摘要
背景
犬认知功能障碍(CCD)是一种自然发生的老年犬疾病，与阿尔茨海默病(AD)具有行为和病理学相似性。尽管如此，对CCD的体内成像研究有限，据我们所知，尚无研究调查使用弥散张量成像(DTI)来评估此病症中的脑萎缩。本研究的主要目的是确定DTI是否能够检测CCD老年犬与认知健康老年犬之间白质微结构的差异。次要目的是评估DTI参数与犬痴呆量表(CADES)得出的认知评分之间的相关性。我们假设CCD犬在胼胝体(CC)和丘脑中会表现出较低的分数各向异性(FA)和较高的平均弥散率(MD)、轴向弥散率(AxD)和径向弥散率(RD)。我们进一步假设这些变化将与认知功能障碍严重程度相关。
结果
DTI揭示了CCD犬与认知健康老年犬之间白质弥散性的显著差异。与健康对照组相比，CCD犬丘脑中的MD更高(CCD: 0.00063 mm²/s，四分位距IQR 0.00062-0.00066；n = 20，健康组: 0.00060 mm²/s，IQR 0.00060-0.00063；n = 10；p = 0.022)。CADES评分与CC中的MD(rho=0.343，p = 0.0471)和丘脑中的MD(rho=0.483，p = 0.0038)呈正相关，也与丘脑中的RD(rho=0.416，p = 0.0144)呈正相关。
结论
这些结果表明，DTI能够检测犬脑中CCD和认知健康老年犬的白质完整性变化。我们的发现表明，轴突变性(通过增加的MD和RD值反映)与认知功能障碍加重相关。这些模式与阿尔茨海默病中报告的发现一致，并支持DTI用于监测CCD犬神经病理进展的潜力。总体而言，我们的结果突显了DTI在表征与CCD相关的结构性脑变化方面的实用性，并强化了CCD作为AD模型的转化相关性。需要进一步研究以确定DTI在临床环境中是否能可靠区分CCD与正常衰老。
背景
犬认知功能障碍(CCD)是一种进行性神经退行性疾病，影响14%-35%的老年犬，并在行为和病理学上与阿尔茨海默病(AD)相似。CCD和AD之间共享的病理变化包括β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块、脑萎缩、脑室扩大和轴突降解。由于犬类会自发发展出神经病理变化并与人类共享环境风险因素，它们似乎是AD的一个有希望的模型。CCD引起的认知变化包括定向障碍、睡眠-觉醒障碍和室内大小便失禁，随着疾病严重程度的进展，这些变化相对容易被主人识别和监测。然而，仍需要进行高级成像研究—特别是弥散张量成像(DTI)—以验证犬作为稳健的阿尔茨海默病模型。
以往对AD和CCD的常规MRI研究已报告皮质或海马萎缩、脑室扩大和弥漫性白质信号变化，但这些宏观发现无法揭示微结构损伤。弥散张量成像(DTI)已被证明在评估AD患者白质微结构完整性方面具有前景。DTI测量组织中水分子扩散的方向性和幅度，可以表征整个大脑的脱髓鞘和轴突降解。研究表明，DTI可以区分AD与正常脑衰老，可能作为轻度认知障碍(MCI)患者AD风险的生物标志物。然而，关于DTI在区分AD与衰老病理方面的有效性尚缺乏共识。需要更多研究来确定AD与人类衰老大脑之间DTI指数存在显著差异的白质区域。
DTI已被用于表征犬的各种神经系统疾病，包括脊髓损伤、特发性癫痫和退行性髓病，在区分健康犬与患病犬方面取得不同程度的成功。最近一项研究调查了衰老犬脑中的白质变化，报告了与健康对照组相比，在顶叶和颞叶区域、胼胝体(CC)、中脑和穹窿中的DTI指数存在明显改变。迄今为止，尚无研究使用DTI来表征CCD犬的白质完整性。
因此，本研究的主要目的是使用弥散张量成像(DTI)量化CCD老年犬与认知健康老年犬之间白质微结构的差异。次要目的是确定DTI指标是否与犬痴呆量表(CADES)测量的认知障碍严重程度相关。我们假设CCD将与胼胝体和丘脑中较低的分数各向异性(FA)和较高的平均弥散率(MD)、轴向弥散率(AxD)和径向弥散率(RD)相关，并且这些改变将随着CADES评分的升高而增加。
结果
队列特征
