阿尔茨海默病（AD）是一种最常见的痴呆形式，其病理特征是淀粉样纤维的积累，这些纤维由淀粉样β肽（Aβ）组成。作为一种新型治疗方法，我们之前开发了一种偶氮苯-硼复合型光催化剂，该催化剂能够对Aβ纤维进行光氧化。利用这种光催化剂在体内的光氧化反应成功减少了大脑中的Aβ纤维。由于Aβ纤维是AD患者脑中致病分子之一，因此该光催化剂有望成为针对AD的疾病修饰疗法的新手段。然而，光能量与Aβ纤维光氧化活性之间的具体关系尚不清楚。本文通过质谱分析表明，添加到Aβ纤维中的氧原子数量随着光能量对数的增加呈现S形曲线增长。我们还发现，这取决于总光能量，而不是辐照度。这些数据表明，即使在较低的光能量水平下，光氧化也可能发生，并且可能在光难以穿透的区域（如人脑）诱导光氧化。
引言
阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆形式，其病理特征是淀粉样纤维的积累，这些纤维由淀粉样β肽（Aβ）组成。Aβ从可溶状态转变为不溶性淀粉样纤维，具有交叉β片层结构，导致神经元功能障碍。有多种Aβ种类，例如Aβ42和Aβ40，特别是Aβ42更容易聚集。
目前针对AD的疾病修饰疗法之一是靶向聚集Aβ的抗体药物。例如，最近批准的lecanemab是一种抗Aβ抗体，它结合大脑中的聚集Aβ并促进小胶质细胞的清除，从而改善病理并减缓疾病进展。这些优秀的临床结果强烈表明清除AD患者大脑中的聚集Aβ的重要性。然而，抗体药物仍存在一些问题，不仅包括高昂的开发成本，还包括由于其大分子量导致的低血脑屏障渗透性。因此，仍需要其他增强淀粉样蛋白清除的策略。
我们开发了一种光氧化技术，可以使用小化合物光催化剂选择性地氧化Aβ聚集体。该光催化剂设计为仅在与Aβ聚集体结合并受到光照时激活，从而生成单线态氧并对周围的聚集体进行氧化。此外，我们还基于偶氮苯-硼复合物结构开发了具有改进血脑屏障渗透性的光催化剂，并成功展示了通过静脉注射这种催化剂和颅外光照在活体AD模型小鼠脑中非侵入性地进行体内光氧化。该催化剂可以选择性地氧化Aβ聚集体中的6His、13His、14His和35Met残基，而不是Aβ单体。重要的是，我们已经证明，体内光氧化可以通过增强小胶质细胞的清除作用来减少大脑中聚集的Aβ量。此外，我们确认Aβ的光氧化抑制了对原代神经元的细胞毒性。这些结果表明，光氧化可与抗体疗法相媲美，并具有作为AD新治疗策略的潜力。然而，尽管光催化剂通过光照激活，但Aβ光氧化与光能量之间的详细关系仍不清楚。本文我们聚焦于基于偶氮苯-硼复合物开发的具有血脑屏障渗透性的光催化剂，并研究了在610 nm波长下的光能量对Aβ纤维光氧化活性的影响。我们发现，光氧化随着光能量对数的增加呈S形曲线而非线性增长，这表明即使在较低的光能量水平下，光氧化也可能发生，并且可能在光难以穿透的区域（如人脑）诱导光氧化。
材料与方法
照射装置的设计
带有搅拌台的照射装置显示出递送到样品中光催化剂的高均匀性光能量。该装置由阵列橙色LED（波长610 nm，Nippon Chemical Industrial Co., Ltd.）和带有铝镜的导光装置组成，外部覆盖黑色塑料。对于搅拌台，在距离1 cm处放置了一个透明防滑亚克力板，下方是一个涡旋混合器的橡胶附件。照射装置用夹具定位以覆盖搅拌台上的培养皿。样品使用涡旋混合器搅拌，并从侧面使用风扇供应空气。
测量辐照度和均匀性
使用光谱辐射计USR-45DA（Ushio Inc.）测量照射表面的辐照度和光谱。根据光谱辐照度分布确定峰值波长、半高宽和辐照度。辐照均匀性评估为位于照射表面中心±15 mm网格测量点上的最高和最低辐照度之比。
样品温度测量
使用热成像仪（Teledyne FLIR LLC）测量照射期间样品的温度。热成像图从设备侧面拍摄。温度从图像中估算。
Aβ纤维的制备
淀粉样β同肽（Aβ42，Peptide Research Institute Co., Ltd.）溶解在0.1% TFA（Sigma-Aldrich Co. LLC）中至终浓度200 μM，并储存在-80°C。将储存溶液稀释在0.1 M磷酸盐缓冲液pH 7.4（焦磷酸钠和磷酸二氢钠；FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）中至终浓度20 μM用于Aβ42同肽。在中性条件下，Aβ42通过分子内O到N酰基转移反应生成。然后将溶液在37°C孵育3小时以产生Aβ42纤维。
