系统评估界定铁死亡在癌症治疗中的局限性Systematic Evaluation Defines the Limits of Ferroptosis in Cancer Therapy | bioRxiv

系统评估界定铁死亡在癌症治疗中的局限性

摘要

铁死亡是一种由铁催化的膜脂质酰链中脂质过氧化物的积累以及随后膜完整性丧失为特征的细胞死亡机制。尽管在培养细胞中对其机制进行了深入研究，但铁死亡的诱导在癌症治疗中仍具有未解决的临床效用。在这里，我们通过集中遗传筛选、遗传功能缺失系统和药理干预，在细胞和肿瘤模型中系统评估了通过多种机制诱导的铁死亡。通过这一分析，我们识别出对经典铁死亡诱导剂和抑制剂具有不同反应的癌细胞系亚群，并界定了每种反应的机制基础。抑制这些多种模型中的核心体外铁死亡抑制因子GPX4、GCLC或SLC7A11，未能影响已建立的肿瘤生长。相反，细胞质硫氧还蛋白还原酶缺陷和药理学GCLC抑制能强力诱导肿瘤消退，并触发一种由半胱氨酸可用性和翻译调控的非铁死亡性细胞死亡形式。这些分析进一步揭示，培养细胞中环境半胱氨酸的主要必需功能是支持硒蛋白功能，这一发现源于我们对β-巯基乙醇在无半胱氨酸条件下支持指数生长的研究。因此，尽管铁死亡激活可能在特定肿瘤背景下单独或与其他疗法联合有效，但细胞培养系统极大地高估了通过GPX4轴诱导铁死亡的潜在抗癌效果。

正文

引言

铁死亡的研究可追溯到哺乳动物细胞培养系统中氨基酸需求的最早研究，因为半胱氨酸剥夺能强力诱导这种细胞死亡机制。第一个药理学铁死亡诱导剂（erastin和RSL-3）源自高通量表型药物筛选，旨在识别癌基因转化HRAS突变成纤维细胞中的基因型选择性抗癌药物。Erastin通过抑制半胱氨酸-谷氨酸反向转运体（system xCT）组分SLC7A11来阻断半胱氨酸摄取。RSL-3共价修饰并抑制谷胱甘肽依赖性过氧化物酶和硒蛋白GPX4，后者修复氧化损伤对膜脂质多不饱和脂肪酸酰链产生的脂质过氧化物。通过半胱氨酸剥夺或抑制GSH合成来消耗GSH也会限制GPX4功能，促进不受控制的多不饱和脂肪酸氧化。细胞内游离铁水平或膜脂质含量的改变能强力调节铁死亡激活：铁可用性决定持续氧化损伤的程度，而高多不饱和脂肪酸含量则为脂质过氧化提供额外底物。在培养细胞中，铁死亡可被脂质自由基捕获抗氧化剂抑制。特别是，CoQ10是限制铁死亡的关键细胞抗氧化剂，由氧化还原酶FSP1在脂质膜中循环再生，而四氢生物蝶呤、角鲨烯、胆固醇或其衍生物在特定背景下限制铁死亡。外源性提供的合成或天然亲脂性抗氧化剂，如Ferrostatin-1、Liproxstatin-1和维生素E，能阻断半胱氨酸剥夺或GPX4抑制诱导的铁死亡。

虽然已有研究识别出细胞状态依赖性的铁死亡调节因子，但该领域大部分工作集中在少数细胞系上，包括那些高度易感铁死亡的细胞系。因此，出现了看似矛盾的结果，最显著的是与GPX4抑制相比，GSH合成抑制不能强力诱导铁死亡。此外，识别新型铁死亡调节因子的遗传筛选常常得出高度情境特异性的结果。因此，利用铁死亡激活作为抗癌治疗的有前景途径仍然是个谜。

CRISPR平铺诱变提供了铁死亡诱导剂的靶点验证

为了开始解决这些问题，我们进行了基于CRISPR的关键基因（包括GPX4、GCLC和SLC7A11）诱变，以验证常用于研究铁死亡的化合物的特异性和靶点：GPX4抑制剂RSL-3、SLC7A11抑制剂erastin和GCLC抑制剂BSO。为了最大化基因覆盖度，我们使用了增强型AsCas12a变体（enAsCas12a），它具有灵活的PAM，此外还使用了SpCas9。转导了CRISPR平铺文库的HT-1080纤维肉瘤细胞被连续暴露于致死剂量的这些化合物中，并鉴定了驱动抗性的CRISPR RNA或单指导RNA。使用enAsCas12a的筛选更好地富集了靶向特定基因区域的crRNA，而使用SpCas9的筛选则对靶向必需基因的sgRNA表现出优越的负选择。因此，我们以后重点分析enAsCas12a筛选中富集的crRNA。

