新型前交叉韧带重建生物增强疗法：自体前交叉韧带来源细胞重新接种肌腱移植物的临床前验证 - 干细胞与抗衰老

摘要

背景

目前治疗破裂前交叉韧带(ACL)的标准方法是ACL重建术(ACLR)，即用肌腱移植物替换撕裂的韧带。植入的肌腱移植物会经历一个称为韧带化的成熟过程。然而，通常存在于较弱瘢痕组织中的III型胶原蛋白的合成继续以较高浓度存在，且天然ACL中不同直径胶原纤维的异质组成从未恢复。先前研究表明，培养扩增的前交叉韧带来源细胞重新接种到肌腱移植物上，有可能增强韧带化过程。我们进行了体外和体内研究，评估使用脱细胞肌腱移植物与前交叉韧带来源细胞及无细胞十字韧带基质(ACLM)粉末相结合进行ACLR的结果，其中ACLM粉末作为生物支架。我们假设这种组织工程构建体将增强ACLR后移植物的成熟过程和机械性能。

方法

从接受ACLR手术且在受伤后4周内的患者ACL残余组织中获取并分离前交叉韧带来源细胞。从人体ACL和后交叉韧带组织制备ACLM。将45只Sprague Dawley大鼠随机分为3组：标准同种异体移植物组、仅ACLM粉末注射组以及前交叉韧带来源细胞和ACLM粉末联合注射组（即目标组）。将前交叉韧带来源细胞与ACLM粉末混合，然后在ACLR前注射到脱细胞肌腱移植物中。

结果

体外实验发现，将ACLM粉末与前交叉韧带来源细胞结合可改善细胞在肌腱细胞外基质中的存活和整合，从而成功移植前交叉韧带来源细胞。动物ACLR实验通过组织学证实，在重新接种了前交叉韧带来源细胞和ACLM粉末的移植物中，细胞数量、化生和胶原波纹恢复方面的结构成熟度得到改善。与对照组相比，I型胶原的增强基因表达导致肌腱移植物具有更优越的机械性能。

结论

植入重新接种培养扩增的前交叉韧带来源细胞和ACLM粉末的肌腱移植物，增强了肌腱移植物的成熟过程和机械性能。我们提供了体外和体内概念验证证据，支持将前交叉韧带来源细胞与ACLM粉末作为生物支架重新接种到肌腱移植物上用于ACL重建的有效性。

图形摘要

背景

由于破裂的滑膜鞘和破裂韧带与关节内滑液的直接接触，破裂前交叉韧带(ACL)的自发愈合通常失败。目前治疗破裂ACL的标准方法是前交叉韧带重建(ACLR)，即用肌腱移植物替换撕裂的韧带。自体移植物和同种异体移植物在考虑ACLR的移植物选项时都是可行的选择。然而，无论移植物类型如何，植入移植物的机械性能在ACLR手术后都无法恢复正常。尽管据报道植入的移植物在1年后会经历重塑，但即使在2年后，完整ACL的机械强度也无法恢复。动物研究表明，愈合移植物的机械性能（如失效载荷）仍低于天然ACL的50%至60%。一项检索髌腱自体移植物的人体病例研究发现，索引手术后18个月，植入移植物的很大一部分持续存在坏死和无细胞现象。

ACLR期间植入的肌腱移植物会经历一个称为韧带化的成熟过程。据报道，宿主成纤维细胞早期流入移植物的坏死区域，随后是肌腱移植物的重塑。然而，通常存在于较弱瘢痕组织中的III型胶原的主要合成继续以较高浓度存在，且天然ACL中不同直径胶原纤维的异质组成从未恢复。

