衰老伴随着大脑广泛的细胞和分子变化，导致认知衰退、神经可塑性降低以及神经退行性疾病易感性增加。虽然基因表达变化已在单细胞分辨率下得到广泛分析，但驱动这些变化的转录调控机制仍然不清楚。表观遗传过程，如染色质可及性、DNA甲基化、组蛋白修饰和3D染色质组织，在定义细胞身份和对环境信号的响应中起着关键作用，然而不同脑区和细胞类型的表观基因组图谱如何随年龄变化仍知之甚少。
近期研究已揭示了跨组织的保守衰老标志，包括干细胞耗竭、线粒体功能障碍、基因组不稳定性和炎症。表观遗传改变已成为衰老的关键因素，染色质可及性、DNA甲基化和组蛋白修饰的变化与转录保真度和细胞身份的逐渐丧失有关。值得注意的是，表观遗传衰老也是一个可逆的过程，因为多能性因子的异位表达、SIRT6组蛋白去乙酰化酶的激活以及其他组蛋白修饰酶的调节已被证明可以缓解某些衰老表型。然而，以往关于脑衰老的研究主要依赖组织整体分析，模糊了细胞内在的衰老效应，无法捕捉不同脑细胞类型和区域的调控变化。鉴于大脑的细胞多样性，对染色质衰老进行细胞类型分辨的分析至关重要，以区分内在调控变化与细胞组成的变化，尤其是神经退行性疾病会不成比例地影响特定脑区和细胞群，如帕金森病中黑质多巴胺能神经元、多发性硬化症中白质少突胶质细胞以及阿尔茨海默病中的海马神经元。
之前的研究已在单细胞水平上描述了衰老中的转录组变化，包括大规模努力如Tabula Muris Senis（跨多组织老化特征）以及近期一项全脑衰老图谱（分析了小鼠大脑120万神经和胶质转录组）。除了单细胞RNA测序外，空间转录组学已揭示白质受衰老影响尤为严重。这些研究表明不同细胞类型和空间位置具有不同的转录衰老特征。虽然转录组图谱提供了宝贵见解，但它们单独无法捕捉驱动转录变化的调控机制。
在此，我们呈现了一个全面的单细胞染色质可及性和转录变化图谱，整合了跨八个与认知、记忆、情绪调节和神经退行过程相关的小鼠脑区的单细胞ATAC-seq、RNA-seq和空间转录组学数据。通过在单细胞分辨率下解析表观基因组变化，我们揭示了导致衰老相关转录变化和细胞功能障碍的调控机制。
为了确定染色质可及性和转录程序如何在衰老过程中变化，我们以三种年龄（2、9和18个月）的成年小鼠为对象，使用单核ATAC-seq、单核Multiome（ATAC-seq + RNA-seq）以及多重误差鲁棒RNA荧光原位杂交技术，对八个脑区进行了分析。对于snATAC-seq，我们以每个脑区两个生物学重复（每个重复包含从3-7只小鼠中解剖的混合脑组织）分析了9和18月龄雄性小鼠，同时整合了之前报道的2月龄小鼠脑数据。对于雌性样本，我们生成了单核10× Multiome数据，将分析扩展至所有三个年龄组的两种模态（ATAC-seq和RNA-seq）。总共，我们分析了1,116,638个细胞的染色质可及性、368,491个细胞的RNA表达以及500,353个细胞的空间转录组学，从而全面了解了年龄依赖性基因调控和细胞组成。
我们利用标记基因并与成年小鼠脑单细胞转录组图谱整合，鉴定了80个不同的细胞类型，其中最丰富的群体是少突胶质细胞、齿状回谷氨酸能神经元和纹状体D1/D2中型多棘神经元。值得注意的是，三个祖细胞群体显示出显著的年龄相关丰度下降：未成熟少突胶质细胞、起源于室下腔并迁移至嗅球、纹状体和大脑皮层的抑制性未成熟神经元，以及齿状回祖细胞。这些下降在snATAC-seq、Multiome和MERFISH数据集中均观察到，并定位于衰老脑中的经典神经源性生态位。
我们鉴定了881,231个开放染色质区域和候选顺式调控元件。评估2月与18月龄样本之间的差异染色质可及性显示，88,555个cCRE在至少一种细胞类型、区域和性别的组合中显著增加，而70,734个cCRE显著减少。最突出的差异峰在雌雄之间一致，包括一些基因簇（如杀伤细胞凝集素样受体、分泌珠蛋白、嗅觉受体、前列腺和睾丸表达基因以及原钙粘蛋白伽马家族）以及基因间区域在神经元衰老中强烈上调。通过进行性别内衰老分析我们验证了这些模式是生物学上真实的，而非技术伪影。