那些在BSO处理下富集的crRNA靶向GCLC中的不同区域或广泛靶向GCLM，其缺失已知会导致BSO抗性，我们验证了其中几个crRNA。诱变并选择的群体对BSO的毒性效应完全抵抗，在BSO处理下仅保留野生型10%水平的GSH，与其他人观察到的GCLM破坏结果相似。对GCLC crRNA靶向位点的测序显示，约一半的读段发生突变，暗示单个突变等位基因足以驱动抗性。最常见的突变映射到GCLC:GCLM异二聚体形成所必需的区域，即GCLM残基C194和GCLC残基C553，破坏了一个二硫键。过表达GCLC cDNA或携带正选择GCLC突变体的cDNA能诱导对BSO的抗性。

在erastin处理下富集的crRNA（SLC7A11 cr299、cr300）能诱导显著但非完全的抗erastin诱导的铁死亡。对正选择细胞的测序显示约75%的读段发生突变，产生相同的两个显性突变等位基因。这些crRNA靶向SLC7A11的I270残基，位于形成erastin结合疏水簇的跨膜螺旋中。过表达野生型SLC7A11 cDNA或携带正选择SLC7A11突变体的cDNA能诱导对erastin的抗性。

在RSL-3处理以及另外两种GPX4抑制剂（ML-162和ML-210）处理的细胞中，没有显著富集的crRNA或sgRNA，尽管在诱变文库存在下观察到对ML-210的抗性。过表达GPX4能诱导对RSL-3的部分抗性，而硒代半胱氨酸到半胱氨酸的突变体（GPX4(U46C)），它保留部分GPX4催化活性但不能与RSL-3相互作用，则诱导对RSL-3的完全抗性，证实了RSL-3的选择性。同时，缺少硒代半胱氨酸插入序列（SECIS）的GPX4 cDNA无法挽救，该序列对于合成催化位点的硒代半胱氨酸是必需的。

这些结果支持了BSO通过靶向GCLC消耗细胞GSH并触发铁死亡，erastin通过靶向SLC7A11触发铁死亡，RSL-3诱导的铁死亡需要GPX4靶向，并为研究铁死亡诱导提供了额外的工具，如下文所述。

体外诱导铁死亡的扰动未能触发肿瘤消退

在确认了常用铁死亡诱导剂对其靶点的相对选择性后，我们通过进行靶向CRISPR/Cas9敲除筛选和生成可诱导抑制关键铁死亡靶点的遗传模型，评估了在细胞培养中诱导铁死亡并触发肿瘤消退的效率。我们生成了一个由铁死亡相关基因（AIFM2、GCLC、GCLM、GPX4、GSR、GSS、SLC7A11）和已知必需基因及癌症靶点（DBR1、EEF2、GAPDH、KIF11、PCNA、PLK1、POLR2B、PSMB1、RPA3、RPL3）组成的sgRNA池，并转导了两个癌细胞系（A549和HT-1080），它们在铁死亡敏感性和GSH依赖性上有所不同。我们使用sgRNA丰度的丢失来推断基因需求，使用Fer-1挽救来推断铁死亡导致的细胞死亡，并使用β-巯基乙醇来实现SLC7A11独立的半胱氨酸摄取。在标准培养条件下，铁死亡相关基因中只有GPX4的sgRNA被强烈消耗，这可以被Fer-1挽救但不能被βMe挽救。令人惊讶的是，靶向GPX4的sgRNA在肿瘤异种移植中并未被消耗，也没有其他靶向铁死亡相关基因的sgRNA在任何条件下被显著消耗。相比之下，所有必需基因的sgRNA在每种组织培养条件和肿瘤异种移植中都被消耗。为了探究这些发现是否与sgRNA试剂覆盖度不足有关，我们使用针对这些基因的SpCas9平铺文库重复了这些实验，结果一致。靶向线粒体GPX4亚型信号序列的sgRNA未被消耗，这与经典观点一致，即细胞质GPX4活性是体外细胞活力的关键。

