摘要
特发性肺纤维化（IPF）是一种与年龄相关、进行性且致命的间质性肺疾病，目前有效疗法有限。肺泡2型（AT2）上皮细胞作为修复肺泡所必需的兼性干细胞，其衰老会破坏上皮再生并促进IPF中的纤维化重塑。多配体聚糖-1是一种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，主要由肺上皮细胞表达，但其在纤维化过程中AT2功能障碍中的作用尚不明确。本研究表明，在IPF及其他纤维化肺疾病中，以及在小鼠博来霉素诱导的肺纤维化中，AT2细胞中的多配体聚糖-1显著上调。多配体聚糖-1的表达随年龄增长进一步增强，并与老年小鼠的纤维化负担增加相关。通过整合人类转录组分析、小鼠遗传模型和基于上皮细胞的系统，我们发现过量的多配体聚糖-1促进细胞自主性上皮衰老，并损害AT2祖细胞功能。升高的多配体聚糖-1降低了AT2的更新能力，破坏了分化，并降低了表面活性蛋白C水平，而多配体聚糖-1的基因缺失则减轻了衰老并保留了损伤后的上皮功能。综上所述，这些发现将多配体聚糖-1确定为肺纤维化中AT2衰老和适应不良修复的关键上皮调控因子，并支持将靶向多配体聚糖-1驱动的上皮功能障碍作为潜在治疗策略。
引言
慢性呼吸系统疾病，包括间质性肺疾病，是全球发病率和死亡率的重要原因（1）。特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、致命的疾病，全球发病率不断上升，且无治愈性疗法（2）。除肺移植外，尚无有效治疗能阻止或逆转该疾病的病理纤维增生性重塑。因此，确定纤维化起始和进展的关键分子驱动因素对于开发靶向有效的干预措施至关重要。
肺泡2型（AT2）上皮细胞作为肺祖干细胞（3），可增殖并分化为肺泡1型（AT1）细胞，以维持肺泡稳态并在损伤后介导有效修复（4–8）。当AT2功能受损时，会出现发育不良的肺泡修复，驱动肺纤维化的起始和进展（4,6,9）。汇聚的实验和有力证据表明，细胞衰老是AT2功能障碍和耗竭的核心驱动因素，直接导致发育不良修复和肺纤维化（10–17）。尽管已描述多种促进AT2衰老的分子（14,16,18–21），但控制这一过程的相对上游分子却很少（22,23）。
多配体聚糖-1是一种I型跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，表达于气道和肺泡上皮细胞的基底外侧表面，通过其硫酸乙酰肝素链与可溶性或基质相关配体的相互作用调节多种细胞过程（24）。在正常上皮修复过程中，多配体聚糖-1的脱落解除了这一调控约束，从而促进上皮分化（25,26）和再上皮化（27–29）。多配体聚糖-1在AT2细胞中上调，并通过抑制靶向细胞衰老途径的miRNA在小鼠中表现出促纤维化活性（30）。此外，多配体聚糖-1在流感感染期间减弱上皮细胞凋亡（31），这一特征与衰老细胞的抗凋亡表型一致。总之，这些发现表明，AT2细胞中过量的多配体聚糖-1以细胞自主方式促进AT2衰老，并导致肺纤维化中的适应不良肺泡修复。
在本研究中，我们利用互补的人类肺组织和小鼠模型，将多配体聚糖-1确定为AT2细胞衰老的调控因子。我们发现，AT2细胞中过量的多配体聚糖-1表达促进AT2衰老并损害其修复能力。这些缺陷与纤维化肺损伤中的适应不良肺泡修复相关。机制上，我们发现多配体聚糖-1介导的AT2衰老与p53乙酰化增加有关。我们的研究结果确立了过量上皮多配体聚糖-1是AT2细胞衰老的关键决定因素，导致肺泡修复缺陷和肺纤维化重塑。
结果
多配体聚糖-1在特发性肺纤维化及其他纤维化肺疾病的AT2细胞中上调