为克服这种导致较弱修复性瘢痕组织的耗时愈合过程，已尝试涉及成纤维细胞或干细胞移植、基因调控和生物工程的组织工程策略，以增强ACLR结果。几项研究表明，破裂的人类ACL组织拥有大量促进愈合和多系分化的细胞。在最近的一项体外研究中，我们证明将培养扩增的ACL来源细胞重新接种到脱细胞肌腱移植物上，增强了移植物在肌腱细胞外基质(ECM)中存活和整合的能力，与来自脂肪组织的间充质干细胞相比，可能产生更高的I型胶原基因表达水平，从而可能导致正常的韧带化过程。然而，有研究表明，大多数移植的干细胞由于宿主组织中缺氧、营养不良、炎症和缺乏生物物理保护等严酷条件，在植入后1周内死亡。ECM通过调节细胞-基质相互作用提供影响细胞命运的物理结构，研究已证实组织来源的无细胞基质作为细胞载体或生物支架的有效性。Xu等人报告称，在动物模型中将无细胞软骨基质应用于骨髓干细胞，通过促进软骨细胞分化，有效修复了关节软骨缺陷。Mao等人发现，应用源自软骨细胞的无细胞基质促进了原代软骨细胞的快速扩增并减少了体外去分化。然而，无细胞十字韧带基质(ACLM)对ACL来源细胞（特别是在肌腱微环境中的作用）尚未经过测试。在本研究中，我们进行了体外和体内实验，评估使用脱细胞肌腱移植物与前交叉韧带来源细胞结合ACLM粉末作为生物支架进行ACLR的结果。我们假设这种结合生物支架的干细胞移植疗法将增强移植物的成熟过程并改善ACLR后肌腱移植物的机械性能。

材料和方法

患者

本研究遵循机构指南，并获得OO医院伦理委员会批准。所有患者在参与前提供书面知情同意（IRB-2022-01-049）。2022年8月至2023年12月期间，从15名（12名男性和3名女性）平均年龄为29.3±2.2岁（范围为17至41岁）的患者中收集了在受伤后4周内接受初次ACLR的患者ACL残余组织中的ACL来源细胞。ACLM粉末是从2名骨关节炎患者（60岁和62岁）在全膝关节置换术期间收获的人体ACL和后交叉韧带(PCL)中提取的。

ACL来源细胞的分离和制备

分离ACL来源细胞和表征培养扩增的ACL来源细胞的程序此前由Park等人描述。使用剪刀将ACL残余组织解剖成长度<1厘米的片段。这些组织片段用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并使用I型胶原酶(Gibco, 17100-017; Sigma, C0130)在无血清DMEM中以1毫克/毫升的浓度进行酶消化，补充青霉素-链霉素(Thermo Fisher, 15140122)，随后在37°C下摇动孵育3至4小时。将细胞悬液通过70微米细胞过滤器(SPL, 93070)过滤，离心后弃去上清液，从沉淀中分离细胞。分离的ACL来源细胞培养至第2代，每2至3天更换培养基。之后，将分离的ACL来源细胞在-80°C深冻保存，随后储存在液氮中以长期保存。所有实验均使用第3代(P3)的ACL来源细胞。培养扩增的ACL来源细胞的详细细胞表征此前已发表。

ACLM粉末的制备和浓度测定

ACLM是使用基于先前研究的改良方案制备的。按照无菌程序从供体收集人体ACL和PCL组织。将收获的ACL和PCL组织切成<1厘米大小的块，并在-80°C下冷冻。将冷冻组织研磨成粗粉，并在1%（w/v）PBS中的十二烷基硫酸钠溶液中振荡72小时以促进脱细胞。样品在PBS中0.1%（w/v）乙二胺四乙酸溶液中处理24小时，然后在大量去离子水中浸泡过夜以去除残留化学物质。彻底洗涤后，将所得ACLM在-80°C下冷冻，并冻干3天以确保完全脱水。随后将ACLM研磨成细粉，以便于与细胞混合。应用低剂量（25 kGy）伽马辐照（通常用于通过破坏微生物DNA并使病原体失活来有效灭菌）对冻干的ACLM进行灭菌，并在-20°C下储存以备后用。

使用先前报道的研究确定接种效率。简而言之，将3.75×10^5个ACL来源细胞（第3代）与浓度为10、30和60毫克/毫升的ACLM粉末混合，并注射到每个脱细胞大鼠跟腱移植物中。孵育24小时后，收集上清液和孔底部的细胞，使用血细胞计数器计数非粘附细胞。使用公式计算接种效率：接种效率 =（初始细胞数 - 非粘附细胞数）/初始细胞数 × 100%。

移植物制备

对于体外实验，我们使用了韩国公共组织库提供的12条捐赠人脱细胞胫骨肌腱同种异体移植物。所有肌腱同种异体移植物均按照标准方案进行脱细胞和灭菌处理。最初，肌腱同种异体移植物剥离肌肉组织，并用无菌蒸馏水洗涤5分钟。接下来，肌腱移植物用3%过氧化氢处理5分钟，用70%乙醇处理15分钟。所有洗涤程序重复3次。应用低剂量（25 Gy）伽马辐照进行灭菌，并将肌腱同种异体移植物在-80°C下冷冻。