为了使用正交方法，允许对每个铁死亡靶点进行可诱导的、近乎完全的抑制，我们在HT-1080和A549细胞中生成了GPX4、GCLC和SLC7A11的单细胞CRISPR敲除克隆，并添加了强力霉素可抑制的cDNA。我们评估了基因抑制在体外长期培养中的影响，包括Fer-1或βMe补充，以及肿瘤异种移植中的影响。DOX抑制了GPX4、GCLC和SLC7A11蛋白水平，导致体外细胞增殖完全抑制，其中GPX4在HT-1080细胞中在长时间点出现去抑制。细胞活力丧失被Fer-1阻断，证实了铁死亡的诱导。观察到的SLC7A11和GCLC缺失依赖性不同于混合池中的情况，因为未受扰动的细胞可能补偿SLC7A11或GCLC的抑制，但不能补偿GPX4。与遗传筛选结果一致，在已建立的肿瘤中抑制GPX4、GCLC或SLC7A11未能影响肿瘤生长速率，并且抑制GCLC的肿瘤中总GSH水平显著降低。这些数据表明，通过删除SLC7A11、GCLC和GPX4在体外可轻易强力诱导铁死亡的模型，未能抑制已建立的肿瘤生长。

为了进一步探讨这些体外和肿瘤异种移植结果之间的不一致，并考虑到那些方法并未系统性地抑制这些靶点，我们使用了药理学方法。BSO可口服，具有已知的药代动力学性质，适合体内使用。HT-1080细胞在体外对BSO敏感（GI50 4.53 μM），可被Fer-1处理挽救，支持铁死亡诱导。然而，已建立的HT-1080肿瘤异种移植对BSO治疗无反应，尽管该BSO治疗方案是最大耐受剂量。因此，我们得出结论，体外模型大大高估了铁死亡诱导的抗癌疗效。

表型调节谱分析界定了癌症模型中体外铁死亡诱导的治疗指数

对培养细胞中铁死亡诱导的研究通常集中在少数细胞系上。鉴于我们在A549和HT-1080细胞中未能诱导肿瘤消退，我们试图更好地理解不同肿瘤类型中以及与非转化细胞相比，对铁死亡诱导剂的反应广度。我们在100个细胞系中进行了表型调节谱分析：70个实体瘤细胞系、20个髓系和淋巴系细胞系以及10个非转化细胞系。我们进行了RSL-3、erastin、BSO和滴定外源半胱氨酸水平的9点log2剂量反应实验；此外，我们还与Fer-1或βMe共处理。作为对照，我们包括了eprenetapopt，一种具有GSH消耗活性的小分子，曾在III期临床试验中作为TP53突变髓系恶性肿瘤的治疗药物进行评估，但未能显示出足够的疗效。我们在一组15个细胞系中单独验证了这些结果，发现高度一致的结果。我们将这些数据与公开数据对齐，报告了这些细胞系中对相关化合物的药物敏感性以及对靶点GCLC、GPX4和SLC7A11的依赖性，并发现了高度显著的一致性，验证了调节谱分析结果。总体而言，癌细胞系对铁死亡诱导的敏感性低于非转化细胞系，实体瘤来源的细胞系比髓系和淋巴系恶性肿瘤来源的细胞系更具抗性。如前所述，eprenetapopt选择性地靶向髓系和淋巴系细胞系而非非转化细胞系，支持了我们的方法可以识别此类转化或细胞类型特异性治疗指数的观点。然而，我们不将这种eprenetapopt选择性归因于铁死亡诱导，因为Fer-1不提供保护。

从这些数据中，我们注意到大约三分之二的细胞系反应一致，它们表现出不同程度的铁死亡诱导敏感性，且可被Fer-1共处理挽救。值得注意的是，我们还注意到βMe可以广泛挽救半胱氨酸剥夺和SLC7A11抑制的影响。虽然先前的工作表明βMe补充可以绕过SLC7A11依赖性的半胱氨酸摄取，但假定的机制是通过将细胞外半胱氨酸还原为半胱氨酸并通过中性氨基酸转运体导入。由于βMe也能在无半胱氨酸条件下阻止细胞死亡，我们假设### 表型调节谱分析界定了癌症模型中体外铁死亡诱导的治疗指数

