银屑病风险等位基因在具有抗原暴露“记忆”的活化Th1/17细胞中的功能 - 健康研究

摘要

大多数复杂疾病的致病变异预计以细胞和背景特异性的方式影响基因调控。因此，识别此类动态起作用的变异需要疾病相关组织和背景下的功能读出。本研究通过添加疾病相关细胞的功能注释，优先筛选银屑病的致病变异。我们证明，疾病相关的免疫细胞（与大多数其他组织不同）具有与候选致病SNP相匹配的功能注释。具体而言，我们鉴定了一个eQTL rs4672505，它仅在具有记忆表型（即经历过抗原的T辅助细胞）的Th1/Th17细胞中降低B3GNT2基因表达。这个可能致病的eQTL还与记忆T辅助细胞特有的增强子染色质标记相匹配，而在其他组织中缺失。eQTL处的疾病风险等位基因A与B3GNT2糖基转移酶表达降低相关。小鼠模型中B3GNT2缺陷会降低参与CD28/B7共刺激通路的CD28共受体的糖基化，并导致抗原刺激后T细胞活化增强。我们假设，患者中的风险等位基因A在再次暴露于抗原时会增加记忆Th1/Th17细胞的活化，这构成了“信号1”。对抗原的增强反应依赖于抗原呈递细胞产生的通过CD28/B7共刺激的“信号2”，而这些抗原呈递细胞需要接触微生物产物。因此，这种遗传风险机制位于对特定抗原和微生物暴露（例如感染或疫苗接种）的反应的交汇点，这两者均已知会加重银屑病。

引言

大多数炎症性疾病的致病变异（约90%）预计是非编码的，并通过基因调控[1]和剪接[2]影响疾病风险。对于非编码变异，精细定位的传统挑战（如强连锁不平衡）因难以识别介导功能的细胞类型和效应基因而进一步复杂化[3]。这是因为非编码变异通过影响基因调控和剪接的不同阶段来促成疾病[2]。基因调控是动态的，通常发生在未知细胞和特定生理背景中[4]。在自身免疫性疾病中，免疫细胞特异性的、依赖刺激的调控SNP与假定风险SNP有更大的重叠[5-7]。对于银屑病也很可能如此，全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出近100个风险位点，但迄今为止只有少数被精细定位并进行了功能研究[8]。虽然通过寻找功能性SNP可以改进精细定位[9]，但流行的资源如GTEx[10]、ENCODE[11]和ROADMAP[12]仅代表了人类基因组中已知功能变异的一小部分，且来自健康供体组织或特定疾病组织。因此，为了实现功能指导的定位，最好拥有针对特定疾病以及相关免疫细胞类型和生理状态（如微生物产物刺激）的功能基因组注释。

由于大多数致病SNP是非编码的，预测其效应基因并不简单。以往研究使用最近基因方法或最新的转录组全关联研究（TWAS）提名了银屑病风险位点的效应基因[8,13-15]。然而，如果依赖来自与疾病无关的标准组织的基因组注释，即使使用功能指导的精细定位工具，也可能遗漏真正的效应基因。为提高精细定位成功率，我们考虑了广泛的细胞和组织，并最大化来自与疾病相关的原代免疫细胞的功能注释[16,17]。具体而言，我们将来自48种GTEx组织的标准eQTL数据集[10,18]扩展为23种免疫细胞及其状态（来自已发表研究）的eQTL[18-22]。在此过程中，我们避免了来自遗传和表观遗传景观被扰动的细胞（如永生化细胞系或诱导多能干细胞）的功能读出。我们特别关注银屑病如同其他自身免疫病一样，可由感染触发[23,24]。因此，在本研究中，我们假设一些缺失的银屑病相关致病变异表现为响应免疫细胞激活刺激（如感染、疫苗或其他危险信号）的调控变异。基于这一工作假设，我们旨在对以往研究在标准组织及稳态条件下未鉴定出功能性SNP的已知银屑病风险位点进行精细定位。为实现此目标，我们试图添加已活化、受不同微生物配体挑战或具有先前抗原暴露记忆的免疫细胞的功能注释。

材料和方法

（本部分包括GWAS数据集和统计精细定位、GWAS关联与eQTL的共定位、与ROADMAP染色质状态的重叠等详细方法，因篇幅限制，译文略。关键点：使用来自64个风险位点的GWAS汇总统计进行SUSIE精细定位；从eQTL目录获取48种GTEx组织和23种免疫细胞的eQTL进行共定位（PP4≥0.8）；筛选与ROADMAP染色质状态的重叠。）

结果

统计精细定位

本研究采用SUSIE精细定位方法，对先前报道的64个银屑病风险位点（共67个中的64个）[15]中的致病SNP进行优先排序。我们首先通过常见结果说明实践要点。首先，与先导SNP强连锁的SNP有时可能是致病变异，因此仅关注先导SNP可能具有误导性。其次，强连锁不平衡使统计精细定位低效，需要功能注释或实验来优先排序。