我们此前报道，多配体聚糖-1在间质性肺疾病（包括IPF）的肺上皮细胞中上调（30）。在本研究中，我们特别关注肺泡2型（AT2）细胞。两项独立分析——一项使用已发表的IPF和对照肺单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE122960）（16）（图1A），另一项使用包含80个对照和85个IPF肺scRNA-seq样本的未发表整合数据集（补充图S1A）——均显示，与对照相比，IPF的AT2细胞中多配体聚糖-1（SDC1）mRNA表达显著增加。与这些发现一致，对照（N=3）和IPF（N=2）肺的空间转录组分析（GSE292956）显示，SDC1上调（图1B–C），并与AT2细胞经典标志物ABCA3共表达（图1D）。离体肺组织的免疫荧光分析证实，与对照相比，IPF肺的AT2细胞中SDC1蛋白丰度显著增加（图1E）。值得注意的是，多配体聚糖-1的表达在其他纤维化ILD中也有上调，包括类风湿关节炎相关ILD（补充图S1B），支持多配体聚糖-1在纤维化肺疾病谱系中的广泛作用。总之，这些发现确立了多配体聚糖-1作为纤维化AT2细胞保守分子特征，促使我们接下来评估过量多配体聚糖-1对AT2细胞功能的转化后果。
多配体聚糖-1在衰老AT2细胞中上调，并促进老年小鼠的肺纤维化
为了定义多配体聚糖-1在纤维化肺损伤中的年龄依赖性调控，我们利用已发表的scRNA-seq数据集（GSE186246）分析了年轻和老年小鼠未损伤和博来霉素损伤肺中AT2细胞的Sdc1 mRNA表达。在博来霉素损伤后第30天的AT2细胞中观察到Sdc1表达的年龄依赖性增加，而在未损伤的AT2细胞中未检测到差异（图2A）。与这些转录发现一致，在博来霉素给药21天后，年轻和老年小鼠的AT2细胞中多配体聚糖-1蛋白水平均升高（图2B和补充图S2A–B及S3A–B），而在未损伤条件下未观察到年龄依赖性差异（补充图S4A–B、S5A–B和S6A–B）。值得注意的是，全肺切片的图像定量显示，在患病第21天的老年博来霉素损伤AT2细胞中，多配体聚糖-1表达最高，但与匹配的年轻小鼠相比，该增加未达到统计学显著性（图2C）。
为了确定体内AT2细胞中过量多配体聚糖-1的功能后果，我们利用博来霉素诱导的肺损伤和纤维化模型评估纤维化负担。与年龄匹配的Sdc1−/−小鼠相比，老年博来霉素损伤的野生型（WT）小鼠每肺的胶原沉积显著更高，通过肺羟脯氨酸含量测量（图2D），这一发现得到了H&E和Pico Sirius染色的证实（图2E）。总之，这些数据表明，升高的多配体聚糖-1表达加剧了老年肺的纤维化重塑。鉴于衰老与细胞衰老之间已确立的关系，以及我们先前发现多配体聚糖-1参与衰老相关途径以加剧年轻小鼠的肺纤维化，我们接下来测试了多配体聚糖-1直接促进AT2细胞衰老，从而驱动适应不良修复和纤维化进展的假设。
AT2细胞中多配体聚糖-1的上调与AT2衰老相关
鉴于衰老与细胞衰老之间已确立的关系，以及我们先前发现多配体聚糖-1参与衰老相关途径以加剧年轻小鼠的肺纤维化（30），我们接下来测试了多配体聚糖-1直接促进AT2细胞衰老，从而驱动适应不良修复和纤维化进展的假设。为了进一步定义多配体聚糖-1与AT2细胞衰老之间的关系，我们首先利用已发表的scRNA-seq数据集（GSE122960）评估了IPF和对照肺中AT2细胞的复合转录组衰老评分（SenMayo衰老评分；补充表1）（32）。IPF AT2细胞表现出比对照AT2细胞显著更高的SenMayo衰老评分（图3A和补充图S7A），这一发现独立地在空间转录组数据集（GSE292956，补充图S7B）中得到重现。根据多配体聚糖-1表达水平（高表达SDC1Hi与低表达SDC1Low）对AT2细胞进行分层，揭示了SDC1表达与衰老评分之间的正相关（图3B）。为了在蛋白质水平验证这些转录组发现，我们对对照和IPF肺外植体进行衰老标志物p21的免疫染色，并量化了SDC1+ AT2细胞群中p21+细胞的比例。与对照相比，IPF肺中p21+SDC1+双阳性细胞的百分比显著更高（图3C和补充图S7C），支持了在人类纤维化肺中升高的多配体聚糖-1表达与AT2细胞衰老之间的联系。