从这些数据中，我们注意到大约三分之二的细胞系反应一致，它们表现出不同程度的铁死亡诱导敏感性，且可被Fer-1共处理挽救。值得注意的是，我们还注意到βMe可以广泛挽救半胱氨酸剥夺和SLC7A11抑制的影响。虽然先前的工作表明βMe补充可以绕过SLC7A11依赖性的半胱氨酸摄取，但假定的机制是通过将细胞外半胱氨酸还原为半胱氨酸并通过中性氨基酸转运体导入。由于βMe也能在无半胱氨酸条件下阻止细胞死亡，我们推测存在另一种机制，βMe和半胱氨酸各自通过该机制来抑制铁死亡。

几个细胞系簇也表现出不同的、出乎意料的反应谱，这些反应谱因不被Fer-1和/或βMe挽救而具有研究意义。最值得注意的是，一个细胞系（SKMES1，一种小细胞肺癌细胞系）对BSO表现出极高的敏感性，即使在铁死亡挽救条件下也是如此。此外，一大组髓系和淋巴系细胞系对BSO处理、erastin处理和半胱氨酸剥夺表现出敏感性，这些敏感性很难被Fer-1挽救，尽管Fer-1可以轻易挽救GPX4抑制的影响。最后，铁死亡领域常用的HT-1080细胞系构成了一组在半胱氨酸剥夺条件下对βMe挽救无效的细胞系，包括几种永生化成纤维细胞系和食管鳞状细胞癌细胞系KYSE30。

这些数据与经典铁死亡诱导剂反应中存在的、不同于铁死亡的机制是一致的。由于我们难以通过触发铁死亡来诱导肿瘤消退，我们探索了在这些模型中通过使用相应的经典铁死亡诱导剂来诱导非铁死亡反应的抗癌作用。

GCLC抑制在TXNRD1缺陷模型中驱动受调控的非铁死亡性细胞死亡并导致肿瘤消退

我们证实SKMES1对BSO具有高敏感性，且不能被Fer-1或βMe挽救。我们还验证了淋巴样细胞系对GSH生物合成基因的依赖性最强，这可以通过无偏方式从GCLC依赖性与淋巴样限制性转录因子IKZF1的相关性中看出，并通过调节谱分析验证。值得注意的是，这些细胞系普遍低表达SLC7A11，与对eprenetapopt的敏感性增高一致。选择SUDHL1（一种淋巴样来源的细胞系）作为该组的代表，我们鉴定了一个对BSO高度敏感的小鼠淋巴瘤细胞系模型（A20淋巴瘤细胞，BSO GI50 2.22 μM），使我们能够在免疫能力强的小鼠中评估BSO的疗效。我们将这些模型分别植入免疫缺陷小鼠或同基因Balb/c宿主中，直至形成可触及的肿瘤，并将荷瘤小鼠随机分配到50 mM BSO或饮用水中。与HT-1080类似，源自SUDHL1和A20的肿瘤对BSO治疗无反应。值得注意的是，BSO在控制SKMES1生长方面有效，在4/5的肿瘤中诱导了部分或完全消退。

鉴于SKMES1肿瘤异种移植对BSO治疗的反应，我们试图确定是什么驱动了观察到的非铁死亡性细胞死亡。利用我们的表型调节谱筛选数据集，我们搜索了可预测对BSO敏感性的公共生物标志物，这些敏感性不能被Fer-1或βMe挽救。这一分析揭示，SKMES1是唯一一个具有TXNRD1双等位基因失活突变的癌细胞系，TXNRD1编码硒蛋白硫氧还蛋白还原酶1，负责维持细胞质中的硫氧还蛋白库，这是一种基于蛋白质的抗氧化剂。为了验证TXNRD1缺陷是否驱动了对BSO的非铁死亡性细胞死亡，我们在A549细胞中生成了CRISPR介导的单细胞TXNRD1敲除克隆。值得注意的是，这些TXNRD1敲除克隆对BSO的敏感性增加了500倍，且不能被Fer-1或βMe挽救，这与铁死亡非依赖性细胞死亡一致。在A549 TXNRD1敲除克隆和SKMES1细胞中表达sgRNA抗性的TXNRD1 cDNA可挽救BSO敏感性。然而，我们观察到，表达缺乏氧化还原酶活性的TXNRD1突变体（硒代半胱氨酸到半胱氨酸突变体）或缺乏SECIS的突变体并不能挽救TXNRD1缺陷，这证实了BSO敏感性依赖于TXNRD1的经典氧化还原酶功能。表达来自嗜热链球菌的双功能谷氨酸-半胱氨酸连接酶/谷胱甘肽合成酶GshF（对BSO和GSH负反馈调节不敏感）可挽救TXNRD1缺陷模型以及TXNRD1正常模型中BSO诱导的细胞死亡。类似地，过表达GCLC或BSO抗性GCLC突变体可部分挽救BSO的效应。一致地，与BSO结构相似但无法消耗GSH的类似物（L-丁硫氨酸亚砜、L-甲硫氨酸亚砜胺和L-甲硫氨酸亚砜）在TXNRD1缺陷模型或HT-1080中均不触发细胞死亡。过表达GPX4或GPX4(U46C)突变体（可驱动对BSO诱导的铁死亡的抗性）不影响TXNRD1缺陷模型对BSO的敏感性。

