摘要
引言
持续性心房颤动（房颤）是美国成年人中最常见的心律失常，影响约270万人，且随着人口老龄化和心血管疾病生存率提高而日益普遍。房颤与中风、心力衰竭、功能能力下降和死亡率增加密切相关，常加剧左心室功能障碍。一旦形成，房颤会自我持续，心房牵张、炎症、心力衰竭和进行性纤维化导致电和结构重构，形成促进持续性心律失常的基质。尽管脉冲场消融和抗心律失常药物等进展改善了部分患者的预后，但房颤发病率和复发率仍居高不下，反映出迫切需要直接针对潜在心房病理（特别是功能性心房心肌细胞的纤维化替代）的疗法。
大型动物心脏疾病模型对连接机制洞察与临床干预至关重要，但目前的房颤临床前模型很少能再现人类疾病中的慢性化、纤维化和电生理复杂性。这些局限促使我们开发了一种稳健、可重复的尤卡坦小型猪房颤模型，更真实地模拟人类疾病状况。尤卡坦小型猪具有与人类相似的心脏解剖结构、心腔大小、传导系统组织和纤维化重构模式，是转化性心律失常研究的理想选择。
本文描述了一种新型小型猪房颤模型，旨在实现纵向监测、机制研究和治疗测试。我们工作的独特之处在于使用植入式内部心脏监测仪（ICMs）获取连续心电图记录，以确认心律失常诱导、跟踪房颤负荷并记录其持久性。同时，FitBark活动追踪器用于量化动物在窦性心律和房颤期间的行为和功能变化，增加了临床相关的生理终点。这些工具共同创建了一个全面的平台，重现了人类房颤的关键临床特征，为评估可能针对心房纤维化（疾病根本原因）的新干预措施提供了严格基础。
方法
动物研究与伦理考量
所有动物工作均在亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及亚利桑那大学动物护理（UAC）兽医人员的监督下进行。IACUC监督大学的动物护理和使用计划，负责审查和批准所有涉及脊椎动物的研究、教学和测试活动。合规信息包括：美国农业部注册号86-R-0003，NIH/OLAW保证号D16-00159，以及自1969年以来的AAALAC国际认证，认证号000163。动物至少每天观察一次，手术后增加监测频率。本研究中描述的方案已发表在protocols.io（DOI: x.doi.org/10.17504/protocols.io.yxmvm1p76v3p/v1），并作为支持信息文件1随本文提供。
动物准备
本研究纳入约一岁尤卡坦小型猪（N=6）。所有操作均获机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循ARRIVE指南。动物饲养在温度控制的设施中，采用12小时光照-黑暗周期。在富集环境中提供标准饮食和自由饮水以促进动物福利。研究遵守美国农业部和动物福利法规定，尽一切努力减少动物痛苦。
麻醉与手术方法
使用氯胺酮（11-33 mg/kg 肌注）和/或咪达唑仑（0.1-0.5 mg/kg 肌注）诱导麻醉。维持麻醉使用异氟烷（1-3%）直至手术结束。动物在起搏装置植入后接受丁丙诺啡缓释剂（0.12-0.27 mg/kg）以减轻疼痛和痛苦。手术准备期间遵循标准无菌技术。ICM皮下植入左胸部。对于起搏器植入，通过切开术进入右颈外静脉，预先松散结扎以减少出血。使用定制延长鞘和导丝形状将心房起搏导线定位在右心耳。Medtronic CRT-P设备皮下植入右胸部的小囊袋中。通过多导联心电图确认导线正确放置。
起搏方案：起搏器激活
起搏器植入一周后激活。快速心房起搏以400 bpm（150 ms周长）开始。如果房颤未持续，起搏速率逐渐增加至600 bpm（100 ms周长），以10 ms为增量。图1展示了ICM设备、起搏器发生器、编程器（Medtronic 2090）和Medtronic CareLink Encore。图2展示了这些设备如何在猪模型中协同工作。FitBark活动项圈24/7追踪活动水平，如图3所示。
安乐死
终点时，动物在深度麻醉下通过氯化钾注射实施安乐死。心电图确认无心跳后进行组织收获/尸检。
组织学
从左心房和右心房取心脏活检，用10%福尔马林固定并石蜡包埋，进行组织病理学评估。标本用10%中性缓冲福尔马林固定，转移至70%乙醇，处理成石蜡包埋切片。组织学切片用Masson三色染色评估心肌结构和纤维化。