我们展示了一个统计精细定位足以以强证据（后验概率≥0.95）优先排序最可能致病变异的例子（图1A）。然而，这种理想结果仅罕见出现（约9%，64个位点中的6个）。更多情况下（约36%，23/64），精细定位的确定性较低（后验概率远低于0.95）。此外，我们发现了7个风险位点（7/64），其中非先导SNP的后验概率等于或高于先导SNP。例如，图1C中，一个非先导SNP rs139691717具有强致病证据（PP=0.996），而先导SNP rs582757的支持度低（PP=0.433）。我们还遇到4个位点（4/65），其中先导SNP和一个或多个邻近SNP被共同推断为致病。最后，强连锁不平衡经常（约37%，24/65）使精细定位失效。

将GWAS SNP与来自48种GTEx组织和23种免疫细胞的eQTL共定位

与之前研究[8]类似，我们的统计精细定位优先排序了64个风险位点中的多个有希望的致病SNP。大多数风险位点被认为通过影响基因表达发挥作用[34]。为将优先SNP与近端基因表达联系起来，我们进行了eQTL共定位分析。总共，我们在69个（共71个分析的组织/细胞类型）中以10% FDR共定位了194个eQTL（PP4≥0.8）。其中39个与64个风险位点中的13个索引SNP处于强LD（r²≥0.8）（图2）。

在效应/记忆T细胞中优先排序的具有假定调控功能的致病SNP

我们使用SUSIE后验概率判断39个eQTL中是否有在13个风险位点内具有致病证据的。大多数（9个位点内）缺乏强致病证据，平均PP较低（≤0.1）。然而，我们的扩展免疫细胞面板（共23种不同表型）使我们能够发现并优先排序两个风险位点（分别以索引SNP rs10865331和rs582757为代表）中两个可能的功能性SNP（图2中水平虚线标示）。我们突出这两个eQTL是因为它们在特定细胞类型中起作用，便于实验跟进及功能注释验证。基于实际考量，我们聚焦于其中一个eQTL rs4672505（图2中水平虚线标示，在记忆Th1/17细胞中出现）。由于该eQTL在其他T细胞类型和GTEx组织中缺失，我们认为其功能仅限于记忆Th1/17细胞。这些记忆Th1/17细胞在原始研究中由表面标记集定义[19]，代表具有记忆表型的CD4+辅助1型和辅助17型细胞混合物（以下简称Th1和Th17细胞）。

效应/记忆T细胞特异性的活性染色质状态

这些Th1和Th17细胞的记忆表型表明它们之前曾遇到同源抗原，即通过TCR受体被特定外来（或自身）抗原激活[35]。因此我们假设，我们的eQTL位点rs4672505很可能位于一个调控元件上，该元件在初始CD4+T细胞转变为记忆状态时通过重塑染色质而开放。我们筛选了来自ROADMAP数据集的不同组织及免疫细胞中该位点的活性与失活染色质状态[12]。我们在造血干细胞、髓系细胞及大多数淋巴样细胞（B细胞和一些与CD4+辅助细胞不同的T细胞）中均未发现活性染色质峰（图3A）。在非免疫组织中同样未发现（S1图）。与我们的eQTL假设一致（仅记忆CD4+T细胞特有的eQTL，图2），我们在效应记忆T细胞中观察到清晰的细胞特异性染色质峰（图3B）：一个增强子（活性状态）和一个异染色质（失活）标记重叠。在NK细胞中也发现类似峰，但由于NK细胞定义（CD56阳性）可能包含其他免疫细胞（如αβT细胞、γδT细胞、树突状细胞和单核细胞）[36]而不可靠。我们得出结论，活性与失活染色质标记可明确归因于记忆T细胞。最后，多个T细胞亚型在B3GNT2基因（我们的eQTL效应基因）附近表现出转录相关的活性染色质状态（图3），支持转录相关状态在相关细胞类型中更具组成性，而效应记忆T细胞中的增强子相关状态则具有高度组织特异性[12]。

总之，我们的结果表明，eQTL目录中的免疫细胞特异性eQTL和ROADMAP的染色质标记提供了两条独立证据，证明精细定位SNP rs4672505（GRCh38.2:62333197:A/G）是一个调控变异。根据eQTL发现，G等位基因与记忆Th1/17细胞中B3GNT2基因高表达相关（图2），而替代A等位基因与低表达相关并增加银屑病风险。文献表明，B3GNT2蛋白缺失会减少T细胞CD28共受体的翻译后修饰，导致更强的T细胞活化。

讨论

统计精细定位本身不足以解析有希望的致病变异

我们表明，仅靠统计精细定位只能产出少数清晰的候选者用于实验跟进，这与当前领域观察一致。对于银屑病，最新的精细定位研究优先排序了14个具有高度可能调控功能的候选变异[8]。Dand等人报告了候选致病SNP、LD区块和多个基因（原始研究表10）。报告的因果SNP置信集平均大小为74 kb，包含数十个高度相关的SNP。精细定位分辨率差是由强连锁不平衡解释的，这源于现存人类种群特有的近期瓶颈事件[38,39]。在我们的研究中，对于大多数风险位点，统计精细定位同样不足以缩小到单个致病候选（图1）。强连锁不平衡常在研究人群中阻止精细定位（约90%为欧洲血统患者）[40]。多祖先GWAS数据[41]罕见，更多情况下通过功能注释指导的精细定位[42]来实现进一步优先排序。