对于动物实验，从成年Sprague Dawley（SD）大鼠（n = 23；年龄 = 10周）中获取跟腱移植物（n = 46），这些大鼠在牺牲时正用于其他非肌肉骨骼实验。通过在跟腱处做侧皮肤切口获取肌腱移植物，并在跟骨插入区域横向切断肌腱。修剪相邻组织后，在近端横向切断肌腱以获得整个跟腱移植物。所有移植物立即用无菌纱布包裹，并储存在-80°C冷冻器中以备后用。

体外实验

体外实验随机分为3组进行：标准同种异体移植物组、仅ACL来源细胞注射组和ACL来源细胞与ACLM粉末联合注射（目标）组。人胫骨同种异体移植物在室温下解冻15分钟，并切成1.5厘米长的片段。每个目标组使用来自同一供体的组织以保持一致性。在目标组中，将1×10^6个ACL来源细胞（P3）与ACLM粉末混合制成150微升细胞悬液，然后使用25号针头注射到肌腱片段中。对于对照组，将150微升PBS或ACL来源细胞的悬液注射到肌腱移植物中，不与ACLM粉末混合。在移植物核心进行单次注射，并仔细监测是否有泄漏。注射后，将重新接种的肌腱片段在5% CO2环境中孵育20分钟。然后将片段转移到补充了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM（SH30243.01, Hyclone, USA）中。每3天更换一次DMEM生长培养基。在指定的收获日（接种后1、7和14天），将肌腱片段完全嵌入Tissue-Tek最佳切割温度(OCT)包埋剂（4583, Sakura, Japan）中，并在-80°C下储存。将冷冻组织块纵向切片成6微米厚。这些切片用于组织学和免疫组织化学分析，并储存在-80°C深冻冰箱中的玻璃载片上。

体内ACL重建

OO的动物实验伦理委员会审查并批准了大鼠方案（2023–0095 A）。SD大鼠从KOATECH（韩国平泽）获得。仅选择无特定病原体的动物，并在实验前的适应期内排除任何异常或濒死动物。45只10周龄的骨骼成熟雄性SD大鼠在手术时随机分为3组（每组n = 15只大鼠）（图5A）：标准同种异体移植物组、仅ACLM粉末注射组和ACL来源细胞与ACLM粉末联合注射组。目标组和对照组的样本量基于先前与ACL重建相关的研究确定。实验前在室温下将冷冻大鼠跟腱移植物解冻15分钟。大鼠跟腱移植物的平均长度为12.8（±0.554）毫米，平均直径为1.71（±0.018）毫米。测试移植物以确定适当的注射体积，使用15微升PBS溶液未观察到泄漏（补充图1A）。基于接种效率实验，将3.75×10^5个ACL来源细胞（P3）与ACLM粉末（30毫克/毫升）混合，并加入DMEM使总悬浮液体积达到15微升。使用31号、0.3毫升胰岛素针头（BD, 328822）进行移植物注射，并将样品在5% CO2培养箱中孵育。

使用异氟醚吸入（Med-Vet International, RXISO-100）麻醉SD大鼠。去除左后腿的毛发后，用乙醇和聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。在膝关节前内侧做一个2厘米长的皮肤切口，并将髌骨向外侧脱位以暴露关节。用锋利的手术刀完全切断ACL。使用先前准备的跟腱移植物复合物进行ACL重建。在股骨和胫骨中创建骨隧道（2.0毫米），并将移植物固定在股骨外侧髁或胫骨内侧结节上方的骨膜和周围软组织上（补充图1B）。术后，允许动物自由活动而无任何限制。动物实验室保持在22°C的温度下，具有12小时光照/黑暗周期。每个笼子饲养3只大鼠，使用耳标进行识别。每组15只大鼠在术后4周（n = 4；仅组织学）或8周（n = 11）实施安乐死。动物安乐死使用二氧化碳（CO2）。收获带有两端附着骨骼的天然和重建ACL。随后评估以下参数：组织学分析（n = 4）、mRNA分析（n = 3）、力学测试和微CT分析（n = 4）。组织学分析的样品在室温下用10%福尔马林固定24小时，用1×PBS洗涤三次，并在室温下用10%甲酸脱钙约一周。随后，制备石蜡块。对进行动物实验和分析组织病理学的研究人员应用单盲法。该工作已按照ARRIVE指南2.0报告。

