摘要
衰老的内皮细胞（ECs）具有血管生成和再生潜能降低的特征，是心血管疾病病理生理学中的关键因素。因此，靶向这些细胞被认为是提高健康的有效治疗策略。本文首次报道了山中因子（Yamanaka factors）的非遗传过表达可诱导内皮细胞的部分功能恢复和衰老相关特征的减弱。表征短暂重编程效应的方法包括基因表达定量以及体外细胞功能测量。此外，还在后肢缺血模型中进行了体内实验。将药物组合应用于复制性衰老的内皮细胞后，导致Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc出现了显著但时间受限的激活（p < 0.0和p < 0.01）。这伴随着p16ink4a和p14arf等衰老标志物的显著减少（p < 0.01）。此外，基于qPCR的端粒长度测量结果得到稳定，衰老内皮细胞的功能特性（如增殖、迁移、出芽和管状形成）得到改善（p < 0.05）。长期培养经处理的细胞表明，p16ink4a和p14arf的表达保持显著降低，同时细胞迁移能力保持增强。在体内实验中，21月龄C57BL/6小鼠后肢缺血后第7天和第14天观察到显著改善的血流（p < 0.001）。总之，我们揭示了通过山中因子的短期药理学过表达可以诱导内皮细胞衰老相关特征的部分减弱。虽然所用化合物各自已获FDA批准用于其他适应症，但它们在这种背景下的组合应用突显了概念性转化潜力，而该方法的临床适用性仍有待评估。
引言
心血管疾病（CVD），如冠心病和心力衰竭，以血管功能障碍为特征，是全球死亡的主要原因[20,60]。这种血管功能障碍在临床上表现为大动脉尺寸和硬度增加、血压升高或血管密度降低[20]。除高血压、血脂异常和慢性损伤等其他心血管疾病风险因素外，年龄是最重要且独立的风险因素[16,46]。尽管在心血管疾病的治疗方面已取得实质性进展，但死亡率仍保持在高水平，这意味着对治疗干预的临床需求仍然存在。此外，随着预期寿命的增加，心血管疾病的高发病率仍然显著[16]。除微血管灌注受损、炎症和氧化应激外，血管功能障碍的主要原因是内皮功能障碍的发展，导致再生和血管生成能力丧失[9,20,22,31,49,58]。与此概念一致，内皮细胞特异性调控机制已被证明对血管生成功能和血管适应起关键作用。基于此背景，旨在恢复内皮功能和血管生成能力的策略特别值得关注，尤其是在与年龄相关的血管变化背景下[8,31]。
这些与年龄相关变化的因果解释是在健康动脉组织中生命周期内衰老细胞的累积[36,39]，以及在缺血性心脏病的动脉粥样硬化斑块[38]和心力衰竭[24]中。通常，细胞衰老被描述为细胞老化，逐渐导致G0/G1期永久性细胞周期停滞[13,17,19]，通常由p53或p16/pRB通路启动[12,21]。迄今为止，靶向选项包括衰老细胞清除治疗[4]、增强免疫反应[28,33]、提高复制潜能[2,10]和通过病毒载体进行细胞重编程[41]。近期研究表明，OCT3/4、SOX2、KLF4和cMYC（OSKM）的病毒过表达也可以逆转与年龄相关的表型，但这种方法也存在基因组不稳定的风崄[35]。有趣的是，在不同非衰老细胞类型中的研究表明，细胞重编程也可以通过化学化合物混合物实现和支持，具有在时间和浓度依赖性下更安全应用的优势[61]。
在本研究中，我们首次证明由FDA批准用于其他适应症的化合物组成的药物组合可以诱导山中因子（OSKM）的时间受限过表达，从而导致衰老内皮细胞的部分功能恢复以及体外和体内内皮功能和血管生成能力的改善。这三种物质包括丙戊酸（一种脂肪酸衍生物和组蛋白脱乙酰酶-1抑制剂）[3,32,45]、碳酸锂（主要以糖原合酶激酶3为靶点）[14,47,50]和galunisertib（一种酪氨酸激酶转化生长因子-β受体1型的抗肿瘤拮抗剂）[25]。