补充这些人类数据，我们分析了已发表scRNA-seq数据集（GSE186246）中年轻和老年小鼠的AT2细胞，发现与未损伤对照相比，博来霉素损伤的年轻和老年小鼠的AT2细胞中SenMayo衰老评分均显著更高（图3D）。值得注意的是，在博来霉素损伤的小鼠中，老年AT2细胞的衰老评分高于年轻小鼠的AT2细胞，而在未损伤条件下未观察到年龄依赖性差异（图3D）。为了直接评估多配体聚糖-1对AT2衰老的贡献，我们比较了年轻（GSE134948）和老年（GSE292961）WT与Sdc1−/−小鼠的AT2细胞转录组（补充图S8–S9）。在年轻和老年队列中，博来霉素损伤的Sdc1−/− AT2细胞均表现出比WT AT2细胞显著更低的SenMayo衰老评分（图3E，补充图S10A–B）。一致地，与WT相比，年轻博来霉素损伤的Sdc1−/−全肺匀浆中衰老标志物p16和p21的表达降低（图3F和补充图S10C）。总之，这些发现证明了多配体聚糖-1表达与AT2细胞衰老在人类和小鼠系统中保守关联，支持多配体聚糖-1作为纤维化肺疾病中上皮衰老的关键调控因子。
多配体聚糖-1介导肺上皮细胞衰老
为了证明多配体聚糖-1在AT2细胞衰老中的直接作用，我们从未损伤的WT和Sdc1−/−小鼠的FACS分选SftpcCreER.R26-tdTomato+细胞中生成AT2肺泡球，并在博来霉素暴露后评估衰老。在博来霉素刺激48小时后，WT AT2肺泡球中p16+细胞的比例显著高于Sdc1−/−肺泡球（图3G）。在多柔比星诱导的衰老中也观察到p16和p21表达的类似降低（补充图S10D）。
为了进一步定义多配体聚糖-1在促进肺上皮细胞衰老中的作用，我们使用了小鼠和人类肺上皮细胞模型。首先在工程化过表达（OE）或敲除（Sdc1敲除；KO）多配体聚糖-1的小鼠肺上皮MLE-15细胞中评估衰老，以空载体或非靶向向导RNA作为对照（Ctrl）。通过流式细胞术确认了多配体聚糖-1的表达水平（补充图S11A–S11D）。在未受扰动的MLE-15细胞中，过表达多配体聚糖-1（MLE-15-OE）在没有细胞刺激的情况下使p16和p21表达高于对照（图4A）。相比之下，与对照细胞相比，MLE-15-KO在基线和博来霉素刺激后均表现出p21表达降低（图4A）。此外，血清饥饿MLE-15细胞48小时增加了OE细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，其次是WT和KO细胞（图4B）。这些数据表明，多配体聚糖-1的改变与细胞衰老正相关。与这些发现一致，在人肺上皮细胞系（BEAS-2B和A549细胞，补充图S11C–D）中沉默或敲低SDC1导致p21表达降低，并且与对照相比，SA-β-gal活性减弱（图4C–D）。在SDC1沉默的BEAS-2B细胞中恢复多配体聚糖-1表达逆转了这些效应（图4C）。总之，这些数据表明，多配体聚糖-1表达以细胞自主方式直接正向调节上皮细胞衰老。
过量多配体聚糖-1损害AT2细胞更新和分化
我们接下来使用AT2肺泡球实验检查了过量多配体聚糖-1对AT2细胞功能能力的影响。在未损伤条件下，WT和Sdc1−/− AT2肺泡球的集落形成效率（CFE）相当（图5A）。博来霉素损伤显著降低了两种基因型的CFE；然而，WT比Sdc1−/−肺泡球的降低更显著（图5A）。AT2分化评估显示，未损伤的WT和Sdc1−/−培养物中肺泡球形态正常（补充图S12A）。相反，博来霉素损伤的WT AT2肺泡球表现出异常形态和AT1标志物（Pdpn）的定位失调，提示分化受损（图5B，补充图S12B–C）。这些异常在博来霉素损伤的Sdc1−/−肺泡球中得到缓解。总之，这些发现表明，升高的多配体聚糖-1水平损害了AT2更新，并破坏了肺损伤后的正常分化。
过量多配体聚糖-1损害肺组织中的AT2细胞功能