重要的是，由TXNRD1敲除A549细胞衍生的异种移植肿瘤对BSO治疗产生消退反应，有些完全消退，且呈剂量依赖性，这与先前关于协同靶向GCLC和TXNRD1可以限制肿瘤发生的发现一致。总之，这些数据表明，TXNRD1缺陷驱动了对一种GPX4非依赖性、非铁死亡性细胞死亡形式的敏感性。此外，触发这种细胞死亡机制可以使已建立的肿瘤异种移植消退，这与所有其他测试的BSO敏感性模型形成对比。

为了理解由TXNRD1缺陷和GSH合成抑制触发的细胞死亡过程，我们将已知细胞死亡抑制剂和诱导剂的化学库应用于SKMES1细胞，这些细胞用BSO处理，并加入或不加入Fer-1。蛋白质合成抑制剂放线菌酮在存在和不存在Fer-1的情况下都能挽救BSO对细胞活力的影响，我们在单独的实验中验证了这一效应。相比之下，凋亡、坏死性凋亡、坏死、焦亡和铁死亡的抑制剂均不能单独或与Fer-1联合挽救这种细胞死亡形式。

有趣的是，半胱氨酸摄取抑制剂erastin和erastin2仅在存在Fer-1的情况下才能挽救细胞活力。TXNRD1和GSH都会还原二硫键并将半胱氨酸转化为细胞内半胱氨酸，而SKMES1是唯一依赖谷胱甘肽还原酶GSR的细胞系。因此，我们假设半胱氨酸可用性可能影响TXNRD1缺陷模型中BSO的细胞毒性。在SKMES1细胞中，我们比较了半胱氨酸充足和耗竭条件下的BSO敏感性，以及是否与Fer-1或βMe共处理。虽然BSO在半胱氨酸充足条件下诱导非铁死亡性细胞死亡，但半胱氨酸剥夺限制了BSO对细胞活力的影响，而Fer-1可挽救由半胱氨酸剥夺和BSO处理联合诱导的铁死亡。值得注意的是，当我们用固定浓度的BSO处理细胞并滴定培养基中的半胱氨酸时，我们在Fer-1共处理条件下观察到活力的剂量依赖性挽救。这些数据表明，半胱氨酸耗竭抑制了由TXNRD1/GCLC联合缺陷引起的非铁死亡性细胞死亡机制。这一结果尤其令人惊讶，因为半胱氨酸剥夺无法恢复GSH水平，尽管细胞内GSH的产生抑制了这种细胞死亡机制。总之，这些数据表明，细胞质硫氧还蛋白还原酶系统联合药理学GCLC抑制触发了一种不同于铁死亡的细胞死亡形式，该形式受半胱氨酸可用性和蛋白质合成调控，并且可以在培养细胞和肿瘤异种移植中触发。