材料与方法
细胞培养
所有体外实验均在购自Lonza的人脐静脉内皮细胞上进行。细胞在内皮细胞生长培养基（ECGM 2，PromoCell）中培养，温度为37°C，5% CO₂，湿度控制的培养箱中，生长至汇合后以1:3的比例传代。传代<5的细胞被视为非衰老细胞，而传代>14的细胞被视为复制性衰老细胞。细胞在实验前根据先前描述的方法进行复制性衰老特征表征[27]。
细胞损伤诱导与药理学重编程
通过用50 μM过氧化氢处理24小时诱导细胞损伤。对于药理学重编程，细胞用0.3 mM Li₂CO₃（Sigma）、0.5 mM丙戊酸（Sigma）和1 μM galunisertib（Selleckchem）处理。处理持续72小时，然后更换培养基，并进行连续分析。对于长期检测，细胞在初始处理后进一步培养28天，频繁更换培养基但不更新药理学处理。
siRNA转染
使用RNAiMax（Thermo Fisher Scientific）和Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific）根据制造商协议进行siRNA转染。简而言之，siRNA和随机对照（见补充表S1）与Lipofectamine RNAiMax混合并在Opti-MEM培养基中短暂孵育。将细胞接种在无抗生素培养基中并用脂质体复合物处理。siRNA的最终浓度为20 nM。通过qRT-PCR验证siRNA敲低效率。
RNA提取、逆转录和qRT-PCR
使用Plus RNeasy Mini Kit（Qiagen）根据制造商协议提取总RNA。简而言之，细胞用PBS（3次）洗涤、裂解，去除基因组DNA，然后通过基于柱的分离法洗脱RNA。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将RNA转录为cDNA，并使用Blue S'Green qPCR试剂盒（Biozym）进行qRT-PCR分析。两种试剂盒均根据制造商说明使用，输入100 ng总RNA。所用引物列表见补充表S2。
蛋白质提取和Western blot分析
在冰上使用含10%蛋白酶抑制剂混合物和1% PMSF的RIPA缓冲液提取蛋白质（20分钟），然后离心。通过Bradford测定法确定蛋白质浓度。对于凝胶电泳，将30 ng蛋白质加载到预制梯度凝胶（Biorad）上。使用槽式印迹系统将蛋白质转移到PVDF膜上。所用抗体列表见补充表S3。
DNA提取和端粒长度测定
根据制造商的说明使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）提取基因组DNA，该试剂盒采用基于柱的分离技术，包括用Proteinase K和RNase A处理。通过相对人类端粒长度定量测定（ScienCell Research Laboratories）基于qRT-PCR分析确定端粒长度。
体外细胞的免疫荧光染色
对于细胞的免疫荧光染色，将细胞接种在8孔腔室载玻片上。附着后，细胞固定30分钟，阻断，然后与一抗在4°C下过夜孵育。第2天，洗涤载玻片并与二抗孵育2小时。经过额外的洗涤步骤后，用含DAPI的封固剂封固载玻片，并用盖玻片覆盖。所用抗体列表见补充表S3。
从小鼠样本中分离内皮细胞