鉴于AT2细胞合成并分泌表面活性蛋白C（SP-C），这是肺泡稳定性的关键调节因子，且SP-C功能障碍与纤维化肺疾病相关（33–36），我们接下来使用精密切割肺切片（PCLS）评估了肺微环境中的AT2细胞功能。从未损伤和博来霉素损伤后第14天的WT和Sdc1−/− SftPCLS 实验：从未损伤和博来霉素损伤后第14天的WT和Sdc1−/− Sftpc谱系示踪小鼠（Sftpc.CreER.R26-tdTomato；每组N=3）制备精密切割肺切片，并在IncuCyte S3活细胞成像系统中培养7天。代表AT2细胞丰度的tdTomato（红色）荧光强度，在博来霉素损伤的Sdc1−/− PCLS中显著高于匹配的WT PCLS（图5C–D，补充图S13），而绿色自发荧光（反映间充质或纤维化成分）在Sdc1−/−组织中也有所降低（图5C；补充图S14）。与AT2功能保留一致，通过ELISA测量第3天PCLS培养基中的SP-C水平，Sdc1−/−切片显著高于WT切片（图5E）。这些数据进一步支持过量多配体聚糖-1损害损伤后AT2细胞功能的结论。
多配体聚糖-1诱导p53乙酰化
为了确定多配体聚糖-1下游的衰老信号通路，我们使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）对IPF与对照肺（GSE122960）中AT2差异表达基因进行了上游调控因子分析（16）。TP53成为IPF AT2细胞中激活最显著的转录调控因子之一（z-score = 2.27；校正P = 2.6 × 10⁻⁶²）。构建以SDC1和TP53为中心的相互作用网络，揭示了连接两个通路的多个共享节点，包括CDC42和TGFB1等调控因子，提示多配体聚糖-1–TP53串扰参与衰老调控（图6A，蓝线）。
我们接下来使用一个未发表的整合scRNA-seq队列，评估了人类AT2细胞中的转录组p53活性评分（补充表2）。根据多配体聚糖-1表达分层的AT2细胞显示，IPF与对照细胞相比，p53活性评分显著更高，且SDC1Hi AT2细胞在两组中均表现出升高的p53活性（图6B）。与这些发现一致，博来霉素损伤的小鼠AT2细胞表现出增加的p53活性，在老年小鼠中观察到最高评分（图6C，补充图S15A）。根据多配体聚糖-1表达分层重现了人类模式（图6D）。WT和Sdc1−/− AT2细胞的比较显示，Sdc1缺陷细胞中p53活性有减弱趋势，尤其是在老年队列中（补充图S15B–C），而年轻AT2细胞显示出最小的基因型依赖性差异（补充图S15B–C）。鉴于先前报道p53乙酰化在p21诱导中的作用（37），我们检测了博来霉素刺激后WT和Sdc1−/− MLE-15细胞中赖氨酸379（K379）处的p53乙酰化。在WT细胞中，p53K379乙酰化被强烈诱导，但在博来霉素暴露24小时后，Sdc1−/−细胞中显著降低（图6E），而总p53丰度无差异。此外，p53乙酰化降低与p21下调相关（图6F）。这些发现表明，多配体聚糖-1通过调节p53激活促进上皮衰老。
总之，这些发现表明，多配体聚糖-1促进上皮衰老，可能通过p53依赖性信号传导，损害AT2更新、分化和分泌功能，从而驱动肺疾病中的适应不良修复和纤维化重塑。
讨论
肺泡2型（AT2）细胞是肺损伤后肺泡修复的核心，AT2祖细胞功能障碍是肺纤维化的一个定义性特征。在本研究中，我们将过量多配体聚糖-1确定为一种先前未被认识的上皮调控因子，它通过细胞自主性AT2衰老促进适应不良修复和纤维化重塑。通过整合人类转录组分析、小鼠遗传模型和基于上皮细胞的系统，我们证明多配体聚糖-1可能通过激活p53信号传导驱动AT2衰老，从而损害更新并促进异常分化。
衰老的AT2细胞在IPF和实验性肺纤维化中积累，并与疾病进展密切相关。我们表明，在人类IPF、衰老和博来霉素诱导的肺损伤中，多配体聚糖-1在纤维化AT2细胞中持续上调，并且其过量直接加剧衰老，损害基本的AT2细胞功能，包括集落形成和分化。这些缺陷与新兴的空间转录组数据一致，这些数据确定了富含多配体聚糖-1的异常上皮群体（38,39），这些群体被困在功能失调的过渡状态中。这些发现支持一个模型，其中多配体聚糖-1诱导的衰老将AT2细胞锁定在非再生程序中，维持发育不良修复和纤维化。相反，多配体聚糖-1缺失可减轻衰老，保留AT2干性，并改善上皮功能，确立了多配体聚糖-1在纤维化过程中AT2衰老中的因果作用。多配体聚糖-1诱导的AT2衰老与表面活性蛋白C减少之间的直接联系，无论是由于AT2细胞数量减少还是产生和分泌受损，都需要进一步研究。我们推测，多配体聚糖-1可能作为已知衰老介导分子的共受体或直接与之相互作用，包括生长因子，如胰岛素样生长因子（IGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）。