维持硒蛋白和GPX4功能可绕过对外源半胱氨酸的需求

如上所述，βMe能够广泛抑制半胱氨酸耗竭诱导的细胞死亡，包括在绝大多数实体瘤、髓系和淋巴系细胞系以及非转化细胞系中。因此，我们在A549细胞中生成了SLC7A11敲除克隆，这些克隆需要βMe来维持活力并抑制ATF4介导的应激反应，这与βMe驱动半胱氨酸转化为半胱氨酸以及SLC7A11非依赖性转运一致。有趣的是，SLC7A11敲除克隆需要纳摩尔浓度的βMe来维持活力，而保护免受半胱氨酸剥夺则需要微摩尔浓度的βMe，暗示了一种不同的机制。此外，虽然含巯基的二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦也能绕过SLC7A11的需求，但它们不能保护免受半胱氨酸剥夺。βMe补充未能恢复GSH水平，而GSH水平被很好地抑制，从而将GSH水平与增殖能力脱钩。虽然哺乳动物细胞具有通过丝氨酸转硫途径从头生成半胱氨酸的能力，但均匀同位素标记的丝氨酸追踪未能检测到转硫途径活性，这与观察到的GSH丢失以及先前关于培养癌细胞中缺乏转硫途径活性的报告一致。βMe在无半胱氨酸条件下挽救细胞活力的能力，尽管GSH耗竭，与我们观察到的βMe恢复缺乏GCLC的细胞的指数增长以及广泛保护BSO处理的细胞免受铁死亡一致。值得注意的是，50 μM βMe补充支持SLC7A11敲除克隆在存在和不存在细胞外半胱氨酸的情况下的长期培养，以及野生型细胞在无半胱氨酸培养基中的长期培养。这些数据表明，βMe可以通过不同的机制促进SLC7A11非依赖性半胱氨酸摄取和半胱氨酸非依赖性生长，并证明βMe可以在体外替代细胞外半胱氨酸，促进稳健的细胞增殖。

在寻找βMe预防铁死亡的其他机制时，我们将注意力转向硒的摄入，因为先前的报告表明SLC7A11功能和半胱氨酸摄取维持了有利于硒摄入的细胞外氧化还原环境。硒是硒代半胱氨酸合成的必需营养素，要么以亚硒酸钠的形式添加到培养基中，要么以血清硒蛋白或其他小分子量硒物种的形式存在。亚硒酸盐被细胞外硫醇还原为硒化物，促进其摄入，并可导致硒毒性。与这一机制一致，在混合池的功能缺失筛选数据集中，SLC7A11缺失对细胞活力的影响只有中等程度。此外，共培养跨孔实验表明，对照细胞（而非SLC7A11敲除细胞）可以支持SLC7A11敲除细胞的增殖，表明条件培养基中的一种SLC7A11依赖性组分可以克服SLC7A11的需求。与半胱氨酸剥夺限制硒可用性的假设一致，我们发现半胱氨酸耗竭导致对硒剥夺敏感的硒蛋白（GPX4和GPX1）丢失，这可以通过βMe补充得到强力挽救，即使在12天的指数增殖后也是如此，并且在SLC7A11敲除后也是如此。βMe补充增加了亚硒酸钠处理对多种细胞系模型的细胞毒性作用，其程度远大于DTT和TCEP，这与βMe促进硒摄入一致。重要的是，过表达硒非依赖性GPX4突变体（GPX4(U46C)）可在半胱氨酸剥夺条件下维持细胞活力，而野生型GPX4则不能。

进一步支持半胱氨酸补充使硒可用于GPX4功能的假设，在少数βMe不能保护免受半胱氨酸剥夺的模型中（例如HT-1080和KYSE30），βMe仍能维持硒蛋白水平，但GPX4(U46C)过表达未能阻止铁死亡。这些数据与这些模型中需要更高水平的半胱氨酸或GSH来阻断铁死亡，或者需要GPX4以外的其他硒蛋白的需求一致。基于CRISPR的筛选和验证实验强调，通过抑制LPCAT3来抑制多不饱和脂肪酸掺入膜脂质，可以轻易阻断A549细胞中由SLC7A11敲除或半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡，而对HT-1080和KYSE30细胞系影响最小，进一步表明在这些少数模型中，半胱氨酸的需求超出了支持GPX4功能。

这些数据表明，外源半胱氨酸在支持培养细胞活力方面的主要功能是通过支持硒摄入和硒蛋白功能，因为如果硒蛋白功能得到恢复，细胞可以在缺乏半胱氨酸的情况下长期培养并维持增殖能力。