通过CD146⁺磁珠从鼠样本中分离内皮富集细胞分数。将组织切碎，用Multi Tissue Dissociation Kit和gentleMACS Dissociator进行酶消化和匀浆，按照制造商指南操作。将组织碎片置于C管中的酶混合物中，并在37°C下匀浆1小时。所得细胞悬浮液通过70 μm过滤器过滤，并使用Debris Removal Kit去除碎片。将细胞悬浮液与冷PBS混合，与碎屑去除溶液分层，轻轻混合，然后覆盖PBS。以3000xg离心10分钟，去除顶部两相，底部相用PBS洗涤。使用红细胞裂解试剂盒裂解红细胞；将细胞沉淀与裂解溶液孵育2分钟，短暂离心，并用酶混合物终止反应。最后，将细胞与CD146磁珠孵育15分钟，使用MS柱和MACS分离器分离，并从柱中洗脱。将细胞悬浮液离心，沉淀用Trizol重悬用于总RNA提取。
增殖、迁移和线粒体超氧化物测定
通过活细胞成像方法使用细胞计数评估增殖。将细胞接种至亚汇合状态，使用活细胞成像系统每30分钟拍摄一次图像，持续24小时。在每个明场图像中计数细胞数量。此外，通过BrdU掺入实验（Roche）量化增殖。将细胞以亚汇合状态接种在96孔板中的生长培养基中。细胞附着后，将培养基更换为基础培养基。第二天，用10 μM BrdU标记溶液标记细胞并孵育24小时。吸出培养基，固定细胞并与BrdU工作溶液孵育90分钟。经过几次洗涤步骤后，向孔中加入底物溶液，并在室温下孵育直至蓝色显色充分用于光度检测。用停止溶液终止反应，并在450 nm处测量吸光度。
通过划痕伤口实验测定迁移能力。将细胞接种至汇合状态，用移液器尖端制造划痕伤口。使用活细胞成像系统每30分钟拍摄一次图像，持续24小时。为每张图像确定划痕面积和细胞面积。
使用MitoSOX Red荧光染料（Thermo Fisher Scientific）确定线粒体超氧化物的量。将细胞以亚汇合状态接种，并根据制造商说明用MitoSOX Red荧光染料处理。为验证线粒体超氧化物特异性，用鱼藤酮（1 μM，30分钟）或MitoTEMPO（10 μM，60分钟）作为MitoSOX荧光的阳性和阴性对照（补充图1）。拍摄明场和红色荧光图像，并计算红色荧光细胞与明场通道中细胞的比例。
所有实验均使用Cytation 1（Biotek）活细胞成像系统进行，图像分析使用Gen 5（Biotek）软件进行。
体外血管生成实验
对于出芽实验，将细胞以4*10⁵ cells/ml的密度接种到80%生长培养基和20%甲基纤维素中，形成悬滴，24小时以允许球体形成。第2天，预先制备底部基质（50% 2 mg/ml胶原蛋白、10% M195培养基和40%甲基纤维素储备溶液），并在37°C下聚合1小时。对于顶部基质，收集球体，离心并重悬在FCS中，进一步与40%甲基纤维素和50%胶原蛋白混合。聚合2小时后，用培养基覆盖基质。通过显微镜监测出芽形成。
管状形成实验使用"In vitro Angiogenesis Assay Kit"（Cultrex）根据制造商协议进行。简而言之，用基底膜包被板，然后进行聚合步骤。将最多10,000个细胞接种到板的一个孔中，将板进一步孵育在Cytation 1活细胞成像系统中以观察管状网络的形成。每小时拍摄一次图像，持续18小时。使用最终图像评估管状网络。使用G. Carpentier、M. Martinelli、J. Courty和I. Cascone（2012）开发的ImageJ血管生成分析器进行管状网络分析，该分析器可在
动物实验
所有动物实验均获得当地当局批准（Landesverwaltungsamt Sachsen-Anhalt MLU 42502-2-1623）。它们按照实验室动物科学协会联合会指南进行，并符合欧洲议会2010/63/EU指令。
