在描述生物制品制造时，科学家们长期以来一直认为"工艺定义产品"。在细胞和基因治疗(CGT)产品领域，这一说法尤为准确。与通常可以充分表征的重组蛋白不同，CGT产品复杂多变，高度依赖生物源材料和工艺控制。这种复杂性使得仅靠质量控制(QC)测试无法完全表征产品。
遗憾的是，一些CGT行业代表重复了误导性说法，称"工艺不是产品"，暗示只要产品通过QC和表征测试，制造工艺的变更就无关紧要。对于CGT产品而言，这种观点过于简单化，存在危险。
生物制造工艺的每个要素，从原材料和组分到工艺参数，都可能影响最终产品的特性。虽然QC测试和表征不可或缺，但无法完全预测临床表现或捕捉疗法生物活性的细微变化。这就是为什么必须在CGT产品开发早期就融入质量源于设计(QbD)原则。QbD为理解工艺输入和参数如何驱动产品质量建立了科学基础。
基因治疗制造的QbD框架
什么是QbD？人用药品技术要求国际协调会议(ICH)将"质量源于设计"定义为"一种系统化的开发方法，从预定义目标开始，强调基于科学和质量风险管理的产品和工艺理解及工艺控制"(1)。简单来说，QbD意味着从一开始就将质量设计到产品中，而不是在工艺结束时进行质量测试。
QbD框架的核心组件包括：
• 目标产品概况(TPPs)，定义产品的临床和质量目标
• 关键质量属性(CQAs)，即影响安全性和有效性的产品特性(例如，效力、纯度、载体基因组完整性)
• 关键工艺参数(CPPs)，需要严格控制的工艺变量，因为它们直接影响CQAs
• 关键性能参数(KPPs)，与CQAs独立的指标，用于跟踪工艺健康和一致性。
这些要素共同构成了基于科学的控制策略基础。A-Gene倡议是将QbD概念应用于基因治疗制造的首批努力之一——比正式指导文件发布早了数年(2)。A-Gene证明，应用QbD原则可以显著减少工艺变异性，提高理解，并加速监管协调。
建立有效的制造控制策略
控制策略是实施QbD的支柱。对于基因治疗产品，这包括：
• 输入材料控制——例如，细胞库、质粒、病毒种子和原材料的资质认定
• 工艺控制——整个制造过程中对转染效率、载体浓度、培养条件和其他CPPs的在线监测和控制
• 分析测试，例如评估CQAs用于放行和可比性的表征分析
• 工艺验证，或证明工艺始终能生产出属性在规定控制限内的材料。
控制限通常分为操作限、警戒限、行动限和规格限。多层级方法允许在工艺偏移影响产品质量之前及早检测。
为基因治疗产品建立控制限和规格(例如，验收标准、方法和程序)极为困难。大多数制造商基于历史范围来证明验收标准的合理性。以效价测定为例：由于此类测定通常使用具有内在变异性的基于细胞或生物的测定方法进行，因此最初将验收标准设定为较宽的范围。
对于大多数CGT产品，在开发的任何阶段，总体验收标准都不是根据临床有效性定义的。不符合验收标准或在效价等CQAs处于低范围的产品，并不能从临床角度证明其无效。例如，关于基于嵌合抗原受体(CAR)T细胞的产品，效价测定结果与临床有效性之间通常没有相关性。因此，监管机构愿意根据制造能力设定验收标准，使用测试来确保制造一致性，而非临床有效性。
将CQAs与临床相关性联系起来
CGT制造中的一个持续挑战是确定哪些CQAs具有临床相关性。效价提供了一个启发性的例子。对于传统生物制品，效价测定通常但并非总是与临床疗效良好相关。然而，在基因治疗中，效价测定通常仅限于测量体外生物活性，这可能无法预测体内治疗效果。美国食品药品监督管理局(FDA)将"效价"广泛定义为"产品实现特定生物效应的特定能力或容量"(3)。生物效应被广泛解释为CGT使用相关生物测定在体外发挥作用的能力，而不要求效价测试与临床有效性相关。因此，制造商通常缺乏能以统计置信度反映临床疗效的验证测定方法。