讨论

在精准医学时代，成功开发靶向抗癌疗法依赖于适当的靶点识别和验证，这些工作应在癌症的临床前模型中进行。新型抗癌疗法在通往临床批准的道路上失败的主要模式通常是由于疗效有限和毒性不可接受。药物开发的财务成本，以及进入临床试验的患者面临的巨大风险和负担，强调了在将新的癌症治疗方式推向临床研究之前，进行勤勉的临床前靶点验证的极端重要性。

自首次发现铁死亡诱导剂以来已过去二十多年，尽管在定义和描述铁死亡作为一种细胞死亡过程的体外分子机制方面取得了巨大进展，但在将这些见解转化为临床有用的铁死亡诱导剂方面进展甚微。溶解性和药代动力学特性不佳限制了erastin和RSL-3的直接应用；然而，生成生物可利用的SLC7A11和GPX4抑制剂的努力在靶点结合方面取得了成功，但未能实现肿瘤控制，同时伴有靶点上的非肿瘤毒性。例如，Abbvie科学家开发了化合物24，一种具有适当药代动力学特性的RSL-3类似物，并证明了体内靶点结合。然而，该化合物导致靶点上的肾脏毒性，并且在动物模型中缺乏抗肿瘤疗效。这些结果与小鼠的遗传消融数据一致，这些数据报告了与全身体内可诱导GPX4耗竭相关的肾脏毒性。此外，GCLC抑制剂BSO已在人类中使用，并已在临床前肿瘤模型中与化疗联合进行了广泛测试。Kojin Therapeutics证明BSO作为单药可诱导适度的肿瘤生长抑制，这一效应归因于铁死亡诱导。然而，临床试验导致两名儿科患者死亡，且没有实质性的抗癌活性。这些结果表明，靶点上的肾脏毒性将限制通过单药抑制SLC7A11-GSH-GPX4轴的癌症治疗。

我们的结果强调，在细胞培养中能够稳健进行铁死亡的癌症模型无法在小鼠中调节肿瘤生长。此外，几个使用包含铁死亡靶点Gpx4、Gclc、Slc7a11和Aifm2的代谢文库的无偏体内CRISPR筛选报告称，指导RNA丰度没有显著变化。最近的证据表明，2D培养本身增强了膜脂质的多不饱和脂肪酸组成，人为地增强了对GPX4抑制的敏感性。此外，标准细胞培养基中的半胱氨酸:半胱氨酸氧化还原对远比体内（包括组织和肿瘤）中更加氧化。这些发现是在抗氧化剂补充在人和小鼠中均具有明确促肿瘤作用的背景下得出的，以及通过在肺腺癌、肺鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌等中KEAP1、NFE2L2和CUL3的反复突变而明确激活NRF2抗氧化反应通路，而非遗传性NRF2通路激活在其他肿瘤类型中也有观察到。NRF2激活几种保护免受铁死亡的基因，包括编码铁储存蛋白铁蛋白、GSH生物合成通路以及促进NADPH产生或循环的基因。然而，虽然NRF2激活在小鼠和人类中明确驱动肿瘤发生，但尚不确定持续的NRF2通路激活是否对肿瘤维持很重要。

这些考虑导致了几点可能解释不同实验室研究肿瘤模型中铁死亡结果多样性的原因。首先，在肿瘤起始、进展和转移过程中，对铁死亡保护的需求可能存在差异。实际上，许多遗传驱动的临床前模型通过在肿瘤植入之前或同时抑制靶点来测试靶点验证，而不是以可诱导的方式抑制已建立肿瘤中的靶点，后者将更好地模拟未来可能的药物治疗。研究小组还发现，在铁水平有限的转移环境中，包括淋巴管，会影响氧化应激敏感性。其次，NRF2通路改变出现的肿瘤类型可能表明解剖位置在驱动氧化应激敏感性中的重要性。从一个非常简单的角度来看，呼吸道气道增加了对环境氧气的暴露，这些环境可能对表现出氧气敏感性的癌细胞更不利。神经元也可能对铁死亡具有更高的敏感性，因为在人类中已发现GPX4突变与Sedaghatian型脊椎干骺端发育不良相关，并且在该疾病的细胞和动物模型中已报告了铁死亡样细胞死亡增加。第三，确定减少的肿瘤生长是否反映了通过铁死亡进行的持续细胞死亡非常困难，并且为了简单起见，该领域经常将抗氧化剂治疗导致肿瘤生长增加与铁死亡的证据混为一谈。实际上，肯定存在非铁死亡的原因，使得抗氧化剂治疗可能挽救靶基因抑制的效果并增强肿瘤发生，即使对于被归类为铁死亡抑制剂的分子也是如此。事实上，最近的证据表明，其中一些分子通过铁螯合起作用。通过抑制多不饱和脂肪酸掺入质膜来设计无法进行铁死亡的模型，可能有助于解开这些现象，正如最近对FSP1抑制诱导肺癌铁死亡能力的评估所显示的那样。