所有体内实验均在不同年龄的Janvier成年C57BL/6小鼠上进行。
小鼠后肢缺血模型
为评估药理学重编程鸡尾酒对血管生成的效率，在两组不同年龄的C57BL/6 J小鼠（3个月或21个月）中进行了股动脉远端深支后的手术结扎，导致腓肠肌缺血。小鼠通过吸入异氟烷（Forane，吸入麻醉，0.25-2.0 vol%与O₂流速0.2 l/min）进行麻醉。股动脉在A. profunda femoris深支远端直接结扎，导致腓肠肌缺血。在干预后直接以及第1、3、5、7和14天对结扎和未结扎肢体进行激光多普勒成像。此外，小鼠在手术干预后立即以及在第1天和第3天接受药理学重编程鸡尾酒注射。小鼠通过腹腔注射给予100 mg/kg VPA、60 mg/kg Li₂CO₃和30 mg/kg galunisertib。第14天，根据AVMA动物安乐死指南，通过颈椎脱位/吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死。切断下腔静脉后，通过左心室用PBS灌注小鼠。收集器官以及腓肠肌和半膜肌用于组织切片或RNA分析。
腓肠肌的免疫荧光染色以测定毛细血管密度
在6 μm深度的组织切片上进行免疫荧光染色。载玻片固定30分钟，阻断，并与CD31一抗（Cell Signaling, 3528S, 1:100）在4°C下过夜孵育。第2天，洗涤载玻片并与二抗孵育2小时（Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 488, 1:200）。经过额外的洗涤步骤后，用含DAPI的封固剂封固载玻片，并用盖玻片覆盖。通过计算CD31阳性细胞相对于总DAPI计数的比例来评估毛细血管密度。
统计分析
使用GraphPad Prism 8分析数据集。所有数据表示为平均值±标准差。除非另有说明，n指来自独立实验的生物学重复数。在每个生物学重复中，根据需要进行多次技术测量并取平均值进行统计分析。所有数据集均相对于各自的对照组进行归一化，并测试方差。使用非配对Student's t检验和单因素方差分析评估统计显著性，如图中所示。统计显著性使用对应于定义的p值阈值的星号在图中显示。
结果
细胞损伤仅在非衰老内皮细胞中诱导再生基因
此处描述的重编程策略基于衰老细胞无法自我再生的理论。所谓的山中因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC（OSKM）是这种再生过程的主要因子。为了观察ECs特别是衰老ECs是否在细胞损伤后具有再生能力，我们首先在使用过氧化氢模拟病理生理情况的细胞损伤模型中研究了ECs中的OSKM因子表达。如预期，我们观察到非衰老ECs对OCT3/4、SOX2、c-MYC和KLF4的显著上调做出反应。相比之下，复制性衰老细胞在OSKM表达上没有变化（图1a和b）。总之，我们可以证明非衰老细胞在细胞损伤后启动重编程过程，而衰老细胞则不显示OSKM表达。现在，治疗策略可能会干预衰老细胞中的这一点，并支持在非衰老细胞中可观察到的生理冲动。
建立药理学重编程策略以诱导细胞再生