组织学分析

将冷冻切片切至6微米厚度，石蜡切片切至3微米用于组织学分析。染色程序遵循制造商说明中的标准协议。苏木精和伊红（H&E）染色用于组织学和细胞学评估，而Picrosirius红（PSR；Abcam, ab150681）用于分析I型和III型胶原。所有染色载片均使用永久介质（Vector Labs, H-5000）封片。在200倍放大倍数的明场显微镜下观察肌腱同种异体移植物内的细胞图像，并跨5张连续载片计数细胞。所有测量均由2名相互不知情的独立观察员分析。

分析移植物细胞数量、坏死和胶原波纹以确定移植物成熟的程度。细胞数量基于Dong等人描述的主要核形状。给出五个等级如下（光学显微镜，×200）：0级，圆形核最常见；1级，梭形核最常见，其次是圆形核；2级，梭形核最常见，其次是椭圆形核；3级，梭形核最常见，其次是线性核；4级，线性核最常见，其次是梭形核。移植物坏死基于Falconiero等人描述的具有化生（无细胞、无血管和方向不规则的胶原束）的移植物程度。分配五个等级如下（光学显微镜，×200）：0级，无化生；1级，轻微化生；2级，局灶性化生区域；3级，气泡状化生区域；4级，大面积化生。在偏振光显微镜下使用纵向载片的Picrosirius红染色来评估胶原纤维的组织，根据Zhao等人描述的标准进行分类。大量波纹的特点是一致的带状结构，具有可见的波形。中度波纹的特点是波形减少，带状缺失，胶原纤维部分拉直。最小波纹涉及大量拉直的胶原纤维区域。

免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学染色。简而言之，使用Neo-Clear对载片进行脱蜡，用一系列乙醇溶液（100%至50%乙醇）重新水化，并用蒸馏水和1×PBS洗涤三次。然后将载片在含有0.3% Triton X-100的1×PBS中孵育10分钟，随后在BLOXALL（SP-6000, Vector Lab）中孵育30分钟。载片在室温下用抗体稀释液（S3022, DAKO, USA）中1:200稀释的初级抗体孵育1小时，然后用生物素化抗兔免疫球蛋白G次级抗体（BA-1000, Vector Lab）与正常马血清（S-2012, Vector Lab）混合孵育1小时。接下来，按照制造商说明将载片与ABC试剂盒组分（PK-6102, Vector Lab）孵育30分钟，随后与DAB底物试剂盒（SK-4100, Vector Lab）孵育1至5分钟。最后，将载片用蒸馏水洗涤5次，用苏木精（1.05174.0500, Merck, Germany）复染10秒，通过一系列乙醇溶液（50%至100%乙醇）脱水，并用永久封片介质（H-5000, Vector Lab）封片。使用Nikon Eclipse Ti-U显微镜捕获染色细胞的图像。用于免疫组织化学的抗体为COL1A1（Santa, sc-8784；稀释度1:200）和COL3（ABclonal Technology, a3795；稀释度1:200）。使用正常样品制备阳性和阴性对照。阳性对照在与实验样品相同的染色条件下处理，而阴性对照除了在染色过程中省略初级抗体外，处理方式相同。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）量化免疫组织化学图像的强度。选择感兴趣区域（ROI），并测量每个样品的平均灰度值以评估胶原表达水平。

免疫荧光

在体外实验中，组织载片在100%冷丙酮中固定10分钟，随后用水洗涤10分钟以去除OCT包埋剂（SAKURA, 4583）。对于动物实验，使用Neo-Clear进行脱蜡，用一系列乙醇溶液（100%至50%乙醇）重新水化，并用蒸馏水和1×PBS洗涤三次。将载片用1×PBS洗涤三次，在含有0.3% Triton X-100的1×PBS中处理10分钟，并在室温下用BLOXALL（Vector Lab, SP-6000）封闭30分钟。组织载片在4°C下与初级抗体（在抗体稀释液中稀释1:100，DAKO, S3022）过夜孵育。孵育后，将载片用1×PBST洗涤三次，在室温下与Alexa 488或Cy3偶联次级抗体（在抗体稀释液中稀释至1:100）孵育1小时，并使用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vectorlabs, H-2000）的介质封片。使用共聚焦显微镜（Leica Microsystems）获取图像。使用的初级抗体为Ki-67（Invitrogen, 14-5698-82）、I型胶原（Santa, sc-8784）或YAP（ABclonal, A1002）。使用正常样品制备阳性和阴性对照。阳性对照在与实验样品相同的染色条件下处理，而阴性对照除了在染色过程中省略初级抗体外，处理方式相同。