20只犬的犬痴呆量表(CADES)评分>8(62.5%)，因此被归类为具有CCD迹象：8只雄性绝育犬(40%)和12只雌性绝育犬(60%)，年龄范围为8.8-15.2岁(12.4±1.81岁，平均值±标准差)，体重范围为6.3至35.5千克(17.2±8.25千克)。12只犬被归类为认知健康(37.5%)：8只雄性绝育犬(66.7%)和4只雌性绝育犬(33.3%)，年龄范围为8至14.5岁(10.4±2.29岁)，体重范围为7.4至44.4千克(26.7±13.0千克)。CCD组和健康组的CADES调查平均评分分别为43.7±20.6和2.17±2.62。在CCD组中，5只被归类为轻度CCD(CASED评分8-23)，4只被归类为中度CCD(CADES评分24-44)，11只被归类为重度CCD(CADES评分45-95)。CCD组内常见的行为变化包括夜间游荡、不当排尿、易怒和焦虑增加。人口统计信息和CADES评分总结在表1中，而附加文件1提供了每位患者的个人人口统计数据和DTI指数变化。
表1 健康犬和CCD犬的人口统计信息和CADES评分摘要
ROI质量和观察者间一致性
在分析之前，由于严重的背腹弯曲，排除了三个样本，另外两只犬因畸变导致无法可靠放置ROI而被从丘脑分析中移除，最终留下20只CCD犬和10只健康犬的丘脑ROI图像。表2总结了所有ROI的观察者间一致性，以具有95%置信区间的组内相关系数(ICC)表示。
表2 比较两个区域主观数据收集的观察者间分析
DTI指标的组间差异
评估了所有收集的DTI变量(FA、MD、AxD和RD)的正态性。正态分位数-分位数图表明DTI变量不服从正态分布。因此，执行Wilcoxon秩和检验以比较CCD组和健康组之间每个DTI变量的中位数。图1总结了健康犬和CCD犬胼胝体(CC)中的DTI指标，而图2显示了相应的丘脑指标。根据此分析，CCD犬丘脑中的MD中位数显著高于健康犬观察到的值(CCD: 0.00063 mm²/s，IQR 0.00062-0.00066；n = 20，健康组: 0.00060 mm²/s，IQR 0.00060-0.00063；n = 10；p = 0.022)。
图1
健康犬和CCD犬胼胝体(CC)中的中位分数各向异性(FA)、平均弥散率(MD)、轴向弥散率(AxD)和径向弥散率(RD)。误差条表示四分位距(IQR)。健康组和CCD组之间无显著差异
图2
健康犬和CCD犬丘脑中的中位分数各向异性(FA)、平均弥散率(MD)、轴向弥散率(AxD)和径向弥散率(RD)。误差条表示四分位距(IQR)。健康组和CCD组之间的MD观察到显著差异(p = 0.022)
与CADES评分的相关性
计算Spearman秩相关以评估CADES评分与DTI参数之间的关系。CADES评分与胼胝体中的MD(rho=0.343，p = 0.0471)以及丘脑中的MD和RD(rho=0.483，p = 0.0038；rho=0.416，p = 0.0144，分别)呈正相关。
事后功效分析
使用α = 0.05对CC和丘脑中的每个DTI参数(FA、MD、AxD、RD)进行事后功效分析。事后功效分析的结果见表3。"功效"列表示我们当前样本达到的统计功效，而"n.80"和"n.90"列分别表示在相同效应大小下达到80%或90%功效所需的样本量。这些结果表明，需要更大的队列来检测大多数指标中可靠的组间差异。此外，它们表明丘脑MD和RD可能是区分CCD与健康衰老犬的最有希望的参数。
表3 CCD组和健康组之间DTI指数的事后功效分析
讨论
我们将20只CCD犬与12只年龄相似的健康犬进行了比较，以研究认知衰退犬模型中白质微结构的差异。我们发现，通过CADES调查评估的认知衰退与两个DTI参数相关，即CC和丘脑中的MD，以及丘脑中的RD。此外，我们发现CCD犬丘脑中的平均MD比健康对照组高。这些发现表明，DTI可以检测CCD犬与认知健康老年犬之间轴突完整性的差异，并且随着认知功能障碍严重程度的增加，轴突完整性可能会降低。尽管需要进一步研究以确定DTI作为CCD诊断工具的可行性，但我们的研究揭示了DTI用于研究CCD脑中弥散性变化的适用性，这可能揭示CCD作为AD转化模型的更广泛应用。
