心房颤动(AF)是肥厚型心肌病(HCM)中最常见的心律失常，在约25%的患者中出现，这一比例比普通人群高4-6倍。心脏肌球蛋白抑制剂(CMIs)，包括mavacamten和aficamten，是治疗梗阻性HCM的首类药物。尽管随机临床试验的开放标签扩展研究表明，接受aficamten治疗的患者中仅有2%-4%发生心房颤动，但另一项无对照的回顾性研究提示，在开始mavacamten治疗后，新发心房颤动的风险要高得多(约15%)。最近的一项体外研究为CMI治疗增加心房颤动风险提供了合理机制：使用实验性CMI blebbistatin降低肌丝钙离子(Ca²⁺)缓冲能力，通过促进自发性钙释放(SCR)事件来促进心房颤动，而这些事件是已知的晚后除极和心房颤动风险的驱动因素。由于这些实验是在野生型(WT)心肌细胞中进行的，尚不清楚这一机制是否也适用于HCM心肌细胞，因为在HCM心肌细胞中，CMI治疗可使由HCM突变引起的病理性增加的肌节钙离子结合恢复正常。本研究测试了实验性CMI、mavacamten类似物MYK-581对表达细丝HCM变异Tnnt2-I79N的小鼠HCM模型中心肌细胞钙离子处理和心房颤动可诱导性的影响，该模型与WT小鼠相比具有增强的肌丝钙离子结合能力。
图1 Tnnt2-I79N小鼠表现出进行性心房肌病，心房颤动(AF)的诱导风险增加，而急性使用心脏肌球蛋白抑制剂MYK-581可抑制这一风险。
A) 基于改良的美国超声心动图学会参数的舒张功能障碍分级(0-3)。对于小鼠评分，以下参数各计1分：二尖瓣PW多普勒的E/A比值(E/A<0.8或E/A>1.8 ms/ms)、室间隔组织多普勒的E/e'比值(E/e'>25 ms/ms)，以及通过胸骨旁长轴和四腔心切面的二维测量评估并按体表面积指数化的心房容积指数(LAVI>1.4 μL/mm²)。Tnnt2-I79N小鼠在12至24周龄之间表现出进行性舒张功能障碍。样本量：5只野生型(WT)和7只Tnnt2-I79N小鼠(1只WT和1只Tnnt2-I79N小鼠因多普勒信号不佳而排除舒张功能测量)。P值通过双向ANOVA与Tukey多重比较检验获得。
B) Tnnt2-I79N小鼠中心房肌病标志物的基因表达。使用TriZol从整个左心房分离RNA，并使用SuperScript IV VILO cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用TaqMan基因表达分析试剂盒、TaqMan Fast Advanced qPCR试剂盒和QuantStudio 5对特定靶标进行基因表达测量。与WT小鼠相比，Tnnt2-I79N小鼠的心房在24周时表现出纤维化胶原标志物(Col1α1、Col1α3)和促纤维化信号(Tgfβ1)；心壁应力标志物(Nppa[ANP]和Nppb[BNP])；以及细胞肥大(Myh7与Myh6的比值)表达增加。样本量：6只WT和6只Tnnt2-I79N小鼠。P值通过Kruskal-Wallis检验与Dunn事后检验获得。
C) 24周龄Tnnt2-I79N或WT同窝小鼠的Masson三色染色代表性图像。组织学检查由范德比尔特大学医学中心(VUMC)临床病理资源完成。整个切片在VUMC数字病理共享资源中使用Aperio Versa 200 Bright Field成像仪进行扫描。使用QuPath软件量化心房纤维化。样本量：5只WT和6只Tnnt2-I79N小鼠。P值通过Mann-Whitney检验获得。
