C./Weitz J. Tumor-spezifische Exosome: hochsensitive Diagnostikmarker für die Früherkennung von gastrointestinalen Karzinomen. 2015 November, 5(11): Artikel 02_05.
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