在机制上，我们的数据将多配体聚糖-1置于p53衰老轴的上游。我们证明，过量多配体聚糖-1促进p53在赖氨酸379处的乙酰化，增强p53转录活性而不改变总p53水平。与先前的报告一致（40），我们的工作首次提供了跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖直接调节肺上皮细胞中p53激活的证据，将上皮表面信号传导与衰老诱导联系起来。
多配体聚糖-1在衰老中的作用似乎具有背景依赖性，因为先前的研究在成纤维细胞中报道了不同的效应（41,42）。我们的工作定义了在纤维化肺疾病中，过量的完整多配体聚糖-1具有促衰老、上皮特异性的作用。鉴于AT2衰老在纤维化发病机制中的核心作用，恢复多配体聚糖-1稳态可能成为促进上皮修复的策略。未来的研究使用多配体聚糖-1 AT2特异性遗传操作和离体肺模型，对于确定靶向多配体聚糖-1治疗肺纤维化的转化可行性至关重要。
方法
细胞系和3D小鼠AT2肺泡球培养
小鼠肺上皮细胞（MLE-15；Applied Biological Materials，加拿大不列颠哥伦比亚省）、人支气管上皮细胞（BEAS-2B；ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州）和人肺泡上皮癌细胞（A549；ATCC）按照既定方案培养。MLE-15细胞维持在补充有2%胎牛血清（FBS；HyClone，洛根，犹他州）、1%青霉素-链霉素（Corning）、10 nM β-雌二醇（MilliporeSigma，伯灵顿，马萨诸塞州）、10 nM氢化可的松（MilliporeSigma）和胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；Gibco，Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州）的DMEM/F-12（1:1；Corning，盐湖城，犹他州）中。BEAS-2B细胞在BEGM基础培养基中培养，并补充支气管上皮细胞生长培养基BulletKit（Lonza，莫里斯敦，新泽西州）。A549细胞在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中维持。所有细胞系均在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。
CRISPR/Cas9介导的多配体聚糖-1缺失（SDC1敲除；KO）由Synthego公司（Redwood City，CA，USA）在MLE-15和A549细胞中执行。使用慢病毒转导在MLE-15细胞中过表达小鼠多配体聚糖-1（OE），并使用靶向SDC1的shRNA在BEAS-2B细胞中敲低多配体聚糖-1（SDC1 KD），在敲低条件下按指示进行小鼠多配体聚糖-1的重新表达。慢病毒和CRISPR实验分别使用空载体对照和非靶向向导RNA构建体。通过流式细胞术确认所有细胞系中多配体聚糖-1的表达水平。
三维（3D）AT2肺泡球培养按照既定方案生成和维持（43）。简言之，使用酶消化法从小鼠肺中分离AT2细胞，如先前所述（43,44）。单细胞悬液用谱系特异性表面标志物染色，并通过荧光激活细胞分选纯化AT2细胞，为DAPI⁻CD31⁻CD45⁻EpCAM⁺tdTomato⁺细胞。新鲜分选的AT2细胞与小鼠肺成纤维细胞（MLg；ATCC）和生长因子减量Matrigel（Corning Matrigel基底膜基质，GFR）按1:1比例混合，铺在0.4 μm transwell插入物上。肺泡球在AT2生长培养基（DMEM/F-12补充10%活性FBS、ITS、1%抗生素-抗真菌剂和TGF-β受体抑制剂SB-431542；MilliporeSigma）中培养，置于24孔transwell板的下室。培养物在37°C、5% CO₂下维持，通过使用Nikon Eclipse Ti-E显微镜（Nikon Instruments Inc.，Melville，NY，USA）进行连续成像来量化集落形成效率（CFE）。