复制性衰老细胞重编程策略的一个要求是山中因子的过表达可以在时间受限的基础上应用，不会带来基因组整合或畸胎瘤形成的风险。几种能够促进OSKM相关细胞重编程的小分子化合物已被批准用于其他临床适应症，并对其药代动力学、药效学和耐受性进行了充分表征。从这些化合物中，测试了由三种化学物质组成的药理学鸡尾酒——丙戊酸（VPA）、碳酸锂（Li₂CO₃）和galunisertib（Gal）——以评估其在诱导复制性衰老内皮细胞中OSKM表达的效率。我们证明，对衰老ECs进行72小时应用后，导致OCT3/4、SOX2、KLF-4和c-MYC在mRNA和蛋白水平上的稳健表达（图1c和d）。随后去除鸡尾酒导致OSKM表达随时间下降。当在去除药理学化合物后，c-MYC的表达立即下降，而OCT3/4和SOX2的表达在处理后第10天降至基线水平（图1e-h）。有趣的是，KLF-4在去除药理学鸡尾酒后最初下调，但在第10天达到与未处理细胞相当的表达水平。基于这些结果，所有后续评估细胞功能改善的实验均在处理后第10天进行。总之，我们因此证明了一次初始处理足以在复制诱导的衰老ECs中诱导OSKM的过表达，但一旦鸡尾酒被移除，表达水平以特定因子的速率下降，并且最迟在第10天达到生理水平。细胞形态观察显示处理对细胞没有影响（补充图2a）。CD31内皮细胞标志物的染色证实，在应用药理学重编程鸡尾酒期间，细胞不会失去其内皮细胞特性（补充图2b和c）。此外，核大小的量化显示无差异（补充图2d）。
药理学重编程鸡尾酒改善体外衰老ECs的增殖，影响细胞周期停滞机制并稳定端粒长度
接下来，我们测试了上述协议对体外衰老ECs增殖和细胞周期停滞机制的实际重编程效果。所有检测均在药理处理的复制性衰老细胞与未处理的衰老细胞和非衰老对照之间进行比较。增殖通过两种技术进行测量：BrdU掺入和活细胞计数成像方法。如预期，这两种技术都证实了复制性衰老细胞与非衰老细胞相比增殖显著受损（图2a和b）。然而，应用鸡尾酒改善了衰老处理细胞的增殖，通过活细胞计数检测量化。BrdU检测也观察到类似趋势，但不显著。有趣的是，细胞在一次性处理并长期培养28天后仍具有更好的增殖效果（补充图3a）。与增殖效应一致，作为细胞周期停滞标志物的p16INK4A和p14ARF在鸡尾酒处理的衰老细胞中与未处理相比显著降低（图2c和d）。p14ARF的表达甚至降低到与在非衰老细胞中观察到的水平相当。长期培养后，这两个标志物的表达仍然较低（补充图2b）。此外，qPCR分析显示鸡尾酒与未处理细胞相比与端粒长度的相对稳定相关（图2e）。值得注意的是，在处理后，非衰老和衰老细胞之间的端粒长度没有差异。
炎症和DNA损伤通过药理学重编程方法在体外得到改善
DNA损伤反应的激活和DNA双链断裂的发生在衰老细胞中经常被描述。通过染色检测γH2A.x（一种在DNA双链断裂时磷酸化的组蛋白，用于启动DNA修复系统的各种过程）来评估衰老鸡尾酒处理细胞与未处理衰老细胞相比DNA损伤减少。这表明DNA修复机制在衰老ECs中由鸡尾酒启动（图3a）。作为炎症过程一部分的细胞因子和生长因子释放在细胞衰老中起重要作用，这种现象称为衰老相关分泌表型（SASP）。此处测量的SASP成分包括CD44、TNF-α、IL-6和IL1-β标志物。对于所有四个标志物，处理细胞中的mRNA表达水平均降低，在处理的衰老细胞和非衰老细胞之间未观察到升高（图3b-e）。这些过程的分子调节因子是HMGB-1。它从复制性衰老细胞的胞质中释放，与细胞外受体结合，并启动包括IL-6等细胞因子的调节。HMGB-1的释放已成功检测到；然而，在衰老处理细胞中未能完全恢复（图3f）。可能的解释可能是鸡尾酒应用后的时间不足以恢复HMGB-1水平。
药理学重编程改善体外衰老内皮细胞的关键功能特性
除了通常在衰老细胞中失调的标准通路外，还分析了内皮细胞的重要功能特性。首先，通过划痕伤口实验测量内皮细胞迁移（图4a）。伤口愈合在处理的衰老细胞中比在未处理的衰老细胞中更快。迁移能力还在28天后再次评估，仍然显示处理细胞的迁移能力改善（补充图3c）。为了确定氧化应激水平，用线粒体产生的超氧化物对细胞进行染色。处理的衰老细胞中的线粒体超氧化物水平与非衰老细胞相似，而在未处理的衰老细胞中升高（图4b）。为了研究细胞的血管生成行为，测试了细胞形成出芽和管状网络的能力。这两个实验都显示接受药理学重编程鸡尾酒的衰老细胞中血管生成行为得到改善（图4c和d）。