如前述，三个祖细胞样群体的相对丰度在2、9和18个月时进行性下降。齿状回祖细胞降幅最大，从前海马和后海马中约3%降至不足0.01%。OB-STR-CTX Inh IMNs主要位于伏隔核、尾壳核和海马，2月时约4%但以不同速率随年龄下降。第三个群体是IOLs，即少突胶质细胞前体细胞与成熟少突胶质细胞之间的中间细胞类型，从约2%降至约0.1%，与既往发现衰老脑髓鞘再生受损一致。
为确定染色质变化是否伴随祖细胞耗竭，我们在祖细胞群体中分析了年龄差异cCRE。基序富集分析显示OB-STR-CTX Inh IMNs中同源框基序显著缺失，IOL中Sox基序缺失，表明细胞身份转录因子失调。在OB-STR-CTX Inh IMNs中，差异可及性分析揭示了随年龄的逐步变化，表明衰老过程中表观基因组逐渐而非突然转变。Lhx2是OB-STR-CTX Inh IMNs中下调最显著的转录因子，其基序位点的可及性随年龄下降。Lhx2是神经源性祖细胞的关键转录调控因子，维持其自我更新能力并延迟向成熟神经元或胶质命运的分化。在胚胎和成年神经干细胞中，Lhx2通过直接激活下游靶点如Pax6防止过早分化，支持持续神经发生。与此一致，差异基因表达分析显示Pax6在scRNA-seq和MERFISH数据中均显著下调（adj. p < 0.001，约11.7倍表达减少）。Pax6对神经命运规格至关重要，其年龄相关缺失强调了神经发生潜力的逐渐丧失。基因本体（GO）通路富集分析显示，与学习、记忆和细胞突起形态发生相关的基因随年龄下调，而突触组织相关基因在这些祖细胞中显著上调，表明部分细胞可能正在提前分化。
与祖细胞群体类似，我们在少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中也观察到广泛的转录和染色质可及性变化，这可能影响它们维持脑稳态和支持神经元功能的能力。这些胶质细胞群体的功能障碍与神经退行过程有关，强调了理解其随年龄的调控变化的重要性。
在少突胶质细胞中，我们鉴定出1,727个上调cCRE和2,501个下调cCRE。染色质可及性变化在脑区和性别间一致，且从2月到18月逐步进行。与IOLs类似，成熟少突胶质细胞也表现出Sox转录因子（维持少突胶质细胞身份的关键因子）活性下降。基序富集分析显示，Sox家族和Creb5基序在下调cCRE中显著富集，而KLF和SP家族基序在上调峰中富集，标志着转录因子活性转变。差异基因表达分析揭示髓鞘形成和能量产生相关基因下调，而突触组织相关基因在上调基因中富集。以往研究表明少突胶质细胞表达突触基因参与轴突-髓鞘通信。在此背景下，衰老少突胶质细胞中突触组织基因上调可能反映了适应反应以维持轴突-胶质相互作用，而髓鞘相关基因下调在8个脑区均明显。Mal基因（参与少突胶质细胞中髓鞘蛋白招募）在MERFISH和RNA-seq分析中均显著下调。
我们利用活动-接触（ABC）分析将这些差异基因与少突胶质细胞中的关键调控cCRE联系起来，发现Sox10是与衰老少突胶质细胞中下调基因相连峰中最显著富集的转录因子基序。Sox10是少突胶质细胞谱系进展和髓鞘基因表达的主调控因子，在维持少突胶质细胞功能和促进髓鞘化中发挥关键作用。我们的发现揭示其下调可能有助于衰老脑中髓鞘丢失。此外，衰老少突胶质细胞中表达参与炎症和调控途径的基因增加，包括长链非编码RNA Neat1、帕金森病驱动基因Snca和炎症标志物Il33。
类似地，星形胶质细胞和小胶质细胞表现出与应激响应转录因子相连的增强子可及性增加。例如，额叶皮层星形胶质细胞在年龄增益cCRE中富集ATF(Zf)基序，而小胶质细胞特别是前海马中的小胶质细胞富集IRF8基序，提示免疫激活。同时上调基因如Tnsfs8和Ildr2，下调经典小胶质细胞标志物如C1qa和Cst3，这与既往报道的衰老中胶质细胞转录转变一致。