使用抗人核抗体（Ku-80, Cell Signaling, 2180 S）进行移植后细胞的体内追踪。在移植后4周和8周，对Ku-80和I型胶原（Santa, sc-293182）进行共免疫荧光染色，并使用共聚焦显微镜获取图像。

免疫印迹

使用涉及含有磷酸酶抑制剂（Cell Signaling, 5870 S）和蛋白酶抑制剂（Calbiochem, 535140）的1×RIPA缓冲液的标准程序从ACLM中提取蛋白质。使用Bradford测定对提取的蛋白质进行定量。随后，将2、4和8微克蛋白质用于免疫印迹。免疫印迹过程中的初级抗体为I型胶原（Santa, sc-8784）。

RT-qPCR

在体外实验中，使用细胞刮刀刮取组织载片以收集mRNA分析材料。对于动物实验，从牺牲的大鼠膝组织中收集重建的肌腱移植物进行mRNA分析。RNA提取遵循使用TRI试剂的标准程序。对于定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）扩增，使用1微克RNA生成互补DNA（cDNA）。获得的cDNA用作RT-qPCR的模板。

生物传感器DNA构建体

使用荧光共振能量转移（FRET，一种通过检测两个荧光分子之间距离变化来监测分子相互作用或结构变化的技术）识别生物分子或监测环境变化的Talin-TS（质粒#83376）和Lyn-FAK（质粒#78299）生物传感器从Addgene获得。简而言之，Talin-TS包含一个张力模块，其中容纳两个荧光蛋白，用于测量与整合素β尾部结合的talin头部结构域和包含肌动蛋白结合位点和vinculin结合位点的杆状结构域之间的张力。Talin是一种关键的细胞骨架蛋白，将整合素（细胞表面受体）连接到内部肌动蛋白细胞骨架，促进细胞粘附和机械信号传输。当肌动蛋白丝对Talin-TS施加张力时，张力模块内的纳米弹簧延伸，增加两个荧光蛋白之间的距离。Lyn-FAK生物传感器的核心元件是FAK底物序列，该序列通过柔性连接子与c-Src的SH2结构域紧密连接。FAK或粘着斑激酶是一种信号蛋白，有助于传递涉及细胞运动、附着和存活的机械和化学信号。FAK的激活促使磷酸化底物肽与SH2结构域结合，引发构象变化，导致荧光共振能量转移减少。该功能元件与靶向对细胞粘附和周围环境敏感的去垢剂抗性膜的序列融合。

转染

转染前，将ACL来源细胞接种到6孔板（SPL, 30006）上。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen, L3000015）按照制造商指南进行质粒DNA转染，并将细胞孵育24小时。

FRET图像采集和计算

使用配备数码相机（Leica-K5-14401252）和40×/1.30 NA油镜的Leica DMI8显微镜进行涉及Talin-TS和Lyn-FAK生物传感器的FRET比率实验。FRET比率计算使用DFT51010滤光立方体（Leica, 11525418）和CYR71010滤光立方体（Leica, 11525416）。对所有荧光图像应用背景减除和闪电-雷声过程，这些图像使用LAS X软件捕获。基本图像处理由Fiji（美国国立卫生研究院）进行，并使用LAS X软件生成伪彩色图像。Talin-TS的FRET比率通过将受体图像除以细胞中的FRET图像（tagRFP/FRET）来确定。类似地，Lyn-FAK传感器的FRET比率通过将供体图像除以FRET图像（ECFP/FRET）来计算。FRET比率计算的强度值使用LAS X软件获取。这些计算将talin张力和FAK活性的变化匹配到暖色或冷色。

机械分析

根据报道的研究，在ACLR后8周进行机械分析。简而言之，小心去除肌腱移植物周围的软组织，并将股骨和胫骨放入3D打印模具（2厘米×2厘米×4厘米）中。随后，使用克氏针（SOLCO, 81-61622）固定骨骼，并应用3D打印模具和骨水泥（Heraeus, Palacos R + G）防止骨滑脱（图7A，B）。使用材料测试机（TESTONE, TO-101），在0.37毫米/秒的速度下进行5次0.5牛顿的预加载循环后，以20毫米/分钟的伸长率加载至失效，并记录最终失效载荷。使用载荷-变形曲线计算刚度。