为进一步验证衰老表型的减弱直接依赖于OSKM过表达并需要所有四个因子，通过siRNA沉默OSKM。siRNA转染的OSKM下调效率很高（图5a）。与药理学处理平行进行的OSKM的siRNA介导敲低将OSKM水平恢复到与对照细胞相当的水平（图5b），表明处理和siRNA在OSKM表达方面具有相反作用。通过迁移能力分析细胞功能显示OSKM沉默处理细胞中无改善（图5c）。
药理学重编程方法不对非衰老细胞产生不利影响
一般来说，积累在血管中的衰老ECs与非衰老ECs相邻。针对衰老细胞的干预的一个重要标准是该干预不会损害或对非衰老细胞产生负面影响。为了测试这一点，根据相同协议用相同的药理学鸡尾酒处理非衰老细胞。观察表明，在非衰老环境中，只有两个OSKM因子由鸡尾酒诱导，即OCT3/4和SOX2（图6a）。KLF-4和c-MYC完全没有调节。为了测试功能损害，进行了活细胞计数增殖实验和划痕伤口实验（图6b和c）。这些检测在各组之间均未显示任何差异。还筛选了细胞周期调节因子p16INK4A以及SASP成分CD44、TNF-α、IL-6和IL1-β的表达（图6d）。未观察到这些因子的调节；只有IL1-β表达在处理细胞中略有增加。
为评估重编程鸡尾酒对非内皮血管细胞类型的影响，在复制性衰老的血管平滑肌细胞中进行了补充体外实验，这是血管生成和血管重塑过程中与内皮细胞密切相互作用的关键邻近细胞群体。与内皮细胞不同，平滑肌细胞对药理学鸡尾酒未表现出可比较的分子或功能反应（补充图4）。
小鼠后肢缺血模型中药理学重编程增强体内血管生成能力
后肢缺血模型是研究血管再生的成熟小鼠模型。通过永久性结扎股动脉在深支起源远端，该模型提供了研究股动脉侧支中的动脉生成以及远端肌肉中血管生成的机会。结扎导致远端肌肉（腓肠肌）缺血，从而触发血管生成反应。实验在年轻（12周）和老年动物（21个月）中进行，药理学鸡尾酒在手术干预后立即、第1天和第3天腹腔注射。激光多普勒成像显示鸡尾酒对年轻动物的血流没有影响。然而，在接受治疗的老年动物中血流显著改善（图7a和b）。在老年动物中，通过CD31染色测量的毛细血管密度支持治疗后血流改善（图7c和d）。对照组和治疗组之间的血液参数分析、体重测量或结扎脚的坏死评分均未显示任何差异（补充图5a至c）。额外分析研究了手术干预后第4天内皮细胞（CD146⁺细胞）中的OSKM表达。尽管Oct3/4和SOX2在处理动物中仍然上调，但KLF-4和cMYC表达降至生理水平，从而显示与体外相同的效果（补充图6 A和B）。相比之下，在非内皮细胞分数（CD146⁻细胞）中未检测到相应的调节。
讨论
尽管心血管疾病治疗已取得实质性进展，心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因。CVD的特征是内皮功能障碍，部分原因是衰老内皮细胞的存在。除其他方面外，这些细胞进一步限制了血管的再生潜力和血管生成能力。为了克服这一障碍，我们在此建立了一种基于山中因子OSKM时间受限过表达的药理学部分重编程策略，以使衰老EC恢复活力并改善血管损伤后的组织功能和血管化。
我们证明，响应鸡尾酒应用的OSKM过表达可以在时间依赖性方式下控制，与体外未处理EC相比，导致衰老处理EC在短期和长期内的功能改善。部分地，这种效果甚至超过了可比较的非衰老内皮细胞的功能。此外，我们在后肢缺血后体内证明了对血流和毛细血管密度的积极影响。