负责大脑兴奋性信号的谷氨酸能神经元在衰老过程中也表现出广泛的染色质和转录变化，并具有明显的区域脆弱性。在齿状回神经元中，年龄相关染色质重塑显示出明显的区域特异性，前海马和后海马表现出不同的可及性变化模式。我们在衰老的DG神经元中鉴定了3,495个上调cCRE和3,505个下调cCRE，年龄上调峰簇在前海马中富集，而另一簇峰在后海马中下调更明显。基序富集分析强调转录因子活性的区域差异：CTCF基序在前海马年龄上调cCRE中优先富集，提示该区域染色质环和基因组结构改变。应激响应转录因子AP-1基序在两个脑区均显著上调。相反，MEF2基序在后海马下调cCRE中强烈富集，表明突触可塑性和神经元维持相关转录程序的区域性丢失。MEF2转录因子调节活动依赖性突触重塑和神经元存活。
在衰老DG神经元中，DNA损伤反应相关基因上调，而轴突发生相关基因下调。ABC分析显示，与年龄上调基因相连的开放染色质区域富集AP-1和CTCF基序，而与下调基因相连的区域富集NeuroG2基序。这表明衰老过程中发育转录程序向应激响应调控网络转变，AP-1基序与衰老相关基因表达变化有关。这与此前发现AP-1重新分布至应激响应CRE而细胞身份转录因子结合位点占有率下降一致。
除海马外，多个脑区的谷氨酸能神经元在衰老过程中经历了广泛的染色质和转录变化。基序富集分析突出显示了应激响应转录因子（特别是KLF和AP-1）识别的开放染色质元件增加，表明衰老与谷氨酸能神经元中增强的应激适应有关。相反，MEF2和RFX基序在年龄下调cCRE中富集，指示神经元发育和突触维持关键转录因子结合的丢失。CTCF基序在多个区域的年龄上调峰中强烈富集，进一步支持衰老过程中的广泛染色质重塑。基因集富集分析揭示轴突发生和氧化磷酸化通路一致下调，表明跨多个谷氨酸能神经元亚型的突触可塑性和代谢功能下降。
D1/D2中型棘神经元在衰老过程中表现出显著的染色质重塑和转录变化。这些GABA能神经元存在于CP和NAC中。我们进一步鉴定了在NAC中上调至更高水平的cCRE簇和在CP中下调更强的峰簇。RFX基序（参与神经元功能，并在多种神经元亚型的下调峰中广泛富集）在NAC的上调峰中富集。AP-1基序在两个区域的上调峰中均显著富集，与谷氨酸能神经元类似，表明这些神经元经历特别高水平的衰老相关应激。细胞连接组织相关基因（包括神经调节蛋白家族成员和原钙粘蛋白如Pcdhgc5）在衰老上调基因中显著富集。D1/D2 MSNs中最显著的染色质变化之一是Pcdhg和Pcdha位点的可及性增加，这些基因簇对于神经元自我识别和突触组织至关重要。值得注意的是，Pcdhg簇内转录上调主要是内含子性的，提示该区域内的调控元件或非编码RNA可能差异表达而非蛋白编码基因本身。其中，位于Pcdhg位点内的lncRNA 3222401L13Rik（最近被发现在衰老星形胶质细胞中上调）在多种细胞类型中上调。染色质构象分析显示该位点结构变化，簇内接触频率增加而与上游基因组区域相互作用减少。
我们接下来检查了异染色质域和转座因子在脑衰老中如何受影响。在我们的前期工作中，我们发现衰老伴随广泛的染色质重塑，特别是在异染色质域和TE中，衰老神经元表现出显著的异染色质丢失。借助当前数据集（覆盖八个脑区和多种细胞类型）提高的分辨率和广度，我们现在发现这一现象超出了神经元，在多种胶质和神经元群体中观察到假定的异染色质广泛去稳定化。然而，这一效应在谷氨酸能神经元中仍然最为显著，特别是在FC、海马、ENT和杏仁核中，而NAC、导水管周围灰质和CP几乎没有变化。
我们将年龄相关的差异可及区与ENCODE新生第0天小鼠前脑H3K9me3 ChIP-seq标记的域进行重叠。年龄上调峰在这些区域显著富集，特别是在谷氨酸能神经元中，与之前观察一致。TE在细胞类型间的可及性也增加，亚家族如IAPLTR3-int表现出一致的激活模式。包含9个月中间时间点的分析确认TE可及性变化在衰老过程中逐渐进行，关键家族如MuRRS-int和IAPLTR3-int从9到18个月持续上调。这些趋势在雌性和雄性小鼠中均明显。基序富集分析显示，异染色质内差异上调区域富集先导转录因子AP-1家族和CTCF基序。
