雄激素受体活性前列腺癌向神经内分泌前列腺癌的明确定义细胞重编程 - 健康研究

摘要

神经内分泌前列腺癌（NEPC）主要通过神经内分泌转分化（NEtD）作为治疗耐药的适应性机制。目前缺乏明确研究雄激素受体（AR）信号与神经内分泌谱系程序相互作用的模型。我们采用细胞重编程策略，通过候选因子将AR活性前列腺癌（ARPC）直接转化为AR非依赖性NEPC。我们阐明了先锋因子ASCL1和NeuroD1在NEtD中的核心作用，发现其可通过重塑体细胞获得的AR增强子及全局AR结合位点的染色质结构来沉默AR表达和信号传导。我们还解析了ARPC向NEPC急性谱系转化过程中转录组和表观组的动态变化，揭示了ASCL1和NeuroD1与REST失活在NEPC谱系建立及MHC I抗原呈递基因调控中的差异功能。这些发现为前列腺癌神经内分泌转分化的生物学过程提供了重要的临床相关见解。

引言

前列腺癌是一种由雄激素受体（AR）信号驱动的疾病。雄激素剥夺治疗（ADT）和AR信号抑制剂（ARSIs）是晚期前列腺癌的标准疗法。尽管初始治疗有效，但最终会发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），其耐药机制包括AR基因突变、扩增、选择性剪接及增强子重复等异常再激活。此外，谱系可塑性作为更极端的适应机制，在前列腺癌和其他上皮性恶性肿瘤中普遍存在。其中AR活性前列腺癌（ARPC）向神经内分泌前列腺癌（NEPC）的转分化尤为典型，其特征是AR程序被神经内分泌程序取代，导致AR非依赖性耐药。

多项研究发现NEtD与MYCN扩增、REST失活、PTEN、TP53和RB1丢失相关。尽管已有基于人前列腺上皮转化模型的研究，但现有模型始于AR缺失的基底细胞，无法阐明AR调控的谱系承诺如何被抑制。目前最常用的研究模型是LTL-331 ARPC患者源性异种移植（PDX）模型，其在去势小鼠中传代后可转变为LTL-331R NEPC模型。虽然反复活检提供了NEtD相关分子程序的见解，但该模型的实验操作性较差。

另一个挑战在于NEPC定义的不一致性。临床诊断依赖于组织学形态和NE标志物（如CHGA、SYP、CD56）表达。实验研究中广泛使用的NE标志物表达和类神经突起形成等表型可能无法准确反映与ARPC分化的癌谱系状态。例如双表型前列腺癌（AMPC）同时表达AR和NE标志物，但对恩杂鲁胺敏感，表明其仍依赖AR驱动程序。

我们建立了可在指定时间过程中可重复、稳定将ARPC细胞系转化为NEPC的体外系统。该系统重现了NEtD的关键特征，包括全局性转录和表观遗传重编程。我们发现神经先锋转录因子ASCL1和NeuroD1能够通过重塑雄激素受体增强子及全局AR结合位点的染色质可及性来抑制AR表达和信号传导。单细胞测序数据表明AR和ASCL1/NeuroD1活性在个体癌细胞中可能互斥，这解释了NEPC仅出现在15%的治疗耐药病例中。研究还区分了SRRM4与ASCL1/NeuroD1在NE重编程中的相对贡献，揭示了依赖少数标志物定义NEPC谱系状态的局限性。

结果

候选因子直接重编程ARPC为NEPC并绕过AR信号依赖

我们建立了NEtD检测系统，将包含显性失活TP53、靶向RB1的shRNA、MYCN、ASCL1、SRRM4、NR0B2、BCL2和KRAS G12V的慢病毒池导入LNCaP和C4-2B细胞，并在支持NEPC生长的培养基中培养两周后分析表型标志物。结果显示AR和NKX3-1显著下调，而NE标志物（如FOXA2、SYP、NCAM1、INSM1、POU3F2）上调。免疫组化分析证实候选因子LV池诱导的ARlow/-NE+表型在异种移植中具有稳定性。

为验证重编程后的PC细胞是否功能上脱离AR依赖，我们实施了AR依赖性负向选择策略。将C4-2B细胞工程化改造为ARE-FKBP-Casp8系统后，经候选因子LV池处理的细胞在严格选择压力下仍存活，表明候选因子能够使ARPC在高度严格AR抑制治疗背景下转化为重现NEPC关键表型和功能特征的细胞状态。

先锋神经转录因子ASCL1抑制AR程序但需要额外遗传改变维持增殖表型

通过"剔除法"分析候选因子功能贡献，我们发现排除ASCL1会导致AR和NKX3-1下调及FOXA2、NCAM1和INSM1表达被取消，证实ASCL1在NE转分化中的关键作用。相比之下，排除SRRM4恢复REST表达但未显著影响AR。ASCL1单独表达即可下调AR标志物并诱导NE标志物，而PRNB因子（显性失活TP53 H175R、shRB1、MYCN和BCL2）不足以强加NEtD。SRRM4单独处理导致REST失活和SYP表达但未降低AR标志物。单细胞DNA扩增测序显示，97.8%的细胞携带所有条形码，表明转导效率良好。