平均分数各向异性(FA)、平均弥散率(MD)、轴向弥散率(AxD)和径向弥散率(RD)的值提供了白质完整性的见解，并指示白质降解或脱髓鞘。在衰老和AD中已报告较低的FA和较高的RD和MD，这被认为反映了髓鞘减少、轴突结构破坏以及白质组织的整体稀疏化。在最近的一项研究中，通过较低的改良简易精神状态检查(MMMSE)和临床痴呆评定(CDR)评分识别的AD人类患者在主要白质束(包括脾、扣带回和弓状束)内显示出广泛的MD增加和FA减少。我们的CCD队列中出现了类似的模式：较高的CADES评分与丘脑和CC脾中的MD增加相关。这些趋同的观察结果表明，CCD和AD共享一些微结构特征，支持进一步探索CCD犬作为人类AD的转化模型。
胼胝体(CC)是连接两个大脑半球的最大纤维束，在半球间处理中起着重要作用。CC萎缩可以在AD早期阶段检测到，这可能解释了为什么AD患者难以执行需要半球间处理的任务。在整个研究过程中，CC的脾在FA图上定义清晰且易于区分，从而实现了ROI选择的一致界定。观察到CADES评分与CC中的MD呈正相关(p = 0.0471)，表明认知缺陷似乎与CC中MD的增加相关。类似地，AD研究发现，与对照组相比，AD患者的CC脾DTI分析显示MD、AxD和RD值显著增加。另一项研究发现，AD患者CC脾中的MD增加。我们研究中观察到的CADES评分与CC中MD之间的正相关强调了DTI用于量化与认知功能下降相关的轴突完整性变化的有希望用途。
丘脑是大脑中一个定义明确的区域，通过其与Papez回路的轴突连接在记忆和情绪处理中起着重要作用。有证据表明，情景记忆的丧失可能与涉及边缘丘脑的Papez回路的退化相关。丘脑已知受到AD病理的影响，特别是神经原纤维变化，而犬研究表明，在CCD犬中，Papez回路和边缘丘脑中tau病理升高。在本研究中，我们发现CCD犬丘脑中的平均MD比非CCD老年对照组增加(p = 0.022)。此外，丘脑中的DTI发现显示CADES评分与MD(p = 0.0038)和RD(p = 0.0144)值呈正相关，表明增加的轴突弥散性与认知衰退恶化相关。对AD患者丘脑中白质束的研究发现，与对照组相比，FA较低而RD较高。另一项研究表明，与健康对照组相比，重度AD阶段的患者在丘脑连接区域(包括穹窿、前丘脑辐射和左后丘脑辐射)中FA降低而MD增加。我们的分析表明，随着认知衰退迹象的恶化，丘脑弥散性增加而各向异性降低，这与来自衰老和阿尔茨海默病神经影像学研究的人类DTI数据相对应。
本研究的主要限制是样本量适中，导致大多数DTI指标的事后功效较低(表3)，并需要将轻度、中度和重度CCD病例合并为一个组。未来的研究应招募更大的队列，并分别分析具有不同CCD严重程度的犬，以阐明特定阶段的白质变化。此外，犬根据各种因素表现出不同程度的认知障碍迹象——体型较大的犬CCD风险发生率较低，而体型较小的犬、长头品种和纯种犬CCD风险患病率较高。随着CCD研究范围的扩大，检查体型和品种对CCD严重程度以及因此对神经影像参数的影响将至关重要。尽管我们的研究功效不足，但这项初步研究的有希望结果表明，未来关于DTI作为CCD诊断工具和犬监测参数的研究应包括更大的人群，这最终将有助于验证犬作为AD研究的适当模型。
磁共振图像的低分辨率和畸变限制了区分大脑中各个区域的能力，排除了对其他重要结构的分析。由于磁共振成像(MRI)数据采集中的技术错误，最初未包括相反相位编码方向的图像获取。将相位编码序列添加到协议中将允许在MRI预处理步骤中使用topup，这将减少大脑从前到后的畸变，增加脑结构的完整性。此外，此步骤还将允许使用eddy，这是eddy_correct的一种更高级形式，将进一步校正涡流运动伪影。
最后，本研究仅专注于DTI，未包括容积MRI、血液生物标志物或CCD的死后确认；整合这些模式对于犬模型的全面验证至关重要。尽管存在这些限制，我们的发现为使用DTI检测CCD中的脑微结构变化提供了令人鼓舞的概念验证。
未来调查将包括使用DTI序列来表征健康年轻犬、健康老年犬、轻度认知障碍犬、中度认知障碍犬和重度认知障碍犬之间指数的差异。将分析脑区域的组织病理学、血清和脑脊液生物标志物，并与DTI参数的变化进行比较，以进一步表征上述各组之间的差异。基于过去的研究，将使用DTI分析以下解剖结构，这可能会揭示更显著的变化：前额叶、颞叶、顶叶、内嗅、枕叶皮层和边缘结构。