微CT

使用从先前研究改编的方法，在ACLR手术后8周进行微CT分析。微CT扫描使用SkyScan 1272微CT设备（Bruker micro-CT, Belgium）垂直于骨隧道长轴设置。微CT的参数为分辨率9.00微米，X射线源电压60千伏，X射线源电流166微安。使用CTAn软件计算股骨和胫骨隧道的平均横截面积，以评估骨隧道内的新骨生长。对于骨体积与总体积比（BV/TV），分析直径为2毫米、高度为3毫米的圆柱形感兴趣区域，重点关注胫骨隧道近端和股骨隧道远端。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.0软件对图表数据进行定量和统计分析。使用双尾配对t检验和单向及双向方差分析比较目标组和对照组在每个时间点的数据。结果以至少3次独立实验的平均值±均值标准误差（SEM）表示。星号表示统计显著性水平（p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001）。

结果

无细胞十字韧带基质的制备和表征

冻干和研磨后，ACLM呈现为细白色粉末（图1A）。免疫印迹分析显示ACLM粉末中I型胶原呈阳性（图1B）。测试了3种浓度的ACLM粉末的接种效率，30毫克/毫升组与10和60毫克/毫升组相比表现出显著（p < 0.001）更高的细胞接种效率（图1C）。

体外组织学特征

H&E染色在对照（标准同种异体移植物）组中观察到的组织学特征显示，肌腱同种异体移植物ECM未保留任何细胞。在第1天，沿肌内束开口处可明显看到重新接种的细胞簇，即注射ACL来源细胞的位置。在目标组中，第7天和第14天明显存在大量整合到肌腱ECM中的伸长细胞；然而，在仅ACL来源细胞注射组中，第14天几乎看不到细胞（图2A）。当ACLM粉末共同注射时，第7天和第14天后，新的胶原基质似乎在ACL来源细胞周围形成。在第14天计数了在肌腱ECM中存活并整合的细胞数量，与仅ACL来源细胞注射组相比，目标组中计数的细胞数量显著（p < 0.001）更高（图2B）。胶原I型和III型的Picrosirius红染色显示目标组中与仅ACL来源细胞注射组相比有更多的胶原沉积证据（图2C）。

体外基质蛋白含量和基因表达

在第14天对Ki-67和I型胶原进行免疫荧光染色，观察到目标组中Ki-67阳性ACL来源细胞与I型胶原的关联比仅ACL来源细胞注射组更强（图2D，E）。mRNA表达分析证实，与仅ACL来源细胞注射组相比，目标组中I型胶原的基因表达水平显著（p < 0.01）更高。然而，两组之间在III型胶原和其他韧带相关标志物（包括tenascin C和smooth muscle A）方面未观察到显著差异（图2F）。

YAP转位、talin和FAK活性

在第14天对Yes相关蛋白（YAP）进行免疫荧光染色，显示与仅ACL来源细胞注射组相比，目标组中显示出YAP向细胞核转位的细胞数量显著（p < 0.01）更多（图3A，B）。我们使用生物传感器直观评估ACLM对ACL来源细胞张力再生的影响。具体来说，使用了两种生物传感器：talin张力传感器（Talin-TS），它使用粘着斑和肌动蛋白丝检测张力；以及Lyn-FAK传感器，它测量对张力增加的粘着斑激酶（FAK）活性变化。重新接种的ACL来源细胞的荧光强度明显高于周围细胞（图4A）。与无ACLM相比，共同注射ACLM粉末的ACL来源细胞在talin上表现出显著（p < 0.001）增加的张力（图4B）。此外，转染Lyn-FAK传感器的ACL来源细胞在添加ACLM后表现出FAK活性的显著（p < 0.05）增加（图4C，D）。这些发现强烈表明，添加ACLM粉末增强了ACL来源细胞在肌腱微环境中的粘附。

大鼠ACL重建模型中的组织学特征

术后4周进行的H&E染色显示，对照组肌腱移植物内存在局灶性（2级）至大面积（4级）的化生区域；然而，目标组肌腱移植物中发现最小（1级）至无（0级）化生，表明移植物成熟度更高（图5B）。术后8周进行的H&E染色显示，对照组中细胞数量增加，无大面积坏死；然而，对照组中主要存在梭形（1级）至椭圆形（2级）核的细胞，而目标组中主要存在线性（4级）至梭形（3级）核的细胞，表明目标组中移植物成熟度更高（图5C）。术后8周的偏振显微镜显示，与对照组中大量直胶原纤维区域（最小波纹）相比，目标组中具有一致的带状结构和可见波形（大量波纹），表明目标组中胶原波纹恢复更好（图5D）。

