最近发表在《自然》杂志上的一项研究表明，研究人员揭示了骨髓（BM）微环境中干细胞层次结构，这些结构控制着再生、免疫特权和治疗潜力。
背景
骨髓干细胞位于微环境（niche）中，这些微环境是特化的微生态系统，干细胞在这里与各种细胞和分子成分相互作用以调节其功能。已经确定了几种类型的骨髓微环境，包括内皮和窦状区域，但它们在干细胞层次结构和免疫耐受中的具体作用仍然存在争议。近期研究表明，这些微环境可以强制执行造血干细胞（HSCs）之间的层次结构，影响其再生能力和免疫特性。观察到睾丸和胎盘等组织中的免疫特权现象，提示了干细胞保护的潜在机制。研究还强调了特定微环境中调节性T（Treg）细胞和免疫抑制分子作为这种免疫耐受的关键贡献者。进一步的研究对于解决这些不确定性并探索治疗意义至关重要。
研究详情
研究发现，高一氧化氮（NOhi）HSCs表现出独特的“睡美人”样重建模式，即最初处于休眠状态，但在后期阶段特别是连续移植后重新激活，展现出强大的再生潜力。研究人员使用了多种转基因小鼠模型来研究骨髓HSCs及其微环境，包括C57BL/6J、BALB/cJ和B10.A小鼠，以及特定转基因品系如瘦素受体-cre重组酶（Lepr-cre）、神经胶质抗原2-cre雌激素受体（Ng2-creERTM）和磷酸二酯酶4D相互作用蛋白-cre雌激素受体（Pdzk1ip1-creER）。所有小鼠均在特定病原体自由条件下饲养，实验在6-12周龄的小鼠上进行。他莫昔芬处理用于特定模型中的条件删除，精确的协议确保了高效的基因操作。流式细胞术用于评估HSCs中的一氧化氮（NO）水平。通过压碎胫骨和股骨提取骨髓细胞，并用红细胞裂解缓冲液处理，然后用荧光标记的抗体染色，针对标志物如CD200受体（CD200R）、干细胞抗原1（SCA1）和信号淋巴细胞活化分子家族成员1（CD150）。使用4-氨基-5-甲基氨基-2′,7′-二氟荧光素（DAF-FM）等特异性染料检测NO水平，其他染料评估线粒体活性和自噬。对于细胞内分析，固定后的骨髓细胞被透化并用针对内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和微管相关蛋白1A/1B轻链3β（LC3B）的抗体染色。骨髓间充质细胞也通过标记如CD200和血管内皮生长因子受体（VEGFR）进行了类似分析。样品通过高级流式细胞术系统处理，并使用FlowJo软件分析。移植试验研究了高NO（NOhi）和低NO（NOlow）HSCs的再生潜力。根据NO水平分选的HSCs与竞争骨髓细胞一起注射到辐照小鼠体内。这些实验揭示了NOhi HSCs特有的“睡美人”样重建模式，即初期休眠，随后在晚期阶段强力再生。连续移植研究评估了长期植入和层次属性。未处理的受体还接受了1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiD）标记的HSCs以评估归巢和存活。共焦显微镜提供了骨髓血管和细胞定位的三维成像。成像证实NOhi HSCs优先与富含于干骺端的CD200hi毛细血管相互作用，这一特征使这些微环境与其他如type-H血管和窦状结构区分开来。标志物如CD200用于识别毛细血管，而HSCs则通过特定荧光报告器可视化。统计分析确认了实验结果的可重复性和显著性。
研究结果
研究发现，条件删除CD200或IFT20破坏了微环境完整性，减少了NOhi HSC的数量、eNOS水平和自噬活性，为增强基于干细胞的疗法提供了新靶点。在本研究中，NO表达成为区分高效、后期上升的HSCs与其较弱、易耗竭的同类的关键特征。约占骨髓HSCs 10-15%的NOhi HSCs显示出优越的再生潜力和免疫特权。这些NOhi HSCs表现出高自噬活性、低线粒体超氧水平和增强的抗氧化性能，确保其长期活力和功能。它们高度静止，表达免疫调节分子如CD200R，并在时间上表现出强劲的重建能力，特别是在连续移植后。NOhi HSCs主要定位于与纤毛、CD200hi毛细血管相关的特殊骨髓微环境中。这些血管结构富含于干骺端，以高水平的免疫检查点分子CD200和其他血管生成调节因子为特征。高级成像显示，NOhi HSCs优先与这些毛细血管相互作用，而较弱的NOlow HSCs则靠近type-H血管和窦状结构。功能研究表明，CD200hi毛细血管通过涉及CD200、eNOS和自噬的信号轴调节NOhi HSC数量和功能。条件删除内皮细胞中的CD200或纤毛相关蛋白IFT20损害了NOhi HSC的维持，降低了eNOS水平，并减弱了自噬活性。这导致了骨髓细胞数目的显著下降、再生能力和免疫耐受性的降低，突显了这些微环境的关键作用。进一步分析表明，NOhi HSCs维持高水平的基础和诱导自噬活动，支持其静止和再生功能。NOhi HSCs中的eNOS消耗破坏了这些自噬过程，降低了线粒体超氧水平，并消除了其后期上升的重建能力。这突显了CD200R-eNOS-自噬轴在调节NOhi HSC功能中的作用。移植实验显示，NOhi HSCs在同种异体环境中更具弹性，受益于其与免疫保护微环境的关联。CD200hi毛细血管维持活化的调节性T细胞池，并表达高水平的免疫检查点分子，有助于NOhi HSCs的免疫特权。这一发现强调了血管微环境在再生和免疫调节中的重要性。删除血管中的CD200或IFT20损害了免疫保护，降低了NOhi HSCs在同种异体受体中的植入率。
总体而言，这些发现确定了NOhi HSCs为由独特血管微环境调控的高度免疫特权的原始干细胞。CD200hi毛细血管、eNOS信号和自噬之间的相互作用建立了骨髓内的层次结构，突显了提升基于干细胞的再生医学和移植结果的新治疗靶点。
结论
这项研究表明，NOhi HSCs代表了一种由骨髓微环境中富含CD200的毛细血管调控的高度有效、免疫特权的亚群。这些毛细血管，集中在干骺端，通过CD200、eNOS和自噬信号协调干细胞层次结构。NOhi HSCs表现出后期上升的再生潜力和在同种异体环境中的韧性，突显了其临床相关性。研究还揭示了NOhi HSCs的“睡美人”样再生模式，强调了它们在休眠后重新激活的能力。研究结果突显了血管微环境在维持干细胞稳态和免疫耐受中的关键作用，为通过靶向这些特化微环境提升移植结果和再生医学提供了新的治疗策略。
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