衰老的有机体的特征是再生和血管生成潜力的丧失[9,22,49,58]。相反，保持再生潜力的动物不显示任何衰老迹象[59]。所谓的重编程基因，包括OCT3/4、c-MYC、KLF-4和SOX2，在细胞再生中起主要作用[6,55]，帮助细胞在组织损伤后进入类似重编程状态[26]。我们通过利用一种与CVD相关的损伤模型（即氧化应激损伤，模拟细胞应激并影响血管反应性）展示了复制性衰老内皮细胞对细胞损伤的再生启动缺乏[11]。
然后，我们表明通过用短暂的人工刺激启动在非衰老细胞中可观察到的生理重编程，衰老细胞也将开始部分重编程过程以恢复细胞功能。到目前为止，大多数使用细胞重编程的方法通过病毒转染实现OSKM的过表达，以产生诱导多能干细胞（iPSC），导致细胞命运转变并可能促进基因组不稳定性和畸胎瘤形成[35,53,62]。而体内病毒诱导的OSKM长期诱导导致畸胎瘤形成和DNA甲基化模式改变[1,44]，循环诱导OSKM可以延长寿命并改善再生和衰老迹象，同时降低畸胎瘤形成风险[42]。基于这些考虑，我们决定使用更容易处理的小药理分子来诱导部分重编程，无需进入多能性，从而保留内皮特性和功能。尽管本研究中使用的化合物在各自浓度下均获FDA批准，但它们的组合使用、给药方案和治疗背景未经批准，因此不意味着直接临床适用性。
药理学鸡尾酒由三种化合物组成：丙戊酸、碳酸锂和Galunisertib。这三种化合物不仅已知支持细胞重编程[54,57,65]，而且还显示出通过与衰老相关通路相互作用在细胞衰老过程中具有潜在作用[23,51,56]。丙戊酸作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂，支持神经干细胞和祖细胞的发育[15,61]。碳酸锂增强iPSC生成[7,43,57]并阻断GSK-3/p53复合物的形成，抑制衰老积累[51,66]。Galunisertib作为转化生长因子-β（TGF-β）抑制剂，可以维持多能性[64]，而TGF-β的激活会阻断重编程[34]。所有三种化合物的组合已被证明促进细胞重编程并改善体内肝脏再生和肝功能[55]。
在我们的研究中，我们证明了通过小药理化合物组合有效过表达OSKM是可能的，并且这种调节以时间和浓度依赖性方式发生，从而降低了畸胎瘤形成和基因组不稳定性的风险，如病毒过表达所观察到的。这些风险进一步降低，因为重编程过程只是部分的，因为细胞保持其内皮细胞特性。然而，这种短期过表达足以改善观察到的细胞功能以及衰老标志物的基因表达。通过与药理学重编程平行进行的OSKM沉默，证明了所有四个因子对充分重编程的重要性。在这里，我们可以证明细胞周期基因p16INK4A和p14ARF的表达可以通过药理学鸡尾酒降低。在iPSC研究中当重编程衰老成纤维细胞时也获得了可比结果[29,37]，以及在允许通过doxycycline诱导OSKM表达进行部分重编程的体外模型中[42]。与iPSC重编程方法相比，药理学治疗减弱了我们衰老ECs中的DNA损伤相关标志物，在iPSC重编程方法中已报道DNA损伤和线粒体DNA突变积累持续存在[35]。通过qPCR评估的端粒长度在药理学鸡尾酒作用下得到稳定。在iPSC生成的背景下也报告了类似的改变，其中端粒维持或延长可能发生[29,37]。然而，由于qPCR方法提供端粒长度的相对而非绝对测量，这些发现应谨慎解释。这些变化是否涉及端粒酶活性或其他端粒维持机制的改变需要进一步调查。SASP是成功细胞重编程的重要特征[40,48]。