大鼠ACL重建模型中的基质蛋白含量和基因表达

进行免疫组织化学分析以评估I型和III型胶原的表达。与对照组和仅ACLM组相比，术后8周，ACL来源细胞与ACLM组中I型胶原更为突出，显示出统计学显著差异（p < 0.001）。术后8周，与对照组相比，ACL来源细胞与ACLM组中III型胶原的表达显著（p < 0.05）更高（图6A）。术后4周和8周对Ki-67和I型胶原进行免疫荧光染色，显示与对照组相比，目标组中Ki-67阳性ACL来源细胞中I型胶原的证据更为明显（图6B）。mRNA表达分析证实，与对照组相比，目标组中I型胶原的基因表达显著（p < 0.05）更高，共同表明与对照组相比，目标组中I型胶原的恢复更优越。然而，其他韧带特异性标志物，包括III型胶原、tenascin C和COMP，未显示显著差异（图6C）。术后4周和8周对I型胶原和Ku-80（抗人核抗体）进行免疫荧光染色，显示I型胶原阳性细胞中Ku-80的证据更为明显，证明在早期成功移植了重新接种的细胞（图6D）。

机械强度

标准同种异体移植物、仅ACLM粉末注射和目标组的最终失效载荷（N）值分别为13.125±0.431、18.400±0.782和20.400±0.949。与标准同种异体移植物组相比，仅ACLM粉末注射组（p = 0.002）和目标组（p < 0.001）的失效载荷平均分别增加了40.2%和55.4%（图7C）。标准同种异体移植物、仅ACLM粉末注射和目标组的刚度值（N/mm）分别为3.410±0.942、7.918±1.060和9.508±1.020。与标准同种异体移植物组相比，仅ACLM粉末注射组（p = 0.028）和目标组（p = 0.005）的刚度平均分别增加了132.2%和178.8%（图7D）。

微CT分析

微CT分析显示，与标准同种异体移植物组相比，股骨（增加95.3%，p = 0.0219）和胫骨（增加48.4%，p = 0.0113）隧道中形成的新骨平均体积显著增加（图8A，B）。与对照组相比，目标组在胫骨隧道中的骨体积（BV）/总体积（TV）比显著更高（增加27.6%，p = 0.0152）（图8C）。

讨论

肌腱移植物常用于执行ACLR；然而，移植物在愈合过程早期会经历坏死，并通过增殖替代移植物坏死的外来成纤维细胞发生恶化，导致III型胶原过表达。我们的体外实验发现，将ACLM粉末与ACL来源细胞结合可改善细胞在肌腱ECM微环境中的存活和整合，从而成功移植ACL来源细胞。我们的动物ACLR实验确认了在细胞数量、化生和胶原波纹恢复方面，重新接种了ACL来源细胞和ACLM粉末的移植物的组织学结构成熟度得到改善。增强的I型胶原基因表达导致肌腱移植物具有更优越的机械性能，支持将自体ACL来源细胞植入作为ACLR的生物增强疗法的潜力。

各种细胞类型，包括肌腱细胞、骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）、脂肪来源的MSCs和脐带来源的MSCs，已测试其再生肌腱的潜力。Burk等人报告称，脂肪来源的MSC可以比其他组织来源的MSC更有效地积极影响肌腱基质重组（例如，I型胶原的表达）。破裂的ACL组织拥有大量具有高扩增和多系分化潜力的细胞。Park等人报告称，从急性ACL残余组织破裂中可以获得平均9.5×10^5个原代（CD 34阴性）ACL细胞，并且这些细胞显示出与脂肪来源MSC相似的实验室扩增和增殖率。他们还证明，在肌腱微环境中培养扩增的ACL来源细胞在肌腱ECM中实现了更早和更优越的存活和整合率，与脂肪来源MSC相比，导致更高的I型胶原基因表达。这支持将ACL来源细胞作为自体干细胞疗法的来源用于增强ACLR后的韧带化。然而，破裂ACL组织的状况可能因个体而异，导致ACL来源细胞的产量不一致。因此，在临床环境中应用这种自体组织来源细胞疗法可能存在确定理想患者的挑战。

