摘要
背景：
naive T细胞进入淋巴结(LNs)是共刺激阻断条件下诱导心脏移植接受的关键步骤。淋巴结内称为高内皮微静脉(HEVs)的特化血管介导这一过程。HEVs表达含6-磺酸唾液酸路易斯X的关键糖蛋白，这是naive T细胞膜上L-选择素的结合位点。这种碳水化合物的正确形成需要N-乙酰葡糖胺6-O-磺基转移酶，特别是CHST4的磺化作用。鉴于CHST4在HEVs和移植免疫中的关键作用，我们旨在开发一种首创的靶向CHST4/HEV轴的抗体-药物偶联物(ADC)，将免疫调节分子递送到淋巴结，促进长期心脏移植存活。
方法：
我们使用CHST4基因敲除小鼠和可诱导白喉毒素受体小鼠模型，研究CHST4在心脏移植过程中HEV功能中的作用。为评估CHST4缺乏对心脏移植结果的影响，我们使用完全主要组织相容性复合体不匹配和单一主要组织相容性复合体II类不匹配模型，分别研究急性和慢性心脏移植排斥。
结果：
HEVs中CHST4表达的丧失损害了naive T细胞进入淋巴结的能力，从而减少了调节性T细胞的形成，破坏了共刺激阻断条件下的心脏移植接受。使用携带雷帕霉素和管蛋白抑制素A的HEV靶向ADC治疗，延长了小鼠心脏移植存活期，并抑制了慢性排斥，这是长期移植物成功的主要障碍。从机制上看，该ADC增强了调节性T细胞的诱导，减少了淋巴结内的促炎T细胞，并降低了心脏移植中的免疫细胞浸润，与单独使用游离药物相比，使用雷帕霉素和管蛋白抑制素A的剂量显著降低。
结论：
我们的发现揭示了CHST4在HEVs中的关键机制作用，即促进淋巴结内调节性T细胞的生成并促进心脏移植接受。此外，我们介绍了一种有前景的基于CHST4的HEV靶向ADC疗法，作为一种抑制心脏移植排斥的潜在策略。
临床视角
新发现：
- 淋巴结(LNs)中的高内皮微静脉在共刺激阻断条件下促进心脏移植接受方面发挥重要作用，CHST4的正确糖基化对心脏移植后T细胞向LNs的归巢至关重要。
- 一种新型靶向淋巴结、双重载荷的抗体-药物偶联物MHA112-雷帕霉素-管蛋白抑制素A延长了心脏移植存活期。
临床意义：
- 终身使用免疫抑制剂仍不足以一致地预防急性和慢性排斥，这些排斥与移植物失败有关，且这些药物会导致严重的毒性，包括移植后糖尿病和恶性肿瘤。
- 高内皮微静脉表达的酶CHST4在通过调节T细胞向LNs归巢来介导心脏移植物接受方面发挥关键作用。
- 抗体-药物偶联物有可能通过提高疗效和降低毒性，重塑需要终身治疗的心脏移植患者的免疫抑制剂格局。
- MHA112-雷帕霉素-管蛋白抑制素A可能作为一种新型靶向淋巴结的疗法，改善长期心脏移植结果。
尽管使用了强效免疫抑制疗法，但由于移植物排斥导致的移植物丢失仍然是一个主要挑战，与这些药物相关的严重并发症如代谢综合征、感染和恶性肿瘤仍然存在。淋巴结(LNs)是同种反应性T细胞产生的主要场所。最近的研究表明，LNs在各种免疫抑制治疗方案下促进移植物接受方面发挥着关键作用。值得注意的是，LNs仅包含一种特殊的血管段，称为高内皮微静脉(HEVs)，它们独特地表达一组称为外周结节地址素(PNAd)的唾液粘蛋白。PNAd作为naive T细胞表达的L-选择素的配体，促进T细胞向LNs的归巢。
在移植排斥过程中，HEVs介导T细胞向LNs的归巢，T细胞在那里被呈递移植抗原的树突状细胞(DCs)激活。然而，在共刺激阻断等诱导方案下，naive T细胞向LNs的归巢对于生成外周诱导的调节性T细胞(iTregs)和促进移植物接受至关重要。
调节性T细胞(Tregs)有助于免疫自身耐受和组织稳态。通过抑制T细胞激活、扩增和效应功能，Tregs有助于调节自身免疫疾病和移植排斥。因为增强Treg数量和功能对于改善免疫调节至关重要，因此研究HEV介导的T细胞 trafficking 在移植中如何被调节，特别是GlcNAc6ST如何影响T细胞归巢和移植接受，具有重要意义。这些信息可能为开发预防移植排斥的新型治疗策略提供宝贵见解。
基于我们关于CHST4在HEVs中对T细胞归巢机制重要性的研究，我们启动了专为心脏移植设计的首创抗体-药物偶联物(ADCs)的设计。尽管ADCs在癌症治疗中已取得显著进展，但其在心脏移植中的潜力仍未得到充分探索。另一方面，目前的免疫抑制方案虽然在一定程度上有效，但未能充分预防排斥，特别是慢性排斥，并且与严重毒性相关。
