摘要
背景 在糖尿病中，宿主和微生物对色氨酸(Trp)的代谢均发生改变；然而，其分子机制尚未完全阐明。
目的 我们在2型糖尿病模型db/db小鼠中采用策略增加血管紧张素转换酶-2(ACE-2)依赖性或非依赖性的Trp吸收，并测试这些策略能否预防糖尿病视网膜病变(DR)的发展，这是糖尿病最常见的微血管并发症。此外，我们还调查了有和无DR的人类体内的Trp代谢物水平。
设计 通过灌胃给予保留肠道ACE2:钠偶联中性氨基酸转运蛋白表达的基因工程细菌，实现了增强ACE-2依赖的Trp吸收。通过灌胃给予经溶质载体家族15成员1吸收的Trp二肽（异亮氨酸-Trp；IW）实现了ACE-2非依赖的Trp吸收。这两种策略均作为预防（6个月治疗）或干预（3个月治疗）使用，最后进行肠道、代谢和视网膜研究，包括空间质谱(MS)。测量了2型糖尿病(T2D)有DR(n=30)和无DR(n=40)个体以及健康对照(n=35)的血浆Trp代谢物和肠道通透性标志物。
结果 副干酪乳杆菌-ACE2或IW治疗预防了DR，纠正了菌群失调，富集了Trp代谢细菌，改善了肠道屏障完整性，增强了肠促胰岛素分泌，并恢复了db/db小鼠的葡萄糖稳态。空间MS在视网膜色素上皮层中确定了吲哚丙酸(IPA)是一种保护后部血视网膜屏障的代谢物。患有DR的T2D个体表现出内毒素血症和肠道屏障破坏的血清标志物升高，同时有益代谢物IPA水平降低和有毒代谢物吲哚硫酸盐水平升高。
结论 恢复Trp代谢或IPA的营养干预策略可作为DR的生物标志物和治疗方法。
引言
人类宿主与其微生物组密不可分，已经与其共同进化，导致将大约60%的人类代谢外包给微生物。肠道提供了体内主要的微生物组，代表约1000种微生物物种。肠道微生物组失调与一系列病理相关，如脑血管疾病、帕金森病、癌症、肥胖和糖尿病视网膜病变(DR)。
色氨酸(Trp)是一种不可或缺的膳食氨基酸，在调节肠道免疫系统、抑制炎症和维持微生物稳态方面发挥关键作用，但Trp吸收在糖尿病中减少。Trp的代谢由多个信号通路协调，主要是犬尿氨酸、血清素和吲哚通路。犬尿氨酸和血清素相关代谢物由宿主细胞生成，而吲哚代谢则由肠道微生物进行，代谢物随后作用于宿主细胞。大约85种微生物物种通过酶色氨酸酶将膳食Trp代谢为吲哚。
此前，我们发现上皮血管紧张素转换酶2(ACE2)作为肠道上皮细胞转运Trp的转运蛋白钠偶联中性氨基酸转运蛋白(B0AT1)的伴侣，并在肠道上皮的顶膜中形成稳定的异二聚体[(ACE2:B0AT1)₂]。我们展示了在糖尿病小肠中，ACE2的表达与B0AT1的表达平行。使用表达可溶性ACE2的基因工程副干酪乳杆菌(LP-ACE2)，我们展示了从微生物衍生的血管紧张素II生成血管紧张素1-7(Ang 1-7)，并通过激活MAS受体保留内源性ACE2:B0AT1表达。
在本研究中，我们证明了通过ACE2依赖或非依赖机制改善Trp吸收的策略，或直接补充有益的Trp代谢物如吲哚丙酸(IPA)，可预防DR的发展，减轻糖尿病引起的菌群失调和肠道上皮屏障损伤，并通过增加肠促胰岛素释放改善代谢稳态。据我们所知，我们首次表明有益代谢物IPA存在于视网膜色素上皮(RPE)中，这些细胞生成后部血视网膜屏障，并通过体外研究证实IPA直接增加关键核受体芳烃受体(AhR)和孕烷X受体(PXR)的表达，这些受体调节RPE细胞中的屏障功能。在仅患有DR这一微血管并发症而没有其他血管并发症的糖尿病个体队列中，我们发现与年龄-性别匹配的糖尿病和非糖尿病对照相比，IPA水平较低，而有害代谢物吲哚硫酸盐(IS)水平升高。这些数据共同表明，失调的Trp代谢对DR的发展具有重大影响，因为IPA可能作为DR的生物标志物，其补充可能对DR的治疗管理有效。