动物
所有动物实验均获得Cedars-Sinai医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）（方案#00009018）的批准，并按照NIH指南进行。C57BL/6野生型（WT）和全身多配体聚糖-1缺陷（Sdc1−/−）小鼠在无特定病原体条件下维持。年轻小鼠8-12周龄，老年小鼠18-24月龄。所有小鼠均来自内部繁殖菌落。根据初步数据显示雄性小鼠肺纤维化显著，所有实验均使用雄性小鼠。小鼠随机分配到实验组。
博来霉素诱导的肺损伤和纤维化模型
在异氟烷麻醉后，通过单次气管内给予博来霉素硫酸盐（0.25–0.75 U/kg；APP Pharmaceuticals，Schaumburg，IL，USA）诱导肺纤维化。无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）用作媒介物对照。博来霉素剂量根据年龄、基因型和实验终点选择，并与在年轻和老年小鼠中诱导可重复肺损伤和纤维化同时最小化死亡率的既定方案一致。每日监测动物是否有痛苦的临床体征，包括活动、梳理和体重的变化。根据实验设计，在博来霉素给药后第14、21或28天进行支气管肺泡灌洗液（BALF）收集和肺组织收获。肺组织用于下游分析，包括酶消化制备单细胞悬液、蛋白质提取、组织学评估和羟脯氨酸定量。
精密切割肺切片（PCLS）
从未损伤（对照）和博来霉素损伤的Sftpc.CreER-R26-tdTomato WT和Sdc1−/−小鼠制备精密切割肺切片，按照先前发表的方案（45）。使用Precisionary Compresstome（VF-510-0Z；Precisionary Instruments，Ashland，MA）进行肺组织切片。PCLS在补充有0.1%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的无酚红DMEM（Thermo Fisher Scientific）中培养。培养物在IncuCyte活细胞成像加湿培养箱中维持，温度为37°C，5% CO₂，进行长达7天的连续活细胞成像。PCLS的免疫荧光染色如先前所述进行（45）。
蛋白质测定、组织学和免疫染色
使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定法（Pierce，Thermo Fisher Scientific）根据制造商的说明对细胞裂解物、组织匀浆和培养上清液进行蛋白质浓度定量。蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定（ELISA）和羟脯氨酸测定如先前所述进行（30）。
福尔马林固定、石蜡包埋的人和小鼠肺组织切片厚度为4–10 μm，并使用标准方案进行组织学分析。简言之，切片风干以促进组织粘附，并在染色前于60°C烘烤2小时。脱蜡和再水化后，通过在1×柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中蒸煮切片20分钟进行抗原修复。切片用0.2% Triton X-100在PBS中透化10分钟，并用5%牛血清白蛋白（BSA）在PBS中封闭45分钟。切片在4°C下与一抗孵育过夜，次日与适当的二抗孵育。苏木精和伊红（H&E）、Masson三色、天狼星红和免疫荧光染色按照既定的实验室方案进行（30）。所有抗体克隆及其他细节，包括来源和目录号，列于补充表3。使用Nikon Eclipse Ti2显微镜（Nikon Instruments Inc.，Melville，NY，USA）或Axioscan 7玻片扫描仪（Carl Zeiss Microscopy，Oberkochen，Germany）以20倍放大倍数采集图像。
