一种改进的从人类皮肤样本中提取蛋白质的方法涉及通过纳米液相色谱串联质谱（nano LC-MS/MS）获取蛋白质组学数据。
关键要点
- 巴西多家机构的研究人员开发了一种增强型协议，用于从人类皮肤中提取和分析蛋白质，结合了化学和机械裂解、SP3样品制备以及nano LC-MS/MS。这种方法使得鉴定超过6000种蛋白质成为可能，证明了该方法的高产量和可靠性。
- 该研究强调了皮肤蛋白质组学在理解诸如皮肤利什曼病、结核病、孢子丝菌病和自身免疫性疾病等疾病中的重要性。它突出了生物标志物发现的潜力以及对宿主-病原体相互作用和免疫功能障碍的更深入理解。
- 其局限性包括其在不同组织病理特征的皮肤病上的适用性，以及缺乏特定层次的蛋白质数据。未来的研究可受益于激光显微切割或机械分馏来开发分层蛋白质组图谱，并提高皮肤分析的空间分辨率。
一个多机构的巴西研究小组提出了一种改良和优化的从人类皮肤中提取蛋白质的协议，结合了化学和机械裂解方法。为了表征样品，所获得的蛋白质使用SP3（单罐、固相、样品制备）方法进行纯化和消化，然后通过纳米液相色谱与串联质谱（nano LC-MS/MS）进行分析。通过这一过程，研究人员能够从健康个体和孢子丝菌感染患者的皮肤样本中鉴定出大约6000种蛋白质。基于这项研究的一篇论文发表在《生物学方法与协议》上（1）。
作为人体最大的器官，皮肤充当着机体与外部环境之间的界面，提供诸如刺激检测、温度调节和抵御侵入性微生物、化学物质或其他威胁机体稳态的因素等基本功能。皮肤由三层不同的结构（表皮、真皮和皮下组织）组成，包含多种细胞类型，包括黑色素细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和皮肤相关免疫细胞。一旦这些细胞间的平衡被打破，各种疾病就可能出现，导致身体损伤和生活质量下降（2–4）。
蛋白质组学研究对于理解影响皮肤的各种疾病的广泛范围具有重要意义。例如，在皮肤利什曼病中，蛋白质组学可能有助于识别与免疫反应和感染发病机制相关的生物标志物。在皮肤结核病中，蛋白质组学可以揭示用于鉴别诊断的标记物的改变。同样，在孢子丝菌病中，蛋白质组分析可以阐明病原体与宿主免疫系统之间的相互作用，并影响新治疗策略的发展。在自身免疫性疾病中，蛋白质组学可以识别可能导致免疫功能障碍并为诊断和治疗提供有用见解的蛋白质变化（2,5,6）。
尽管有这些益处，研究人员表示，很少有研究探索健康人类皮肤在蛋白质水平上的分子组成。一个原因可能是皮肤结构的复杂性。高丰度蛋白质如角蛋白和胶原蛋白会使目标蛋白的检测变得困难，尤其是那些在病理过程中起重要作用且含量较低的蛋白质。其他困难涉及样品处理的技术程序，特别是组织分离和均质化（2–4）。
在这项研究中，所获得的皮肤样品重新悬浮在0.1%甲酸中，并使用与液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）和Easy Flex源耦合的质谱仪进行分析。配备有场不对称离子迁移质谱（FAIMS）系统的光谱仪根据交替电场下的不同迁移率执行气相离子分离。MS/MS光谱的采集使用数据独立采集（DIA），FAIMS系统中的补偿电压设置为−45和−60 V，分辨率为30000，最大注射时间为50 ms（1）。
研究人员表示，通过这一协议鉴定出的超过6000种蛋白质的数量比2016年的一项研究（7）提高了三倍，后者鉴定出约2000种蛋白质，比2014年的一项研究（8）提高了十倍，后者仅鉴定出600种蛋白质。这些结果证实了研究人员的信念，即他们的协议成功优化和调整了从人类皮肤中提取蛋白质的过程。他们认为，实现这一成功结果的关键在于通过增强裂解过程并整合化学和机械技术来优化蛋白质提取程序（1）。
尽管这项研究建立了一个稳健的蛋白质组学工作流程，但研究人员承认存在两个主要限制。首先，虽然使用健康对照和孢子丝菌病患者进行了验证，但直接应用于具有不同组织病理特征的其他皮肤病（如纤维化疾病，例如硬皮病或大疱性疾病，例如天疱疮）可能需要对协议进行优化以应对这些条件引起的组织异质性。此外，尽管该协议实现了令人满意的蛋白质组覆盖率，但对整个活检样本的分析并不能区分每个皮肤层的具体贡献，可能掩盖了各层之间关键的蛋白质组差异。未来的发展可以整合激光显微切割技术或事先的机械分馏，以生成分层的蛋白质组图谱，这对于分析局部过程甚至单一细胞类型的蛋白质图谱至关重要，特别是对于空间受限的过程如角质形成细胞分化。然而，随着这一领域的研究进展，研究人员认为他们的协议可能会成为未来研究人类皮肤蛋白质组的工具（1）。
参考文献
- Reis, A. P. C.; Celestrino, G. A.; Souza Siqueira, T. 等。《优化的人类皮肤样本蛋白质提取协议》。Biol. Methods Protoc. 2025, 10(1), bpaf035. DOI: 10.1093/biomethods/bpaf035, 377-391. DOI: 10.1080/14789450.2020.1773261, 5587. DOI: 10.1038/s41467-020-19383-8, 345-361. DOI: 10.1080/14789450.2021.1935247, 1456-1467. DOI: 10.1111/cea.12979, e97772. DOI: [10.1371/journal.pone.0097772](
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