主要研究结果
DR病理与肠道Trp吸收减少直接相关
研究评估了两种独立策略来测试Trp吸收在DR发病机制中的作用。一种方法针对ACE2依赖机制，另一种针对ACE2非依赖通路。对于ACE2依赖方法，我们给予LP-ACE2，此前已在1型糖尿病模型Akita小鼠中显示可保留肠道上皮ACE2表达。LP-ACE2通过口服灌胃给予，每周三次，持续6个月，从高血糖开始时开始。正如预期，这种治疗导致糖尿病肠道上皮中ACE2:B0AT1二聚体表达的保留，并且还增加了血浆中的ACE2水平。
视网膜功能评估显示，db/db盐水治疗小鼠与野生型(WT)对照相比，光适应a波振幅显著降低（41.95±8.23 vs 115.3±7.41；p=0.0005）。LP-ACE2和IW治疗均显著恢复a波振幅（94.49±15.16，p=0.0118和106.0±9.30，p=0.0052）。在暗适应条件下，db/db盐水小鼠的a波和b波振幅也显著降低，而IW治疗显著改善了两种振幅。
视网膜血管退化是DR的标志，通过计算无细胞毛细血管数量进行量化。如预期，db/db盐水小鼠比WT对照表现出明显更多的无细胞毛细血管（11.0±1.15 vs 4.80±0.66；p=0.0031）。LP-ACE2和IW治疗均显著减少了无细胞毛细血管数量（6.5±1.19，p=0.0451；和6.25±1.25，p=0.0331）。这些发现表明，通过ACE2依赖或非依赖机制增强Trp吸收可改善DR。
增强Trp吸收改善db/db小鼠的代谢和肠道功能
代谢终点评估显示，IW治疗导致体重减轻和血糖降低。胰岛素水平降低，胰岛素敏感性和β细胞功能改善，血清肠促胰岛素GLP-1和GIP水平升高。这些发现表明LP-ACE2和IW治疗增强糖尿病小鼠的葡萄糖稳态和胰岛素反应性。
肠道微生物组分析显示，db/db小鼠的α多样性显著降低（109.4±10.52）与WT对照（152.3±10.96；p=0.03）相比。令人惊讶的是，LP-ACE2治疗进一步降低了α多样性，而IW二肽治疗显著增加了α多样性（198.4±11.3；p=0.0001 vs 未经治疗的db/db）。
在属水平上，我们重点关注与Trp代谢、肠道屏障完整性、葡萄糖稳态和炎症级联相关的细菌。在db/db小鼠中，关键产生有益吲哚代谢物的Bacteroides和Bifidobacterium分别减少了87%和64%，而产生有毒代谢物吲哚硫酸的Barnesiella升高了113.5%。两种治疗都恢复了Bacteroides，同时降低了Barnesiella丰度。
肠道形态学评估显示，db/db小鼠的绒毛长度减少，但在两种治疗组中恢复到接近正常水平。绒毛与隐窝比值在db/db小鼠中显著较低（3.39±0.12 vs 4.99±0.30；p=0.03），并在治疗后正常化。Ki67免疫染色显示，未经治疗的db/db小鼠隐窝细胞增殖减少，而在LP-ACE2和IW治疗组中增加。这些发现表明上皮更新和吸收能力增强。
IPA作为关键代谢物保护视网膜功能
空间质谱分析证实RPE层中存在IPA，该层构成后部血视网膜屏障。IPA是一种由微生物衍生的Trp代谢物，以其强大的抗氧化和抗炎特性而闻名。虽然IPA在肠道中由共生细菌产生，但其生物学影响是系统性的，暗示其在肠道以外的远端器官中的作用。