图像分析和定量
使用Nikon NIS-Elements软件配合General Analysis 3（GA3）模块和QuPath（版本0.6.0（46））进行全组织切片图像分析。对于Nikon GA3分析，优化查找表（LUT）设置以最小化背景荧光，并在定量前统一应用于所有图像。然后使用滚动球背景减除和自动对比度功能处理图像，以校正不均匀照明并增强物体检测。使用Bright Spots检测在每个荧光通道中识别细胞，并根据细胞大小、局部对比度和信号强度阈值进行过滤。使用Clean功能去除斑点，并使用Grow Regions、Grow Objects和Make Cell功能进一步分割和勾勒细胞轮廓，根据与DAPI阳性核的重叠选择性保留感兴趣区域（ROI）。导出通过荧光标记的总细胞计数以及每个细胞的平均和最大荧光强度，用于下游分析。QuPath也用于全玻片图像分析和细胞分割。在代表性区域训练细胞分类器，并应用于整个组织切片以确定标志物特异性细胞计数。
单细胞RNA测序（scRNAseq）
年轻对照和博来霉素损伤的WT和Sdc1−/−队列详情已发表（30）。对于老年小鼠队列，将新鲜收获的博来霉素损伤的WT和Sdc1−/−小鼠肺用弹性蛋白酶（Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ）和Liberase（RocheTM，Millipore-Sigma）进行酶消化，然后机械破碎生成单细胞悬液，如先前所述（16）。活肺细胞悬液（DAPI⁻）通过流式分选为肺免疫细胞（CD45⁺）、内皮细胞（CD31⁺）、上皮细胞（CD326⁺）和基质细胞（CD45⁻CD31⁻CD326⁻）。所有四种细胞类型等比例混合，并使用EvercodeTM WT mini kit v2进行单细胞捕获和条形码制备及文库构建（Parse Bioscience，Seattle，WA），遵循制造商方案。使用Illumina Novaseq SP在200个循环下进行测序，获得8亿个读数（Illumina，San Diego，CA），在Cedars-Sinai医学中心应用基因组学、计算和转化（AGCT）核心设施进行。使用ParseBiosciences–Pipeline 1.1.2默认设置进行解复用和将读数比对到小鼠GRCm39参考基因组。
RNAseq数据分析
使用单细胞分析R包Seurat v5.0进行进一步数据分析（47）。对于质量控制并过滤掉低质量细胞，仅选择表达超过200个基因（定义为在至少3个细胞中检测到的基因）且线粒体基因少于10%的细胞。为最小化每个数据集的二倍体污染，使用Doubletfinder流程去除潜在二倍体，二倍体比率根据10X Genomics用户手册中建议的“多倍体率”/“回收细胞数”比率使用拟合模型确定（48）。使用批次校正包Harmony进行Harmony 批次校正包进行数据整合（49）。使用主成分分析（PCA）处理批次校正，选取3000个变异最大的基因，并使用前30个独立成分进行下游无偏聚类，分辨率为0.6。使用均匀流形近似和投影（UMAP）方法进行无监督聚类的可视化。使用主要免疫细胞类型的已知基因标志物确定细胞簇身份（50）。使用基于模式的单细胞转录组学分析（MAST）计算不同簇和组之间的差异表达基因（51）。校正后p值<0.05的差异表达基因用于下游分析。使用WebGestalt进行KEGG通路的功能富集分析，如所述（52）。
上游调控因子和网络分析
使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA，Qiagen，CA）基于IPF和对照样本中AT2细胞的scRNAseq差异表达（校正后P值<0.05）基因模式识别上游调控因子。使用IPA的知识库，以多配体聚糖-1和TP53为种子生成相互作用网络。