然而，识别可与临床疗效相关联的CQAs不应仅仅是一个理想目标。在讨论实验设计(DoE)方法作为定义"设计空间"的工具之前——即产品质量(通过CQAs测量)不受显著影响的范围——重要的是回顾CQAs是如何定义的。
对于大多数CGT产品，最难的步骤是根据生物活性定义产品质量。识别CQAs涉及一个迭代过程，其中候选CQAs最初通过基于矩阵的方法定义。对于基于腺相关病毒(AAV)载体的假设产品，这些属性可以通过测量产品纯度(AAV衣壳空壳与满壳的比例)、病毒感染性或效价(通过体外基于细胞的转导表达测定测量)来定义。
理想情况下，这些属性将在开发过程中进行测量，然后在临床试验中与产品有效性相关联。但已发表的结果并未提供证据表明为AAV产品测量的CQAs(如验收标准所定义)可以与最终产品有效性一致相关。原因可能多种多样，但从根本上讲，缺乏明确的相关性反映了AAV产品作用机制(MoA)的复杂性，这取决于包括患者免疫反应和产品在体内靶向正确细胞类型的效率等因素。
由于CQAs不一定能预测体内产品有效性，制造商应优先考虑在早期风险评估中突出的属性。这反过来可以促进使用DoE定义CPPs。由于这种不确定性，监管机构采取了务实的方法，接受基于风险评估和科学原理的CQAs，同时要求制造商随着时间推移收集数据来收紧验收标准。
图1总结了在产品开发周期中优先考虑相关CQAs(那些可与临床有效性相关联的CQAs)的推荐方法。第一步涉及识别候选CQAs，这在TPP和MoA完全确定后是可能的。对于假设的AAV产品，关键属性可能包括感染性、效价(通过转导表达和功能测定确定)以及空:满衣壳比例。这些属性在使用合格测定方法测量时，可以在1期研究期间收集并与临床结果相关联，之后在生物制品许可申请(BLA)提交前关键研究的临床数据解盲时进行。进行此类练习并非易事；它需要大量的数据收集和分析，并辅以人工智能(AI)。在此背景下，AI应被视为一种变革性工具，帮助科学家更好地评估和优先考虑与产品有效性相关的CQAs(4)。
图1: 使用人工智能(AI)工具对细胞和基因治疗(CGT)关键质量属性(CQAs)进行前瞻性识别和优先排序
这一过程难以建立，应被视为一个理想模型，可能为加速审批前和审批后制造变更提供机会。
定义CPPs并将其与CQAs联系起来
DoE是定义工艺参数变化预期不会影响产品CQAs的范围的有力工具(5)。以典型的CAR-T产品为例。可能影响CAR-T制造的工艺参数包括工艺温度、培养基成分以及优化以增强细胞扩增的变量(如工艺时间、pH值、有毒代谢物浓度和搅拌速率)。
识别可能影响产品CQAs的CPPs是第一步，随后是选择适当的方法来评估这些因素如何相互作用。由于在实验上评估不同因素之间的相互作用几乎是不可能的，CGT领域开发了替代方法来进行DoE。我使用过的最强大的方法之一是"部分因子设计"，它通过在基于矩阵的环境中测试所有理论相互作用的子集，来确定CPPs与产品质量属性之间的负相互作用和正相互作用(5)。
保持在配置的设计空间内可控制制造一致性。因此，设计空间可以作为进行制造变更而无需完整可比性研究的有力工具；这种方法在CGT制造中很少使用，但在其他定义更明确的生物制品中更为常见。从监管角度看，为不同CPPs识别设计空间可能是CGT领域使用最少的练习。理解设计空间是确定"既定条件"的有用方法，在这些条件下，制造变更可以说不会影响产品的CQAs。
制造变更后的可比性建立
制造变更是不可避免的。随着产品向商业化推进，放大、自动化和工艺优化通常在开发后期引入。每次变更都必须进行评估，以确保产品质量、安全性和有效性的可比性。
关键指导文件包括：
• FDA和欧洲药品管理局(EMA)关于CGTs和先进治疗医药产品(ATMPs)可比性的指南(6-12)
• ICH Q5E《生物技术/生物产品可比性》(13)
• ICH Q8-Q12，为药物开发、风险管理、生命周期管理提供框架(1, 14-17)