利用高斯密度评分（一种计算识别基因组中差异可及性浓度显著高于预期的区域的方法），我们鉴定出全基因组的染色体衰老热点。这些热点在谷氨酸能神经元中特别是皮层和海马区域上调。值得注意的是，47%的显著上调热点与H3K9me3标记域重叠，尽管这些区域仅覆盖约3%的基因组。这种衰老相关可及性增加与组成性异染色质的强关联提示衰老过程中抑制性染色质区室的广泛重塑。许多这些热点对应着TE活动的基因间区域、成熟神经元中通常被抑制的基因簇以及lncRNA。值得注意的是，lncRNA在衰老中最差异表达的基因中占比过高，在一些皮层神经元细胞类型中，前100个上调基因中超过50%属于这一类别。最显著的衰老相关热点之一位于13号染色体起始端，在五个脑区观察到可及性增加。该区域包含lncRNA Gm48530，它是同一五个脑区衰老皮层神经元中上调最显著的基因。该热点还与IAPLTR3-int（TE元件）重叠，该元件在多种细胞类型中可及性增加。该位点整体表现出染色质可及性、基因表达和低甲基化的协同增加，提示异染色质域年龄相关染色质重塑可能改变调控景观并导致转录激活。
常染色体热点之外，在雌性样本的X染色体上鉴定出几个衰老相关热点。最显著的是Firre lncRNA位点，表现出持续的可及性增加，与既往报道将衰老与X染色体失活丢失相关联一致。类似地，另一个参与X染色体组织的关键元件lncRNA Dxz4在衰老神经元中可及性增加，提示X连锁染色质架构的大规模变化可能伴随衰老。同时，Xist和Tsix（X染色体失活的两个关键调控因子）是雌性脑衰老中跨细胞类型和脑区最一致下调的lncRNA。
综上所述，我们的发现指出，在假定的异染色质区域的染色质重塑、转座元件可及性增加以及长链非编码RNA的失调，是脑衰老中关键的表观基因组和转录组特征。我们注意到，参与氧化磷酸化和异染色质维持的基因（包括组蛋白甲基转移酶和染色质重塑因子）是跨细胞类型最一致下调的基因之一。虽然这些模式可能导致调控不稳定性，但还需要进一步研究来确定异染色质动态在年龄相关功能衰退中的因果作用。
在此，我们展示衰老伴随着小鼠脑中胶质细胞和神经元细胞类型中染色质可及性和转录因子活性的广泛变化。我们的单细胞表观基因组和转录组分析跨八个脑区，揭示了主转录因子丢失、应激诱导的重编程以及异染色质不稳定性。通过提供这些转录变化背后的调控背景，本研究扩展了最近的转录组衰老图谱。
我们的数据揭示的衰老核心特征之一是谱系决定性转录因子的逐渐下降。在祖细胞群体中，Lhx2和Pax6的减少可能损害神经发生能力，这与成年海马和室管膜下区中神经干细胞年龄相关耗竭及神经发生减少的充分记录一致。在少突胶质细胞中，Sox活性降低为年龄相关的髓鞘下降提供了调控基础。在神经元中，Mef2和NeuroG2活性的丧失与轴突发生和突触可塑性程序的下调同时发生。
随着发育转录因子下降，衰老细胞表现出应激响应转录程序的激活增加。我们观察到神经元中AP-1基序富集、多种细胞类型中KLF基序富集、小胶质细胞中IRF家族基序富集，将衰老与炎症和应激相关调控状态联系起来。虽然AP-1富集是年龄增益调控元件的一个一致特征，但需要未来的扰动研究来确定这些因子在衰老表型中的因果作用。
脑衰老的另一个定义性特征是广泛的异染色质不稳定，伴随转座元件激活和长链非编码RNA上调。这些发现与越来越多的证据一致，即异染色质维持对跨物种长寿至关重要，并且针对染色质结构的干预可以改善衰老表型。H3K9me3标记域年龄相关的可及性增加在谷氨酸能神经元中最显著，但也延伸到多种细胞类型。雌性小鼠脑还表现出广泛的X染色体重塑，包括异染色质相关位点可及性增加和假常染色体区域可及性减少，提示性别特异性表观遗传衰老机制。