D) MYK-581处理后心房肌细胞钙离子(Ca²⁺)处理能力。从24周龄Tnnt2-I79N或WT心房分离肌细胞，并用Fura-2乙酰甲氧基甲酯(Fura-2 AM；Invitrogen)负载。负载Fura-2 AM的肌细胞用载体(DMSO)或1 μM MYK-581预孵育1小时。然后，肌细胞在1 Hz和3 Hz场刺激下各电刺激10秒，随后停止电刺激30秒。使用双光束激发荧光光度测量装置(IonOptix Corp)记录细胞内Ca²⁺比值。舒张期[Ca²⁺]在刺激序列结束时量化，并归一化为咖啡因应用前30秒间隔内的平均舒张期[Ca²⁺]。自发性Ca²⁺释放(SCR)事件(箭头)在刺激序列停止后的30秒间隔内量化。代表性的Ca²⁺记录来自急性处理(1 μM MYK-581或载体)后从WT和Tnnt2-I79N小鼠分离的心房肌细胞。
E) 如插图所示，在3Hz快速刺激期间舒张末期[Ca²⁺]变化的量化。与WT心房细胞相比，TnnT2-I79N细胞在3Hz刺激期间表现出舒张末期[Ca²⁺]显著更大的增加，而1 μM MYK-581可降低这一增加。样本量：3只WT小鼠(n=25个载体细胞，n=27个MYK-581细胞)和2只Tnnt2-I79N小鼠(n=11个载体细胞，n=13个MYK-581细胞)。P值通过Kruskal-Wallis检验与Dunn事后检验获得。
F) 急性处理(1 μM MYK-581或载体)后SCR的量化。Tnnt2-I79N肌细胞与WT肌细胞相比表现出增加的SCRs。MYK-581降低了Tnnt2-I79N肌细胞中的SCRs，但增加了WT肌细胞中的SCRs。样本量：3只WT小鼠(n=25个载体细胞，n=27个MYK-581细胞)和2只Tnnt2-I79N小鼠(n=11个载体细胞，n=13个MYK-581细胞)。P值通过Kruskal-Wallis检验与Dunn事后检验获得。
G) 体内双交叉研究示意图。24周龄Tnnt2-I79N或WT同窝小鼠在心房猝发刺激前30分钟接受MYK-581(2 mg/kg或5 mg/kg)或载体(10% DMSO)处理。使用八极2F电极导管(CIB'ER MOUSE™；NuMED, Inc)在六个不同周期长度(50、40、30、25、20和15 ms)下各进行15秒经食管心房猝发刺激。所有刺激序列之间有30秒的恢复时间。心房颤动发作定义为持续超过1秒的快速心房活动和不规则心室率。
H) 经食管心房猝发刺激的代表性心电图，显示正常窦性心律和心房颤动。如果在WT动物中诱导出心房颤动，其持续时间通常较短，而在Tnn2-I79N动物中则持续时间长得多。
I) 急性MYK-581处理降低Tnnt2-I79N小鼠中心房颤动的可诱导性。量化非持续性心房颤动(<30秒)和持续性心房颤动(>30秒)。WT小鼠在基线时心房颤动可诱导性的发生率较低，且MYK-581处理不会增加这一发生率。Tnnt2-I79N小鼠在基线时心房颤动可诱导性的发生率增加，而MYK-581处理可剂量依赖性地降低这一发生率。样本量：35只WT小鼠(n=22为2 mg/kg MYK-581，n=13为5 mg/kg MYK-581)和43只Tnnt2-I79N小鼠(n=30为2 mg/kg MYK-581，n=13为5 mg/kg MYK-581)。P值通过Fischer精确检验获得。
J) 急性MYK-581处理降低Tnnt2-I79N小鼠中心房颤动的持续时间。与WT相比，Tnnt2-I79N小鼠在猝发刺激后心房颤动持续时间更长，而MYK-581可剂量依赖性地降低这一持续时间。在WT小鼠中，猝发刺激后心房颤动持续时间没有变化。样本量：35只WT小鼠(n=22为2 mg/kg MYK-581，n=13为5 mg/kg MYK-581)和43只Tnnt2-I79N小鼠(n=30为2 mg/kg MYK-581，n=13为5 mg/kg MYK-581)。P值通过Mann-Whitney检验获得。
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