观察到几种SASP成分的有效减弱，与先前基于重编程的方法对IL-6的报告一致[42]。相比之下，HMGB-1定位未通过药理学鸡尾酒恢复，表明并非所有衰老相关特征都完全正常化。可能的解释是处理和HMGB-1水平评估之间的时间不足以恢复细胞内HMGB-1水平。线粒体功能通过部分重编程得到部分改善，与在iPSC重编程中描述的增强线粒体功能报告相当[37,52]。尽管使用基于定性荧光的方法评估线粒体超氧化物，但内皮线粒体ROS的调节已被证明在缺血应激下临界影响内皮弹性和血管功能[5,30]。
此外，在体内展示了血管生成和再生能力的恢复。在小鼠后肢缺血模型中，血管生成和早期动脉生成重塑主要发生在缺血诱导后的前2周，而后期时间点主要反映血管成熟和稳定而不是动态内皮可塑性。与此一致，纵向灌注研究表明灌注恢复主要在早期缺血后阶段增加，随后接近平台期[5,30]。在接受药理学鸡尾酒治疗的老年小鼠中观察到的改善血流和毛细血管密度支持了体外观察结果。然而，内皮细胞构成功能异质性群体，可能促成了观察到的OSKM反应的部分性和标志物特异性[51]。无论年龄如何，在肝脏损伤后应用该鸡尾酒[55]以及在LAKI 4F小鼠中通过doxycycline给药进行OSKM的部分诱导中观察到了可比结果，其中通过β-半乳糖苷酶染色证明了衰老相关特征的减弱[42]。此外，我们的发现与先前工作一致，该工作表明部分重编程策略可以增强内皮血管生成能力。特别是，Yin等人证明了内皮细胞的部分OSKM介导重编程促进冠状循环中的血管生成，使诱导血管祖细胞具有增强的血管可塑性[63]。虽然这项研究集中在不同的血管床并采用了旨在促进冠状侧支生长的细胞重编程策略，但它支持部分重编程可以调节内皮功能和血管生成反应的更广泛概念。我们的数据扩展了这些观察结果，以包括年龄相关的内皮功能障碍和外周缺血中的血管生成受损，证明短暂的药理学诱导部分重编程足以改善体内的血管生成结果。
在本研究中，我们观察到在体外对药理学鸡尾酒进行单次短暂暴露后持续的功能改善，没有在延长培养中检测到不良影响的证据。值得注意的是，该治疗不影响非衰老内皮细胞，表明一定程度的背景依赖性，并反驳了普遍激活或不受控制的细胞反应。鉴于缺乏针对衰老内皮细胞的重编程方法的有限数据，我们的发现主要与源自（衰老）细胞的iPSC重编程策略进行比较讨论。除了细胞自主效应外，重复或全身暴露于重编程诱导化合物还提出了额外的安全考虑。部分重编程方法与潜在风险相关，如异常细胞周期再进入、表观遗传不稳定性或对非靶向细胞群体的意外影响，取决于剂量、持续时间和组织背景。在本研究中，全身暴露是短暂的，体内未检测到明显的不良影响。虽然重编程鸡尾酒是全身给药的，但在体内观察到的内皮细胞优先反应以及体外平滑肌细胞中缺乏可比较效应支持血管生成效应主要由内皮贡献。然而，改善的内皮功能可能通过旁分泌相互作用间接影响缺血后组织重塑，与内皮细胞和周细胞在调节血管稳定性和灌注方面的功能相互作用的新兴证据一致[18]。
通过我们的研究，我们证明了内皮细胞衰老和细胞重编程可以联系起来。因此，山中因子OSKM的短期过表达已经足以部分恢复内皮细胞功能并在体外和体内减弱多种衰老相关细胞特征。OSKM的部分和时间受限过表达支持部分重编程策略，其中细胞维持其内皮细胞特性，这进一步降低了畸胎瘤形成和基因组不稳定性的风险。总之，通过小分子的部分重编程策略靶向衰老内皮细胞可能为CVD中内皮功能障碍的治疗提供一种有前途的策略。虽然使用各自已获批准用于其他适应症的化合物突显了理论上的转化潜力，但需要进一步的临床前和临床研究来评估安全性、有效性和监管可行性，然后才能考虑临床应用。
【全文结束】