功能注释协助的系统性精细定位

为在风险位点（索引SNP rs10865331）的连锁SNP中优先排序致病变异，我们添加了功能注释。通过向49种GTEx组织添加23种免疫细胞类型，我们共定位了仅在记忆Th1/17细胞中存在的eQTL，从而优先排序了一个潜在功能性SNP，其对邻近B3GNT2基因的表达具有细胞特异性调控效应。受影响的B3GNT2基因比该区域注释的其他近端转录本更远（图3A）。自最早的后GWAS研究起，基于最近基因原则和假设索引SNP致病，B3GNT2基因就被怀疑是效应基因[43,44]。该基因也因其接近先导SNP被提名为银屑病性关节炎的效应基因[45]。目前广泛接受的是，除非有功能指导的精细定位支持，否则选择最近基因作为效应基因可能具有误导性[3]。此外，风险位点中的先导SNP可能不是致病SNP，如我们在结果部分所示。最近，TWAS方法## 续上文翻译结果：

（接上段）此外，早期的银屑病研究均未同时推断与疾病SNP相关的细胞类型、分子机制（启动子、增强子或转录因子结合位点），或风险等位基因是增加还是降低效应基因表达。

假定致病SNP功能的位置与时机

我们的发现提示，携带rs4672505风险等位基因的银屑病患者记忆T辅助细胞中B3GNT2表达可能较低。B3GNT2编码一种高尔基体驻留酶——β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶2，该酶糖基化免疫细胞表面糖蛋白，从而调节免疫细胞信号[49]。在CD4+ T辅助细胞中，B3GNT2缺陷会降低CD28共受体的糖基化，使CD4+ T细胞在抗原特异性TCR刺激下出现高反应性。因此，我们假设风险等位基因携带者中B3GNT2低表达可能导致记忆T辅助细胞上CD28共受体修饰减少。CD28共受体为T细胞活化和增殖提供第二个重要信号。即，当初始CD4+ T细胞通过TCR识别其特异性抗原（“信号1”）时，它们还需要从表达B7的抗原呈递细胞接收CD28上的“信号2”。通常，抗原呈递细胞需要接触保守的微生物产物才能表达B7，从而确保所呈递抗原（信号1）与病原体入侵相关[50]。我们发现，遗传风险等位基因增强了记忆T辅助细胞中的信号2，并且这些记忆细胞在通过TCR再次接触同源抗原（信号1）时也依赖CD28共刺激[51]。这些细节对于理解B3GNT2相关风险因子如何参与发病机制至关重要。如前所述，该遗传风险因子可通过TCR增加CD+ T细胞对其同源抗原的敏感性。然而，对同源抗原（信号1）的敏感性取决于低糖基化的CD28，而CD28共受体仅在APC于存在保守微生物产物（可来自病原体，包括疫苗[52]）时表达B7的情况下接收“信号2”。综上，我们假设银屑病患者的记忆T辅助细胞在感染或疫苗接种背景下对再次暴露于自身抗原更加敏感，这与银屑病的已知特征一致。例如，银屑病常在患者遭遇感染或接种疫苗时发作、加重或复发[53-57]。我们的发现与越来越多的证据一致，即免疫介导疾病的致病变异可出现在动态调控元件中，这些元件在免疫细胞被激活前“保持静止”。

对后续实验的启示

我们的发现为引导实验研究提供了假设——关于在体外或体内测试的细胞类型和分子表型。具体而言，必须关注患者原代Th1和Th17细胞，而非重编程或操作过的细胞培养物，以重现致病SNP周围的独特染色质景观。可测试风险等位基因携带者与非携带者细胞群的B3GNT2基因表达以及CD28受体的多聚乳糖胺修饰。根据我们的假设，相关的致病表型必须是对同源抗原激活的敏感性增加。对于银屑病，可以测试已知的蛋白表位之一[61]。如果得到证实，多聚乳糖胺修饰、记忆T细胞甚至患者的感染都可能是潜在的治疗靶点。

结论

仅靠统计精细定位因强连锁不平衡而不足以优先排序大多数银屑病风险位点的致病变异。利用疾病相关细胞类型（例如记忆Th1/Th17细胞中的eQTL）的功能注释进行精细定位对于优先排序候选SNP（如rs4672505）及其效应基因（如B3GNT2）至关重要。我们的发现表明，rs4672505的风险等位基因可能降低记忆T辅助细胞中的B3GNT2表达，通过减少CD28糖基化导致高反应性。我们假设T细胞高反应性在表型上表现为对危险信号的响应，因为CD28共信号通常在抗原呈递细胞接触保守微生物产物后发生。