Aβ纤维的光氧化
偶氮苯-硼复合型光催化剂溶解在二甲基亚砜（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）中至终浓度1 mM，并储存在-80°C。将储存溶液加入Aβ42纤维溶液中至终浓度5 μM（=25 mol%）至20 μM（=100 mol%）。将100 μL溶液转移到培养皿中进行照射。照射后（100 mW/cm²持续3秒至1000秒），从培养皿中收集样品并进行质谱分析。请注意，添加光催化剂后，样品在避光容器中处理。
计算Aβ纤维的平均光氧化次数
光氧化后，使用C18树脂填充吸头（Merck Life Science）提取并脱盐Aβ42纤维。样品/基质混合物在MALDI板上使用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.）结晶，并用作MALDI-TOF MS（SHIMADZU CORPORATION）的样品。
获得质谱以计算Aβ42纤维的光氧化次数。对于质谱中的每个氧加合物峰，根据分子量分配光氧化次数。然后根据信号强度比计算每个氧加合物的比例。最后，将所有比例和氧加合物数量的乘积相加以计算平均光氧化次数，这是光氧化的代表性值。
拟合模型和ED50计算
在本研究中，我们使用以下公式作为反应模型，表示光氧化次数（y）与照射能量（x）之间的关系：
$$ y = a\left( {1 - e^{ - bx} } \right) $$
其中a是光氧化次数的饱和值，b与有效剂量成反比。通过将光氧化次数的一半饱和值代入方程[1]，可以推导出ED50如下：
$${\text{ED}}{50} = x{{\left( {y = 0.5a} \right)}} = \frac{\ln 2}{b}$$
方程[1]的推导如下。
假设催化剂的光氧化速率与Aβ纤维上剩余的未光氧化位点的浓度成正比，则光氧化速率使用初始未光氧化位点浓度[Non]init、光氧化位点浓度[Oxygenated]和速率常数k表示如下：
$$ \frac{d}{dt}\left[ {{\text{Oxygenated}}} \right] = k\left( {\left[ {{\text{Non}}} \right]_{{{\text{init}}}} - \left[ {{\text{Oxygenated}}} \right]} \right) $$
解此方程得：
$$ \left[ {{\text{Oxygenated}}} \right] = \left[ {{\text{Non}}} \right]_{{{\text{init}}}} \left( {1 - e^{ - kt} } \right) $$
由于照射能量（x）与照射时间（t）成正比，光氧化次数（y）与光氧化位点浓度[Oxygenated]成正比，因此y与x之间的关系可以表示如下：
$$ y = a\left( {1 - e^{ - bx} } \right) $$
使用最小二乘法将方程[1]拟合到实验数据以获得饱和值（a）和ED50。
统计分析
在图2、图3和图4中，进行了多次实验，并计算了平均值和标准偏差。值表示为平均值±标准偏差。在图表中，观察值用圆圈表示，平均值用线条表示，标准偏差用误差条表示。
结果
照射装置的开发
为了评估光氧化活性与光能量的确切关系，我们首先开发了照射装置。该装置的光谱辐照度分布显示波长为610 nm，半高宽为86 nm。在九个代表点测量的辐照度为100 mW/cm²。如图1D所示，辐照度为98.4 ± 1.26 mW/cm²，辐照均匀性（最大值与最小值之比）为96.2%。在18分钟连续照射期间，每30秒的辐照度变化为0.26%，峰值波长偏移为0.024 nm。此外，照射10分钟使温度升高不到2°C。这些数据表明，只要辐照度低于100 mW/cm²且照射时间不超过18分钟，该装置可以向样品提供稳定和均匀的光，且辐照度和峰值波长的不稳定性可忽略不计。本研究的实验在此范围内进行。
光催化剂浓度和光能量依赖的Aβ光氧化