• ICH M4Q(R1)，总结药品注册通用技术文件中的质量关注点(18)。
这些文件强化了可比性以数据为驱动的原则。监管机构可能会根据拟议变更的潜在影响要求分析、非临床，有时甚至是临床数据。
考虑一个从小型(2L)转向大型(200L)生产的假设AAV载体工艺。该制造变更的分析可比性研究应检查：
• 载体滴度和基因组完整性(CQAs)
• 转染效率和收获条件(CPPs)
• 杂质谱和效价测定结果
• 基于等效性测试或容差区间(TIs)的统计评估，而非传统的t检验。
对可比性评估的结构化方法使监管机构确信观察到的差异在可接受范围内，并且在临床上没有意义。
分析、统计和验证考虑因素
稳健的分析和统计方法是可靠可比性和QbD实施的基础。用于测量CQAs的所有分析方法必须适合其用途，并经过准确性、精确性、特异性和线性的验证。由于CGT测定通常比其他药物模式具有更高的变异性，因此建立适当的验收标准至关重要。
关于统计方法，我建议使用等效性测试或TIs来比较制造变更前后的产品批次。避免过度依赖t检验，因为t检验通常被误用于小样本、高变异性的数据集。当多个CQAs相互作用时，应用多元统计过程控制(MSPC)。
使用双向单侧检验(TOST)建立等效性
CGT产品通常数据集较小，样本量通常为三到五个批次。TOST是显示等效性的首选方法，因为它适用于使用小样本量建立相似性(5)。用于建立等效性验收标准(EAC)的公式很复杂，但它旨在考虑起始材料变异性、工艺和分析变异性以及基于历史标准偏差的其他因素。
另一种有用的方法是建立可比性范围，这通常基于统计区间计算，如TI或最小-最大范围。TI可以估计数据范围，其中指定部分(例如，中心90%)的底层总体单位被认为以给定置信度(例如，95%)被覆盖。如果所有测试批次都落在从参考批次计算的90%/95% TI内，则建立可比性。
需要注意的是，传统的配对t检验不适合建立相似性。配对t检验通常用于确定在两种不同条件下收集的数据是否不同。通常，生物制药行业通过拒绝零假设(即两个总体不同)来使用t检验进行可比性。然而，拒绝差异的零假设并不能在统计上证明两个总体相似。
使用等效性方法进行样本量计算允许评估小队列。一旦选择了适当的测试(如TOST)，可使用JMP软件等商业可用程序根据相关输入确定样本量。例如，要计算在两个站点制造的产品之间建立可比性所需的样本量，统计学家可能会利用历史标准偏差、估计的平均差异以及各种质量属性的EACs。
挑战与实用建议
在CGT项目中实施QbD仍然面临诸多困难。团队在开发早期通常对产品和工艺的知识有限。批次规模往往较小，产品表现出高变异性。体外测定与临床结果之间的相关性仍然有限。监管期望也在不断演变。
团队可以通过以下方式应对这些挑战：
• 在关键试验前引入QbD，以前瞻性地进行数据收集和工艺理解
• 主动与监管机构接触，就CQA定义和可比性计划达成一致
• 使用平台技术和DoE方法系统地评估工艺变量
• 尽早规划生命周期变更，认识到放大和自动化是不可避免的。
CGT质量、安全性和有效性的关键推动因素
QbD原则可以系统地应用于CGT制造，以建立稳健的控制策略，并确保产品在其生命周期内的可比性。与传统生物制品不同，CGT高度复杂且多变，仅靠QC测试无法完全表征产品。因此，制造工艺本身定义了产品，工艺理解成为质量的基础。
QbD的核心组件——例如，TPP、CQAs、CPPs和KPPs——可以整合到基于科学的风险评估和控制策略中。本文中，我强调了CQAs的临床相关性、将效价测定与疗效相关联的挑战，以及在评估放大或自动化实施等制造变更后的可比性时对统计严谨性的需求。
最终，QbD不仅仅是一项合规性工作；它是基因治疗中质量、安全性和有效性的关键推动因素。对于CGT，工艺和产品密不可分，结构良好的QbD框架确保两者将在科学和监管控制下共同演进。
【全文结束】