总之，我们的发现支持一个模型，其中衰老涉及通常稳定细胞身份的表观遗传约束的逐渐侵蚀，导致转录向应激响应状态漂移。这种调控不稳定性可能是年龄相关认知衰退和神经退行性疾病的基础，并突出染色质维持和转录因子网络作为旨在保留脑功能的衰老干预措施的潜在靶点。
研究局限性
性别特异性分析受到不同实验平台使用的限制，使得直接比较受限。本研究绘制了脑衰老过程中染色质可及性和转录变化，但仅限于三个时间点，可能无法完全解析时间动态。
资源可用性
主要联系人：Bing Ren。本研究未生成新的独特试剂。原始测序数据可在SRA（PRJNA1248586）获取，处理数据已存入GEO（GSE294772）。分析代码可在GitHub获取。任何重新分析数据所需的额外信息均可向主要联系人索取。
致谢
本研究由NIH资助（5R01AG066018）。
作者贡献
B.R., J.R.E., M.M.B. 和 M.L.A. 构思并设计研究。M.L.A. 进行分析并起草稿件。J. Osteen, A.B., J.R., N.D.J. 和 S. Cao 参与组织解剖和细胞核制备。M.M., Q.Y., E.E. 和 E.W.S. 生成10× Multiome数据。X.H. 在S.P.指导下生成snATAC-seq数据。A.W. 监督scATAC和10× Multiome数据生成。C.T.B.-B., J.A., S. Cho, N.E. 和 J.L. 生成MERFISH数据。J. Olness 和 J.C.K. 在Q. Zhu指导下预处理MERFISH数据。Q. Zeng 分析共享的snm3c-seq数据并计算ABC评分。S.M. 进行RNA双细胞去除。S.Z. 提供用于标签转移的数据集。M.L.A., S.M. 和 T.L. 管理公共数据发布。J.R.E., M.M.B., M.L.A. 和 B.R. 协调研究并编辑稿件。B.R. 监督数据收集和分析。
利益冲突声明
J.R.E. 是Zymo Research和Ionis科学顾问委员会成员。B.R. 是Arima Genomics Inc.的共同创始人和顾问，以及Epigenome Technologies的共同创始人。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作期间，作者使用ChatGPT5.2来缩短主要文本以符合字数限制。使用该工具/服务后，作者根据需要审阅并编辑了内容，并对出版内容承担全部责任。
STAR★方法
关键资源表包括化学品（Tn5转座酶、SPRISelect试剂等）、关键商业试剂盒（Chromium Controller、MERSCOPE试剂盒等）、沉积数据（原始数据、处理数据）、实验模型（C57BL/6J小鼠）、寡核苷酸以及软件和算法（SnapATAC2, Seurat, Harmony, MACS3, MAST, CellPose, Scanpy, HOMER等）。实验模型详情：C57BL/6J雄性和雌性小鼠购自Jackson Laboratory，在12小时光照/黑暗循环下饲养，自由进食。所有动物在下午1-5点之间解剖。大脑在2、9或18个月龄提取，切片后根据Allen脑参考图谱解剖。方法细节包括细胞核分离、snATAC-seq和10× Multiome数据生成、数据处理、细胞类型注释、MERFISH基因面板设计（500个基因，涵盖细胞类型标志物和衰老相关基因）、组织制备和成像、数据预处理以及标签转移。定量和统计分析包括差异基因表达（MAST）、差异可及性（SnapATAC2）、通路富集（clusterProfiler）、基序富集（HOMER）、与组蛋白标记重叠（bedtools）、ABC评分用于连接基因和cCRE、高斯平滑用于热点鉴定、转座元件可及性和表达分别使用scTE和SoloTE结合DESeq2进行。补充信息包括8个文件（图S1-S14、表S1-S6、文章加补充信息）。
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