我们使用质谱分析评估了Aβ42纤维的光氧化活性。虽然天然Aβ42峰的分子量为4512，但在使用25%至100%摩尔比的不同浓度光催化剂和30 J/cm²照射能量进行光氧化时，我们观察到Aβ42额外出现14至81分子量的峰。此外，根据信号强度计算的添加到Aβ42中的平均氧原子数显示光氧化与催化剂浓度之间存在线性相关（相关系数为0.984），表明光催化剂浓度依赖的光氧化活性。
接下来我们研究了光氧化活性与光能量的关系，使用100%摩尔比的光催化剂和不同光能量（0.3至100 J/cm²）对Aβ42纤维进行光氧化。我们观察到平均氧化次数呈S形增加，而非线性增加。ED50（半最大有效光能量）估计为6.05 ± 1.02 J/cm²。
辐照度（W/cm²）表示每秒的光能量（J/cm²）。然后我们检查了当设置光能量为3 J/cm²时，不同辐照度和时间下的光氧化活性。我们发现光氧化活性不受辐照度影响，这表明它取决于总光能量，而不是特定于设备的辐照度。
讨论
照射是实现光氧化充分治疗效果的重要因素。在本文中，我们明确表明，根据协同反应机制，Aβ纤维的光氧化活性以S形方式依赖于光能量。考虑到之前研究中显示的光催化剂的催化循环和反应机制，光催化剂的光氧化被认为通过以下五个步骤进行：第一步是光催化剂与Aβ纤维的结合；第二步是结合光催化剂通过吸收光子激发；第三步是激发光催化剂的系间穿越到三重态；第四步是能量转移到氧气，生成单线态氧；第五步是单线态氧与Aβ纤维的反应。所有步骤都可能涉及光能量依赖的光氧化。
我们之前报道过，这种光催化剂对聚集Aβ的Kd值为3.4 μM。考虑到当Aβ浓度为20 μM时，在光氧化过程的第一步中，Aβ-催化剂复合物的形成预计会随着催化剂浓度增加而线性增加，直到100 mol%，并在100 mol%以上趋于平稳。此外，如图2所示，我们在0-100 mol%范围内揭示了光氧化活性与光催化剂浓度之间的线性关系。这表明光氧化活性可能取决于结合光催化剂的浓度，且高达100 mol%的光催化剂浓度适合有效的光氧化。
另一方面，我们也揭示了光能量与光氧化之间的S形关系。光氧化被认为是一个涉及多个步骤的协同反应。此外，如图3所示，我们的结果符合方程[1]，该方程假设在第五步中，光氧化速率取决于未光氧化位点的浓度。这些涉及多个步骤和因素的协同反应可以解释光能量与氧化之间的S形关系。此外，如方程[2]所示，我们可以从结果中估计ED50，它代表光氧化达到50%时的光能量。之前使用蒙特卡罗模拟研究近红外光在大脑中的穿透深度时报道，大约10%的入射近红外光（660-980 nm）到达灰质。尽管仍需进一步研究，但这表明从体表输送60 J/cm²的光能量足以在大脑中使用该光催化剂进行光氧化时提供6 J/cm²的ED50光能量。
据推测，光氧化最终取决于反应过程第2-3步中激发光催化剂的总量。并且预计激发光催化剂的总量取决于照射给予的总光子数。因此，图4显示光氧化取决于总光能量，而不是辐照度。换句话说，光氧化可以在100 mW/cm²辐照度下进行20分钟或10 mW/cm²辐照度下进行200分钟同样发生。此外，即使提供极高的辐照度，激发光催化剂的数量也可能饱和，无法吸收额外的能量。我们可以根据反应机制选择具有适当辐照度和照射时间的光装置，以避免因较高辐照度引起的高温而导致的烧伤等负面效应。
在本文中，我们成功展示了在体外分析中诱导光氧化活性所需的光能量。然而，我们仍需考虑如何将这一数量的光能量输送到人体的适当脑区。在本文中，我们揭示了光氧化随着光能量对数的增加呈S形曲线而非线性增长。这表明即使在较低的光能量水平下，光氧化也可能发生，并且可能在光难以穿透的区域（如人脑）诱导光氧化。然而，光能量会被许多生物因素（如颅骨、血液和脑组织）吸收而损失。此外，已知随着AD阶段的进展，Aβ沉积从皮质扩散到包括海马和基底神经节在内的边缘系统，最后到达下丘脑、脑干和小脑。这表明我们需要根据AD的不同阶段考虑不同的照射方法和设备，因为光照射设备与目标区域之间的距离不同。还需要进一步研究以开发用于光氧化临床应用的光照射设备。
结论
在这项研究中，我们成功揭示了光能量作为使用基于偶氮苯-硼复合物开发的具有血脑屏障渗透性的光催化剂进行Aβ光氧化的重要参数的药效学反应。我们的发现将有助于开发光照射方法，以实现Aβ纤维在体内充分的光氧化治疗效果，迈向临床应用。
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