细胞增殖分析显示PRNB显著增强增殖而ASCL1对细胞存活有害，这与ASCL1在神经祖细胞和胶质母细胞瘤干细胞中促进细胞周期退出的研究结果一致。有趣的是，SRRM4促进增殖但无法在缺乏PRNB时逆转ASCL1的影响，表明遗传背景和增殖适应性的平衡对NEPC发生至关重要。

NeuroD1具有诱导神经内分泌谱系重编程的能力

基于转录组分析，我们发现NeuroD1与ASCL1共同定义NEPC分子亚型。用NeuroD1替代或与ASCL1联用进行重编程实验显示，NeuroD1与PRNB和SRRM4组合可显著降低AR标记并提高NE标记。RNA-seq分析证实PRNBSA（ASCL1）和PRNBSN（NeuroD1）条件下AR基因特征富集显著减少而NE基因特征富集增加。在独立的ARPC细胞系MDA PCa 2b中验证了这些发现。

部分神经转录因子（如FOXA2、INSM1、POU3F2、SOX2）的单独表达不足以诱导NE谱系重编程，提示ASCL1和NeuroD1位于NE相关转录因子层级顶端。PLS-DA分析显示PRNB和PRNBS条件未引起NEPC表型显著转变，而添加ASCL1或NeuroD1后观察到从ARPC到NEPC的急剧基因表达程序转变。

细胞重编程过程中癌症表型、转录和表观遗传景观的动态变化

时间进程分析显示AR标志物（AR和NKX3-1）在D2即显著下调，NE标志物INSM1和FOXA2在D4-5出现。时间进程RNA-seq分析证实AR程序下调先于NE程序建立。PCA分析显示PRNBSA和PRNBSN处理组在NEtD过程中呈现弧形轨迹，这与正常组织和癌发生中的动态变化一致。

CUT&RUN分析揭示了H3K4me1、H3K27ac和H3K4me3信号的显著时序变化，表明谱系重编程伴随表观遗传重组。ASCL1结合和表达时间依赖性变化分析显示，早期（D2）涉及CDC25、TGFβ1等不稳定转录状态，晚期（D8-14）与PRC2靶点和神经命运承诺途径富集相关。

ASCL1/NeuroD1通过重塑AR增强子染色质可及性抑制AR表达

单细胞多组学分析显示PRNBSA和PRNBSN条件下AR体细胞获得的增强子区域染色质可及性显著降低，而AR基因体未见此变化。临床标本分析显示混合AR+/ASCL1-和AR-/ASCL1+肿瘤细胞中AR增强子可及性存在显著差异。全局AR结合位点分析显示具有增强子活性的ARBS可及性从PRNB到PRNBSA/PRNBSN呈全球降低，而随机基因组区域无此变化。

ASCL1/NeuroD1建立NE转录网络而SRRM4/REST失活不能

ASCL1和NeuroD1通过自激活维持自身表达。与SRRM4相比，ASCL1/NeuroD1处理组显著诱导NE相关转录因子（INSM1、SOX2、NKX2-2、FOXA2）表达。足迹分析显示ASCL1/NeuroD1表达与NE转录因子结合基序显著富集。伪批量scATAC-seq数据PCA投影显示PRNBSA和PRNBSN处理组聚类于NEPC PDX模型，而PRNB和PRNBS聚类于ARPC。NEPC相关细胞表面靶点（DLL3、L1CAM、CEACAM5、RET和SEZ6）显著上调，而ARPC相关靶点（FOLH1、PSCA、STEAP1、TACSTD2）显著下调。

NEPC中MHC I下调与ASCL1/NeuroD1驱动程序的功能关联

MHC I抗原呈递通路下调是癌症逃逸免疫监视的标志。我们发现NEPC具有更低的MHC I抗原加工和呈递基因特征评分及B2M表达。快速尸检标本分析和重组C4-2B细胞RNA-seq数据均显示随着NE分化增强，MHC I基因表达下降始于AR通路抑制。SRRM4处理组MHC I无显著变化，而ASCL1或NeuroD1处理组显著下调，其中NeuroD1处理组B2M下调最明显。scRNA-seq和scATAC-seq数据显示NEPC评分与B2M表达呈负相关，流式细胞术证实PRNBSN条件下B2M阳性细胞比例显著降低。MHC I表达下调与EZH2表达升高相关，提示PRC2复合物参与调控。这些发现将NEPC中MHC I通路的谱系特异性下调归因于ASCL1和NeuroD1的谱系定义转录因子。

讨论

AR信号对定义前列腺癌上皮谱系至关重要，但靶向治疗压力促使谱系可塑性发生。除NEPC外，双阴性前列腺癌（DNPC）等AR缺失谱系也已被识别。这种谱系可塑性在EGFR突变肺癌向小细胞肺癌转化中同样存在，但AR/EGFR沉默机制尚不清楚。传统模型系统的局限性和表型标记的异质性阻碍了对此过程的理解。

我们建立的体外系统可重现NEtD的关键特征。揭示ASCL1和NeuroD1通过重塑AR增强子染色质可及性来同时沉默原癌谱系程序并建立新谱系程序。单细胞测序数据提示AR与ASCL1/NeuroD1活性在个体PC细胞中可能互斥。NEPC亚型异质性和表观遗传收敛的发现强调了需区分谱系定义的亚型。未来研究需定义这些转录因子的调控网络，识别潜在脆弱性并开发抑制NEtD的治疗策略。