影像学
使用Leica DMI6000B电动倒置显微镜在明场照明下和10x物镜下捕获染色组织切片图像。所有成像参数，包括曝光时间、白平衡和焦点，在样本间标准化以确保图像质量一致性。Tile扫描通过Leica Application Suite X（LAS X）软件拼接。图像通过亚利桑那大学光学成像核心设施（RRID:SCR_023355）获取。
图像量化
使用ImageJ分析图像测量胶原面积。设置比例：距离=0，已知距离=0，像素纵横比=1.0。将图像转换为RGB堆栈，并在蓝色通道中调整阈值以分离蓝色和红色像素。对照组织蓝色像素阈值设为130-210，房颤组织设为180-210；对照组织红色像素阈值设为0-100，房颤组织设为0-150。胶原和肌肉面积相对于总组织面积进行量化。使用SigmaPlot进行统计分析，采用非配对t检验，显著性P<0.05。
结果
几个程序性挑战需要迭代改进，以确保可靠的起搏和一致的心律失常诱导。手术适应，包括松散结扎减少出血、使用定制延长鞘和回撤导线输送技术，提高了起搏稳定性，而多导联心电图确认确保了导线准确定位。
结局评估
6只动物中有4只（67%）在开始起搏后80.3±22.3天内成功诱导出房颤，其中3只进入持续性房颤，1只进入阵发性房颤，如心电图（图4）和Kaplan-Meier曲线（图5）所示。记录并处理了包括自发转为窦性心律和快速心室反应在内的并发症率。一只动物自发恢复窦性心律，另一只因室性心动过速相关并发症死亡。起搏期间心室反应率在动物间差异很大（100-180 bpm）；一只动物的心室反应显著升高，接近200 bpm，对β-肾上腺素能和钙通道阻滞无反应。有趣的是，它们在正常活动期间的窦性心率从窦性心动过缓40-50 bpm到窦性心动过速超过200 bpm不等。即使动物未接受抗凝治疗，也未观察到血栓栓塞事件。
方案调整
方案改进随着时间推移减少了死亡率和起搏相关并发症。这包括在起搏期间频繁监测每只动物的心律。我们在起搏器植入一周后才开始起搏，以确保心房导线牢固固定在右心耳壁上。开始起搏后，我们密切监测每只动物的行为，确保它们没有遭受起搏的副作用。偶尔起搏会引起呃逆，因为横膈膜间歇性起搏，通过降低设备电压解决。一只动物每次起搏都会发生室性心动过速。尸检发现心房导线植入过近三尖瓣，因此起搏右心室而非右心耳。
尤卡坦模型支持持续数周的持续性房颤维持，与传统家猪模型形成对比，后者通常在约20天后因心力衰竭需要安乐死。在慢性化方面可与最近实现约6周房颤的Landrace快速起搏研究相媲美，此模型具有体型更小、更健壮的动物和连续心律监测的优势，使持续性房颤的长期研究成为可能。
活动监测
FitBark活动追踪器24/7记录的活动水平显示，持续性房颤发作时活动减少（图6）。据我们所知，这是首次在动物房颤模型中记录到活动减少的报告。这显示了该模型的临床相关性，即能够在动物模型中将持续性房颤的存在与生活质量下降联系起来。
组织学评估
Masson三色染色显示被诱导进入持续性房颤的动物心肌结构差异。总体而言，Masson三色染色中的蓝色反映富含胶原的细胞外基质和纤维结缔组织，包括间质和血管周围细胞外基质（ECM）成分。红色染色突出肌肉纤维和细胞质蛋白，主要反映有活力的心肌，包括心肌细胞和肌细胞。我们的数据显示ECM内纤维化增加，心肌组织显著减少（图7）。这种模式反映了功能性心房肌肉的丧失和富含胶原的ECM扩张，这种基质损害心房收缩力，破坏电传导，并促进房颤维持，从而支持该大型动物模型的临床相关性和转化保真度。
讨论
本研究介绍了一种技术增强的尤卡坦小型猪持续性房颤模型，结合了连续心律和活动监测。使用Medtronic Reveal LINQ™植入式内部心脏监测仪提供了不间断的心电图数据，使能够精确表征自由活动动物中房颤的发作、持续时间和心室反应。这种方法克服了先前大型动物房颤模型的局限性，这些模型通常依赖间歇性体表心电图或短期遥测，因此仅捕获心律失常负荷的有限快照。