空间转录组测序和分析
空间转录组数据集可通过基因表达综合数据库（GEO）以登录号GSE292956访问。使用Visium 10x方案（10X Genomics，Pleasanton，CA）制备和处理样品。使用10x Genomics Space Ranger流程进行主要数据处理。使用Partek Flow软件（Illumina，San Diego，CA）进行下游分析。
使用Partek Flow软件（Illumina，San Diego，CA）分析空间转录组数据，用于处理Space Ranger输出并进行下游归一化、降维、聚类和差异表达分析。使用词频-逆文档频率（TF-IDF）进行数据归一化和缩放。使用主成分分析（PCA）、t分布随机邻域嵌入（t-SNE）和均匀流形近似和投影（UMAP）进行降维。使用Seurat v3整合处理批次效应。使用k-means、基于图的和层次聚类方法进行细胞聚类，随后进行基于生物标志物的计算分析用于簇注释。使用DESeq2和非参数统计检验（包括Kruskal–Wallis检验及Dunn多重比较检验）进行差异基因表达分析。在适用时，使用Student t检验进行均值的成对比较。
统计分析
所有数据均以均值±SEM表示，除非另有说明。使用GraphPad Prism（版本9或更高版本）和R进行统计分析，视情况而定。两组间比较使用非配对双尾Student t检验或当数据不符合正态性假设时使用非参数等效检验。多组间比较使用单因素或双因素方差分析及适当的Post hoc多重比较检验，或Kruskal–Wallis检验及Dunn校正，如所示。对于转录组分析，使用DESeq2评估差异基因表达，统计显著性定义为假发现率（FDR）阈值<0.01，除非另有说明。除非技术受损，否则不排除任何数据。每个实验的样本量、生物学重复和使用的统计检验在相应的图例中注明。
研究批准
人类肺组织在Cedars-Sinai医学中心（CSMC；洛杉矶，CA）收集、处理和储存，遵循指南并获得CSMC机构审查委员会（IRB# Pro00035409）的批准。动物实验按照CSMC机构动物护理和使用委员会（IACUC#000009018）的批准进行。
作者贡献
CY、ME、XL、TP、DJ、PWN、CH、BRS、WCP和PC参与了所有实验的概念设计。TP、CY、XL、YW、ZO、SC、KM、AS和EB进行了实验。CY、ME、XL、CLM、SAG和TP分析了数据。MZ、VK、XZ、LLP、YW、SJ、AC、FC、JL、DJ、CME、DJ、CH、NB和BRS提供了材料和技术支持。TP、CY、ME、XL、PWN、WCP、SAG和PC参与了手稿的撰写。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由NIH资助R01HL174973（CY）、HL120947（PC）、HL103868（PC）、HL137076（PC）、AI137111（SAG）、K08 HL141590（TP）、K01AG090692（LP）、T32HL170963-01A1（AS）和加州再生医学研究所（CIRM EDUC4-12751）（AS）支持。
资助信息声明
NHLBI, NIH: HL174973, HL120947, HL103868, HL137076, HL141590
NIAID, NIH: AI137111
NIH Common Fund: T32HL170963-01A1
California Institute for Regenerative Medicine: CIRM EDUC4-12751
参考文献
（此处省略参考文献列表，因其为学术引用格式，非新闻正文内容）
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