将DTI参数与生物标志物进行比较也可能提供有关疾病严重程度的见解，并进一步发展DTI和其他CCD潜在诊断标准的诊断作用，以及了解DTI作为AD治疗药物试验中犬模型监测工具的效用。与老年犬和年轻对照组相比，轻度认知障碍的犬中发现血清中肝酶(天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)轻微升高，钠和氯降低，以及神经丝轻链水平升高。血浆中的β-淀粉样蛋白浓度也可能提供有关认知障碍严重程度的见解；一项研究表明，血清中总Aβ40与Aβ42的比率增加可以有效区分轻度认知障碍犬与健康犬和重度认知障碍犬。因此，将血液中β-淀粉样蛋白水平与DTI参数进行比较，可以提供有关疾病从轻度到重度认知障碍进展过程中弥散性如何变化的见解。总体而言，将生物标志物数据与DTI发现相结合可能会提高CCD的诊断准确性和监测能力。这种综合方法还可以加强CCD作为阿尔茨海默病(AD)转化模型的效用。
结论
本研究表明，DTI可以检测CCD犬的白质微结构变化，特别是在CC和丘脑中。我们观察到CADES评分与MD和RD值之间存在正相关，表明随着认知障碍严重程度的增加，轴突完整性下降。这些发现与阿尔茨海默病(AD)中观察到的模式一致，并支持CCD作为AD研究转化模型的潜力。尽管存在技术限制和小样本量，我们的结果为未来研究DTI作为老年犬群中诊断和监测工具奠定了基础。需要进行更大队列和互补生物标志物的进一步研究，以验证这些发现并改进对CCD病理生理学的理解。
方法
受试者
在2021年8月19日至2023年2月10日期间，从科罗拉多州立大学兽医教学医院(美国科罗拉多州柯林斯堡)的客户群体中前瞻性招募了32只犬受试者。本研究的所有方面均获得科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会以及临床评审委员会的批准(IACUC协议编号：4106和3384)。在程序之前，所有主人均提供了进行全身麻醉下MR成像和使用数据进行研究的知情同意。本研究未进行安乐死。有16只雄性绝育犬和16只雌性绝育犬，来自17个不同品种：美国比特斗牛梗(n = 1)、澳大利亚牧羊犬(2)、蓝色斑点猎犬(1)、边境牧羊犬(2)、拳师犬(1)、切萨皮克湾寻回犬(1)、可卡犬(2)、腊肠犬(1)、德国牧羊犬(2)、德国短毛指示犬(1)、拉布拉多寻回犬(2)、迷你贵宾犬(1)、哈巴狗(3)、罗得西亚脊背犬(1)、西施犬(1)、魏玛猎犬(1)以及混种犬(9)。由于关于CCD弥散张量成像的文献有限，无法进行先验样本量计算。本研究结果可指导未来样本量计算。
根据神经学检查和问卷评分，将参与者分为两组。使用先前发表并验证过的主人指导调查表——犬痴呆量表(CADES)来确定犬的认知健康状况。CADES问卷包含17个与犬行为变化相关的问题，包括空间定向、社会定向、社会互动、睡眠-觉醒周期和室内大小便失禁。正常老化评分范围在0-7分之间，轻度认知障碍在8-23分之间，中度认知障碍在24-44分之间，重度认知障碍在45-95分之间。CADES调查评分>8的犬被归类为具有CCD迹象，而评分在0-7之间的犬被归类为认知健康。所有犬均大于8岁。由认证兽医神经病学家(S.M)或兽医神经病学住院医师(M.U.)进行神经学检查和解剖磁共振成像(MRI)分析，以排除由于结构性病理引起的认知衰退，两者均对CADES评分不知情。
磁共振成像(MRI)获取
犬的磁共振成像在全身麻醉下由认证兽医麻醉师进行。对犬进行MR成像是标准做法。所有犬在获取MRI序列后均顺利恢复。动物预先使用甲磺酸吗啡(0.1-0.5 mg/kg)或布托啡诺(0.1-0.5 mg/kg)进行预处理。诱导前放置预氧和监测设备(视情况而定)。静脉注射丙泊酚(2-5 mg/kg)和咪达唑仑(0.1-0.2 mg/kg)。诱导后立即开始机械通气以防止二氧化碳增加。使用异氟烷或七氟烷与持续丙泊酚输注(100-400 mcg/kg/min)维持麻醉。在整个过程中监测心率和节律、体温、直接动脉血压、呼气末二氧化碳和血氧饱和度水平。使用3.0T西门子Skyra(西门子医疗系统有限公司，德国埃尔朗根)全身扫描仪(70厘米孔径)，在45 mT/m振幅和200 T/m/s转换率下进行MRI。受试者以背侧卧位放置，头部居中于15通道接收-发射膝线圈中。在横轴平面中获取弥散张量图像(TR=3120，TE=112.40，翻转角=78°，各向同性体素大小为1.64×1.64×1.90 mm，平面内视野=213 mm，矩阵大小130 mm×130 mm，138个梯度方向，b=0和2000 s/mm²)。