因此，我们开发了一种单克隆抗体MHA112，它特异性识别HEVs上表达的PNAd。我们将两种不同的有效载荷——管蛋白抑制素A和雷帕霉素——连接到我们的MHA112单克隆抗体上，目标是促进Tregs。这些有效载荷通过互补机制支持Tregs的诱导和稳定性。
管蛋白抑制素A是一种组蛋白去乙酰化酶6抑制剂，已被证明可防止Foxp3去乙酰化，导致稳定的Foxp3表达和增强的免疫抑制活性，同时抑制炎症期间CD8+效应T细胞的功能。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白的抑制剂，从而抑制效应T细胞。在移植中，雷帕霉素靶蛋白抑制还扩展Tregs同时稳定Foxp3表达。考虑到这两种药物通过影响LNs中Treg的分化和增殖来调节T细胞免疫反应，靶向递送到LNs可作为预防T细胞介导的免疫反应的有前景的治疗策略。
在本研究中，我们证明了HEVs中CHST4表达通过促进T细胞向LNs归巢并在共刺激阻断下将其转化为Tregs，对实现移植接受的重要性。我们表明，我们的基于CHST4的HEV靶向ADC递送系统通过促进iTreg分化并在引流淋巴结(DLN)中创建富含Treg的免疫抑制微环境，显著改善了心脏移植物存活。
我们的发现揭示了CHST4不仅在稳态条件下对T细胞归巢是必需的，而且在移植过程中对建立富含Treg的、促进移植接受的免疫调节微环境也是动态必需的。CHST4 KO小鼠DLNs中PNAd表达的显著降低表明，在心脏移植后DLN HEVs中，CHST4缺失可能不会发生由CHST2或CHST7介导的PNAd补偿性合成。
我们证明了HEV中CHST4在介导naive T细胞向LNs募集并促进其随后分化为iTregs中的重要作用。为检验naive T细胞归巢和随后的iTreg诱导在促进心脏移植接受方面的临床相关性，我们使用了两种不同的排斥模型：代表完全MHC不匹配设置的BALB/c到C57BL/6模型，以及高度依赖Tregs进行免疫调节的单一MHC II类不匹配的Bm12到C57BL/6模型。
虽然有几种基于Treg的细胞疗法，如体外扩增的Tregs和嵌合抗原受体工程Tregs，但我们基于ADC的促进Tregs的策略面临更少的技术挑战。靶向药物递送对于增强目的地特异性同时最小化对非靶器官的意外影响至关重要。ADCs因其靶向药物递送能力在癌症治疗中引起了巨大关注，但其在移植中的应用仍未得到充分探索。
我们专注于两种有效载荷：雷帕霉素和管蛋白抑制素A。雷帕霉素可以扩增Tregs并增加Tregs的抑制功能。管蛋白抑制素A作为选择性组蛋白去乙酰化酶6抑制剂，通过防止Foxp3去乙酰化，稳定其表达和活性，增强了Treg功能。这些互补机制表明，这些药物可以通过协同作用诱导富含Treg的LN微环境并增强免疫抑制性Treg能力。
除了促进移植长期存活外，我们ADC方法的一个关键前提是降低全身免疫抑制药物的总体负担，同时保持疗效。通过在LN内T细胞激活的关键部位集中免疫调节，该平台有可能显著降低免疫抑制药物相关毒性的风险，并改善长期心脏移植结果。值得注意的是，我们的ADC治疗组使用比游离药物治疗所需剂量低得多的雷帕霉素和管蛋白抑制素A，实现了稳健的心脏移植物接受。
淋巴结微环境对各种炎症性疾病（包括心血管疾病）的发病机制很重要。使用MHA112抗体的HEV靶向药物递送可能是一种多功能策略，用于调节LN微环境，不仅在移植中，也在其他炎症条件中，包括自身免疫疾病。
我们分析了MHA112-雷帕霉素-管蛋白抑制素A对T细胞介导的免疫和Treg诱导的影响。该MHA112为基础的HEV靶向ADC有效抑制了同种抗原特异性免疫反应，同时促进了从过继转移的同种抗原反应性T细胞中分化出iTregs。这种策略通过在DLNs中扩增CD4+ Tregs、抑制CD8+效应T细胞和增加Treg/效应T细胞比例，实现了免疫调节。
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