IPA治疗显著增加了肠道上皮标志物ZO-1和p120-连环蛋白的表达。同样，肠道血管的内皮完整性也得到改善，表现为VE-钙粘蛋白表达增加和PV1表达减少。IPA、LP-ACE2或IW治疗显著增加了db/db小鼠中的GLP-1和GIP血浆浓度。这些发现表明IPA类似于LP-ACE2和IW，可改善肠道屏障完整性和增强肠促胰岛素分泌，可能有助于改善糖尿病中的葡萄糖稳态。
人类研究证实IPA与DR的关联
在T2D中，血浆Trp水平显著低于健康对照（19.86±0.71 vs 24.28±1.25；p=0.0012），而在DR患者中进一步降低（16.5±0.53；p=0.0063）。吲哚水平在T2D（0.74±0.07 vs 0.38±0.03；p=0.0055）和T2D伴DR（0.79±0.08；p=0.0010）组中均显著高于健康对照。
IPA水平在T2D（140.5±16.29；p<0.0001）中显著降低，在T2D伴DR（80.04±8.32）中进一步减少，与健康个体（272±32.25；p<0.0001）相比。有害代谢物IS的水平在有和无DR的T2D患者中均显著升高。
肠道屏障功能评估显示，T2D个体的FABP2水平显著高于健康对照（20.61±2.98 vs 6.86±0.93；p=0.0424），在DR患者中进一步增加（36.47±4.99；p=0.0134），表明DR中受损的L-Trp代谢与肠道屏障功能障碍之间存在联系。肽聚糖(PGN)和脂多糖结合蛋白(LBP)水平在T2D和T2D伴DR队列中均显著升高。这些发现突显了T2D中改变的Trp代谢与肠道屏障功能障碍之间的强关联，IPA和FABP2可能成为DR存在的潜在预测生物标志物。
讨论与结论
本研究共同支持Trp代谢、肠道屏障完整性和DR发展之间的机制联系。Trp吸收通过两种不同的肠道途径发生：ACE2依赖机制(ACE2:B0AT1)和ACE2非依赖机制(SLC15A1/PEPT1)，这两种机制在T2D啮齿动物模型中均受损。值得注意的是，通过SLC15A1吸收的Ile-Trp二肽绕过了糖尿病中受损的ACE2:B0AT1途径，并对肠道产生与使用LP-ACE2相当的保护作用，LP-ACE2是一种增强肠道RAS系统保护臂活性的基因工程益生菌。
两种干预都增强了肠促胰岛素分泌，减少了高血糖，并恢复了肠道上皮和内皮屏障完整性，强调了肠道-视网膜轴在DR发病机制中的重要性。通过多种功能和结构终点，包括无细胞毛细血管计数和视网膜电图，我们证明LP-ACE2和IW都显著改善视网膜结果。
Trp和IPA水平在健康个体中显著高于糖尿病患者，DR患者的水平最低。血浆Trp和IPA水平与肠道屏障功能障碍和内毒素血症呈负相关，表明微生物代谢与血管健康之间存在系统性联系。IPA通过上调PXR和AhR进一步促进肠道稳态，抑制炎症信号。IPA减少了向视网膜募集的Th17细胞，突显了其抗炎潜力。
本研究证实，肠道靶向干预，包括基因工程食品级益生菌(LP-ACE2)、含Trp的二肽(IW)和直接给予有益Trp代谢物如IPA，代表了预防DR等血管并发症的可行营养干预策略。重要的是，所述系统性营养干预策略可以与当前标准护理直接眼科治疗相结合。我们的发现强调，细菌代谢物到达视网膜，在那里它们起到增强视网膜屏障完整性和减少炎症信号的作用。
这项研究为开发基于肠道微生物组的糖尿病并发症新治疗方法开辟了道路，IPA不仅可能作为DR的生物标志物，其补充还可能成为治疗DR的有效策略，为糖尿病眼病的早期干预提供了新思路。
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