鉴于半胱氨酸摄入在我们对铁死亡理解中的突出作用，我们的结果为半胱我继续翻译剩余的讨论部分。

鉴于半胱氨酸摄入在我们对铁死亡理解中的突出作用，我们的结果为半胱氨酸和GSH在培养细胞中的作用提供了重要的背景。我们发现，在许多情况下，如果向细胞提供另一种硫醇还原剂βMe，可以完全从细胞培养基中去除半胱氨酸，从而允许长期指数增长。这些数据表明，摄入的半胱氨酸以半胱氨酸或GSH的形式从细胞中输出，从而调节培养基以允许硒的摄入，正如Kim及其同事的工作所表明的那样。事实上，我们发现，表达硒非依赖性GPX4 cDNA可以在没有外源半胱氨酸的情况下支持细胞活力。细胞在无半胱氨酸培养基中长期存活的能力令人惊讶，表明培养细胞可以从其他来源获得足够的半胱氨酸来支持蛋白质合成和最低水平的GSH生产，最可能是通过分解细胞外蛋白质。此外，我们的数据表明，指数细胞生长不需要细胞中存在的毫摩尔浓度的GSH，因为βMe或Fer-1允许GCLC敲除细胞的指数生长。这些结果与SLC7A11和GCLC在混合池遗传筛选中未被评为必需基因的结果一致。事实上，我们发现，表达SLC7A11的细胞或其条件培养基可以轻易挽救SLC7A11敲除细胞的生长。因此，我们得出结论，在几乎所有模型中，细胞培养基中半胱氨酸的主要细胞必需功能（以及因此培养细胞中SLC7A11表达的功能）是支持细胞外硫醇的产生，从而允许硒的摄入，以维持硒蛋白（如GPX4）的功能。

我们的工作还识别出对GCLC抑制剂BSO具有高度敏感性的罕见模型。虽然在某些模型中，这种敏感性是由于对GSH在抑制铁死亡或支持硒蛋白功能方面的高度需求，但我们在另一种模型中发现了TXNRD1缺陷驱动了对BSO的高度敏感性。有趣的是，细胞质硫氧还蛋白还原酶的缺失联合药理学GCLC抑制导致了一种非铁死亡性细胞死亡形式，该形式可受细胞外半胱氨酸剥夺和蛋白质合成抑制的调控。这种细胞死亡机制被半胱氨酸剥夺挽救尤其令人惊讶，因为BSO触发GSH耗竭，而强制恢复GSH可以挽救这种细胞死亡，但半胱氨酸剥夺无法恢复GSH水平，却具有细胞保护作用。我们推测，TXN和GSH系统的双重丧失限制了细胞缓冲细胞内氧化还原状态的能力，使细胞对硫醇浓度的极端变化敏感。

由于这种由BSO在TXNRD1缺失背景下诱导的非铁死亡性细胞死亡形式可以轻易使已建立的肿瘤消退，我们的结果表明，TXNRD1缺陷可以为使用靶向GCLC的药物提供肿瘤内在的治疗指数，这与先前的研究一致。然而，基于细胞系和人类肿瘤生物库分析，TXNRD1突变在人类癌症中很少出现，而同时抑制两条通路可能会因靶点上毒性而难以达到肿瘤反应。

我们的数据表明，铁死亡诱导的体外效应大大高估了对肿瘤控制的影响。因此，我们的研究建议，在将癌细胞中铁死亡的诱导归因于肿瘤控制和消退的驱动因素时，应谨慎行事。那些将SLC7A11-GCLC-GPX4轴在癌细胞中的抑制作为肿瘤控制主要模式的癌症临床前模型，应被重新审视，以考虑是否对铁死亡在观察到的任何抗肿瘤效应中所起的作用给予了适当的强调。

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