扩散MRI预处理
使用FMRIB软件库(FSL)中的eddy_correct对扩散加权成像(DWI)数据进行涡流畸变和运动校正。使用FSL中的脑提取工具(BET)创建脑掩模，将脑与周围组织分离，使用-m、-f 0.85和-R的索引。
使用FSL中的FMBRIB扩散工具箱5.0将DTI模型拟合到数据，创建分数各向异性(FA)、平均弥散率(MD)、径向弥散率(RD)和轴向弥散率(AxD)的体素级张量图。FA是组织中扩散方向性的度量，值范围从0(各向同性)到1(各向异性)。在白质中，各向异性扩散是由于膜和髓鞘的存在。MD反映体素中总扩散的幅度，与方向性无关。AxD是平行于主要扩散方向的扩散，而RD是垂直于主要扩散方向的扩散。
在图像处理的每个步骤中都对所有图像进行了视觉检查。由于难以识别目标脑区域，那些严重畸变的扩散张量图像被排除在研究之外。
感兴趣区域定义
在感兴趣区域(ROI)选择之前，研究被盲法和随机化。临床试验协调员在整个研究过程中了解组分配，并在MRI分析后解除盲法。为了克服犬受试者之间的解剖和脑尺寸差异，使用Fsleyes edit模式进行手动ROI选择。由于在CCD犬中观察到的组织病理学变化，考虑分析以下区域：丘脑、海马、胼胝体、穹窿和皮层。图像畸变和低分辨率阻碍了海马、穹窿和皮层区域的一致界定。因此，由于基于一致的MRI质量/分辨率的体素选择可行性，选择了胼胝体(CC)的脾和丘脑作为ROI。兽医神经病学住院医师(M.U.)和兽医神经病学研究助理(J.H.)分别选择每个图像样本的ROI体素，在完成所有分析后，使用每个图像两个ROI的平均值。对所有图像进行视觉检查，并将那些严重畸变导致CC或丘脑中ROI界定不可靠的数据集标记为排除。
胼胝体脾中包含四个体素，丘脑中包含八个体素，以最大限度地减少对无关结构的污染，同时最大化包含在每个参数均值中的数据点。使用FA图的横截面来可视化结构，并使用彩色FA图来增强轴突束的可见性，并在选择丘脑ROI的体素时避免内囊污染，在选择CC ROI的体素时避免脑室污染。图3显示了使用黑白和彩色FA图的CC(A和B)和丘脑(C和D)的ROI示例。使用fslmeants从ROI中提取平均数据。获取每个受试者的CC和丘脑的平均FA、MD、AxD和RD。
图3
来自认知健康老年犬的弥散张量图像上的感兴趣区域(ROI)。A 胼胝体(CC)脾周围绘制的分数各向异性(FA)图。B 显示相同CC ROI的相应彩色编码FA图；主要扩散方向呈现为红色(左右)、绿色(背腹)和蓝色(头尾)，突出显示左右定向的胼胝体纤维(红色)。C和D 分别在FA图和FA彩色图上绘制的丘脑ROI
统计
统计分析由统计学家(T.Z.)、兽医神经病学住院医师(M.U.)和兽医神经病学研究助理(J.H)使用R统计软件(R Core Team, 2023)和GraphPad Prism(GraphPad Prism 10.5.0 for macOS, GraphPad Software, Boston, Massachusetts, USA)进行。
使用Shapiro-Wilk检验筛选所有连续变量的正态性。由于DTI变量非正态分布，使用双侧Wilcoxon秩和检验评估组间差异(CCD vs 健康)。使用Spearman秩相关系数(ρ)评估犬痴呆量表(CADES)评分与DTI参数(FA、MD、AxD、RD)之间的相关性。
使用双向随机效应组内相关系数(ICC，单次测量，绝对一致性)量化感兴趣区域(ROI)测量的观察者间可靠性，并解释为差(<0.50)、中等(0.50-0.75)、良好(0.75-0.90)或优秀(>0.90)。
对胼胝体(CC)和丘脑中的每个DTI参数执行事后功效计算(80%和90%目标)，以估计未来研究所需的样本量。显著性水平设定为α = 0.05；由于研究是探索性的，未应用多重比较校正。
【全文结束】