Fitbark 2加速度计项圈的添加提供了连续、定量的行为数据，无需处理或约束。先前的房颤模型通常缺乏对心律失常期间自发身体活动或功能变化的客观评估。相比之下，此处使用的综合监测方法产生了一个全面的数据集，将持续性房颤的存在与实时活动模式联系起来。值得注意的是，与窦性心律基线相比，动物在持续性房颤期间活动减少，提供了与心律失常相关的功能变化的客观指标（图6）。这一观察结果与临床人群中房颤和运动能力下降之间的既定关联一致，并支持将活动测量作为临床前研究中生活质量下降和功能衰退的替代指标的相关性。
跟踪电和行为参数的能力增强了该模型评估治疗干预的效用。连续活动监测提供了一个功能终点，补充了心律分析，并允许评估干预是否影响房颤负荷和活动水平。这种双参数方法与当代房颤疗法的临床评估一致，后者需要将功能和生活质量指标与心律结果结合起来。
组织学分析
我们模型中的持续性房颤与心房心肌的明显结构重构相关。对左心房和右心房活检的Masson三色染色进行定量分析，显示纤维化增加，心房心肌组织相应显著减少，表明功能性心肌被纤维化瘢痕替代（图7）。这种纤维化增强和心肌细胞丢失的模式与长期房颤患者观察到的心房心肌病一致，支持我们的猪模型以高保真度重现维持和延续持续性心房颤动的组织病理学基质。
与先前房颤模型的比较
早期房颤模型使用家猪、山羊和狗。约克夏或Landrace等家猪品种生长迅速，使长期研究复杂化。相比之下，尤卡坦小型猪体型较小，使长期随访和饲养更容易。山羊（约50-70公斤）是最早用于慢性房颤的物种，而犬类如比格犬曾用于起搏诱导房颤。尤卡坦模型在类人心脏解剖和更小、更易管理的尺寸之间取得平衡，提高了长期研究的实用性和动物福利，这是家猪模型难以克服的挑战。
最近有关于转基因或光遗传学房颤模型的工作。重要的是，这些工作已在小鼠、大鼠和分离的心房组织中完成，研究人员开发了研究房颤机制的新方法，可能用于研究控制电活动和旋转子的作用。这些方法可能有助于基于这些平台开发新疗法，但最终必须在持续性房颤的大型动物模型中进行调查。我们的模型提供了一个理想的原型，研究者可以定义房颤的精确发作时间、持续时间及其对临床活动的影响。最后，来自我们模型的组织将提供基因和蛋白质分析，在临床相关模型中。
我们的模型通过约400次/分钟（bpm）的右心耳慢性快速心房起搏诱导房颤。这种连续心房快速起搏方法模仿了山羊、狗和猪的经典实验，表明维持高心房率数天至数周可通过电重构产生自持续房颤。在一项开创性的山羊研究中，11只山羊中有10只在连续快速心房起搏约7天后房颤变得持续（>24小时）。同样，在犬模型中，以400 bpm连续右心房起搏6周创建了一个基质，使房颤易于诱发并维持长时间。
先前的猪模型使用不同的起搏策略，成功程度各异。早期猪房颤尝试通常涉及突发起搏，在右心房传递短、高频脉冲以触发心房颤动。虽然这种突发可以引发房颤发作，但通常只持续几秒到几分钟，然后自行终止。在急性猪模型中，顺序起搏和迷走神经刺激（新斯的明）可导致房颤，但发作平均仅持续约3.6分钟，78%自发恢复窦性心律。没有延长起搏，标准家猪难以维持持续性房颤。2004年的一项研究使用极端心房突发起搏（42 Hz，约2500 bpm）和植入式起搏器在猪中实现持续房颤。房颤在约5天后变得持续，但导致快速心室反应（约274 bpm），在2-3周内导致心动过速性心肌病和心力衰竭。
我们先前在尤卡坦小型猪中对其他心脏疾病的研究表明，该模型在研究心肌梗死后心力衰竭、开发治疗心力衰竭的免疫调节以及COVID期间缺乏社交对身体活动的影响方面非常有价值。此外，我们的团队最近完成了对跨大小动物物种的房颤动物模型的全面综述。
局限性
可以进一步调查额外的组织学、超声心动图和磁共振成像（MRI）分析，以进一步表征与该模型相关的心房重构和纤维化。重要的是，本研究中使用的起搏设备和定制软件不再可用，这可能会影响刺激方案的直接复制。尽管存在这些限制，本文描述的方法为在大型动物模型中研究房颤病理生理学和评估新兴治疗策略提供了一个稳健且可重复的平台。
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