在ACLR后植入肌腱移植物的愈合过程中，移植物坏死在过程早期发生，导致外来成纤维细胞侵入。多年来，成纤维细胞增殖形成修复性瘢痕组织；然而，尚未检测到移植物成熟的终点。为克服这种耗时的肌腱再生过程，已在ACLR模型中尝试将自体成纤维细胞或骨髓来源MSC重新接种到肌腱移植物中。Lu等人在兔子模型中使用脱细胞同种异体肌腱与骨髓来源间充质干细胞重新接种进行ACLR。他们报告了关于成纤维细胞浸润和血管形成的改进组织学结果。Ingram等人在异种模型中使用重新接种肌腱细胞的脱细胞肌腱移植物进行ACLR。他们报告称，重新接种的肌腱细胞在ECM上可检测到数周。他们发现重新接种肌腱ECM具有挑战性，因为致密的肌腱ECM不允许足够的细胞粘附和浸润。然而，先前的研究并未评估关于I型胶原合成的韧带化过程的改进。在本研究中，ACLM粉末和ACL来源细胞的共同注射改善了细胞在肌腱ECM中的存活和整合，导致成功移植重新接种的细胞和更高的I型胶原基因表达水平。转染Lyn-FAK和TalinTS生物传感器的ACL来源细胞显示，与ACLM粉末结合时活性增加，支持肌腱微环境内的张力诱导细胞粘附机制。细胞粘附强度通常由整合素与ECM配体的结合调节，这由肌动蛋白-talin耦合和粘着斑介导。我们的发现指向ACLM的共同注射作为增强talin张力和放大ACL来源细胞内FAK活性的催化剂。一旦引入肌腱微环境，这些细胞通过粘着斑与ECM建立连接，使其能够在没有外部触发的情况下解释周围环境并改变其细胞内生理反应。细胞通常将来自ECM的机械线索转化为影响细胞核的信号，并引发导致YAP/TAZ核转位的化学反应，这在本研究中得到证实。

本研究中的韧带愈合机制可能与ACL来源细胞的旁分泌作用有关。ACL来源细胞在体外显示出多系分化潜力和强烈的韧带分化倾向。除了ACL来源细胞的韧带分化外，移植的ACL来源细胞和宿主细胞之间可能存在未知的旁分泌相互作用，这可能增强了韧带特异性ECM合成。在本研究中，移植的细胞在移植后4周逐渐消失，支持重新接种的ACL来源细胞和宿主祖细胞之间的旁分泌相互作用，这可能在韧带愈合中起重要作用。

我们的努力集中在肌腱移植物的关节内部分的移植物成熟方面。据报道，动物研究中观察到的过度移植物坏死在人类ACL移植物中发生在更小的区域。然而，几项人类活检研究证实，在肌腱移植物愈合过程中，移植物坏死（尽管程度较小）、再细胞化、再血管化和胶原组成变化存在类似的重塑级联。Janssen等人在他们的67个人类ACL移植物检索活检研究中报告称，肌成纤维细胞和血管密度大幅增加至24个月，确认胶原组成和方向在研究期间未恢复正常。在本研究中，标准肌腱移植物组的4周活检显示大面积坏死，8周时细胞数量大幅增加，主要由椭圆形至梭形的不成熟细胞组成。这与先前报道早期过度移植物坏死，随后成纤维细胞流入的动物研究一致。然而，4周活检中，用ACL来源细胞和ACLM粉末重新接种的移植物中发现最小面积的移植物坏死，8周活检中主要细胞类型由线性至梭形细胞组成，显示出更优越的细胞成熟度。人抗体追踪分析证实，重新接种的ACL来源细胞在肌腱ECM中成功存活了4周，表明通过移植与ACLM粉末结合的ACL来源细胞可以省略早期移植物坏死阶段。

本研究有几个局限性。首先，由于不可能将细胞均匀注射到整个肌腱移植物中，结果可能不代表整个移植物组织的发现。其次，由于ACL供体主要是年轻男性，发现可能不能推广到所有患者群体。第三，仅分析了早期时间点（8周内）的结果，我们不能假设完整的韧带愈合过程在长期内会得到增强。第四，每个时间点的样本量较小，研究期相对较短，无法确定愈合移植物的机械性能。最后，小型动物模型（例如Sprague Dawley大鼠）与人类具有不同的关节生物力学，并且对人源细胞的反应可能在物种间有所不同。因此，当前实验的发现不能在韧带再生的背景下推广到人类。

结论

据我们所知，这是第一份采用自体ACL来源细胞移植概念的ACLR生物增强疗法的报告。我们提供了体外和体内概念验证，证明将ACL来源细胞与作为生物支架的ACLM粉末重新接种到肌腱移植物上用于ACL重建在临床上具有应用前景。总之，重新接种培养扩增的ACL来源细胞和ACLM粉末的肌腱移植物可以增强移植物成熟过程及其机械性能。