通过测量视网膜血管和神经源性变化研究认知障碍的多模式诊断眼部生物标志物 - 认知障碍

摘要

先前的研究表明，认知障碍不限于大脑，还会影响视网膜。在这项初步研究中，我们使用低成本的多模式方法，调查了认知障碍患者视网膜血管复杂性与神经退行性变化之间的相关性。对每位受试者（n=69）使用先进的视网膜成像、全视野视网膜电图和视觉表现检查，进行视网膜结构和功能的量化。使用新加坡血管评估软件计算视网膜血管参数。使用蒙特利尔认知评估来测量认知障碍。在变量之间进行皮尔逊积矩相关。在69名参与者中，32人患有认知障碍（46%）。我们发现，与对照组（0.6 ± 0.2）相比，认知障碍个体的微血管网络显著改变（较大的静脉不对称因子：0.7 ± 0.2）。认知障碍个体的血管分形维数较低（容量、信息和相关维度：D0, D1, 和 D2（均值 ± 标准差）：1.57 ± 0.06; 1.56 ± 0.06; 1.55 ± 0.06; 年龄 81 ± 6岁）对比对照组（1.61 ± 0.03; 1.59 ± 0.03; 1.58 ± 0.03; 年龄：80 ± 7岁）。此外，在轻度认知障碍受试者中，观察到周边视网膜的类玻璃膜疣区域以及色素分散。在认知障碍受试者中观察到颜色视觉的功能丧失，以及较小的ERG振幅和较大的峰值时间。皮尔逊积矩相关显示血管参数（动静脉比、总长径比、D0、D1、D2）与闪烁反应的隐式时间之间存在显著关联，但这些关联在偏相关中不显著。这项研究表明，存在可能对认知障碍下降敏感的多模式视网膜标记，并进一步证明存在统计趋势，表明视网膜神经元功能障碍与微血管变化之间存在相关性，提示视网膜几何血管和功能参数可能与认知障碍导致的视网膜生理变化有关。我们怀疑，对结构-功能参数组合的分析，而不是单个生物标志物，可能提供有用的认知障碍临床标志物，也可能为认知障碍的鉴别诊断提供更高的敏感性和特异性。然而，由于我们的研究样本量较小，我们方法临床适用性的全部范围仍具有挑战性，有待确定。

引言

根据2015年世界阿尔茨海默病报告，全球约有4600万痴呆症患者。这个数字大约每20年翻一番，预计到2050年将增加到1.315亿。据估计，全球痴呆症相关的医疗保健总成本为8180亿美元，到2030年将上升到2万亿美元。阿尔茨海默病是老年人中最常见、进行性的痴呆症原因，给全球老龄化社会带来了沉重负担。此外，痴呆症在帕金森病病程较长的老年患者中最常见，在多发性硬化症患者中最少见。先前的研究表明，阿尔茨海默病在临床表达之前几十年就已开始。因此，在早期症状出现之前很久就有可能识别出最终会表现出该疾病的人，并对这些高风险个体进行潜在的干预以预防疾病表达。作为大脑的解剖学组成部分，视网膜与中枢神经系统共享重要的结构和致病途径。眼病理与阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症之间的联系已在多项研究中得到证实。特别是，阿尔茨海默病中与视神经参数相关的神经元丢失包括视网膜神经节细胞，这些细胞与大脑皮层中的神经元相似，并已被证明与阿尔茨海默病的神经退行性变相关。最近，神经电生理学和光学成像技术的进步使得使用视网膜电图和先进的视网膜成像进行非侵入性的形态和功能测量成为可能。具体而言，视网膜微血管变化以及视网膜神经节细胞、感光细胞和视神经的异常生物电活动已被发现与认知下降和与衰老及早期阿尔茨海默病相关的大脑变化有关。此外，有人假设，如果大脑中的淀粉样蛋白与眼睛中的淀粉样蛋白之间存在关联，那么通过观察眼睛来诊断阿尔茨海默病将是可行的。因此，通过容易进入的视网膜非侵入性探索认知障碍的大量研究值得进一步调查，以支持在无症状期使用视网膜生物标志物检测认知下降。生物标志物的发现是一个复杂的过程，需要考虑多种因素和方法，以获得可靠的标志物，使我们能够非常早期地预测风险或治疗反应，并且具有低假阳性和假阴性率。不幸的是，认知下降一级预防的关键障碍是缺乏快速、非侵入性、敏感且低成本的生物标志物。在这项初步研究中，我们使用低成本的多模式方法，调查了视网膜组织中血管复杂性和神经退行性变化在多大程度上导致认知功能差异。我们的中心假设是，多变量眼生物标志物反映了认知障碍的独特眼-脑特征，可能与其发生和进展相关。因此，对每位研究参与者使用先进的视网膜成像、全视野视网膜电图以及视觉表现检查，对视网膜血管网络复杂性及其神经功能进行量化。我们的初步发现表明，这种评估老年人视觉能力的多模式方法可能增加与认知下降相关的早期视觉通路损伤的预测价值，并促进引入新型低成本的早期检测认知障碍的多模式眼生物标志物。

材料和方法

迈阿密大学人类研究伦理委员会（美国佛罗里达州迈阿密）批准了本研究中描述的所有方案和方法。本研究遵守《赫尔辛基宣言》中概述的原则。在详细解释所有测试程序后，获得了所有参与者的知情同意。所有研究受试者均接受了认知功能评估和视网膜电图，随后进行了先进的视网膜成像、色觉测试和双眼视觉表现检查。

研究参与者

前瞻性认知障碍受试者以非系统的方式识别，因为他们在诊所中出现，或从参加成人护理中心和社区诊所并被诊断为阿尔茨海默病的人群中识别。研究受试者通过多种方式招募，包括传单、在大学新闻稿中引起佛罗里达州迈阿密-戴德县和布劳沃德县社区的兴趣，以及在附近地区的阿尔茨海默病护理者支持小组中进行演讲。研究受试者（或对于认知下降患者，是可靠的护理者/信息提供者）被询问关于近期或疾病进展过程中可能发生的视觉主观变化。排除标准为年龄低于55岁以及在招募前有任何眼科病史。由于认知障碍影响决策能力而无法理解信息并做出参与研究决定的参与者，通过代理人获得知情同意。仔细检查黄斑和视盘区域是否有异常，并且除了白内障手术外无任何眼科病史的受试者被纳入分析。所有受试者在视觉表现测试中佩戴自己最佳的光学矫正镜。高血压和糖尿病以及心血管疾病都被视为与视网膜血管改变相关的合并医疗状况。此外，当前或过去研究受试者报告的吸烟状况（分类为当前、过去或从未）也被考虑，因为早期报告将吸烟与视网膜潜在的血管变化联系起来。

眼底成像与视网膜血管网络定量分析

使用非散瞳数码相机（EasyScan，iOptics，荷兰）拍摄每只眼睛的视网膜眼底照片，该相机基于扫描激光检眼镜技术，对白内障等介质混浊有更好的穿透力。其高分辨率图像揭示了传统眼底相机无法看到的内容，这要归功于其多平面原理（图1）。这款低成本相机视野为45°，图像尺寸为1024×1024，需要最少的操作员培训，旨在最大化患者流量。此外，其紧凑、符合人体工程学的设计和低功耗闪光有助于确保患者舒适度。此外，拍摄高对比度、详细的视网膜图像既简单又直观。只需按一下按钮，即可在任何地方操作，并在不到5分钟的时间内捕获双眼的图像。

图1：使用EasyScan设备（i-Optics公司，荷兰）获得并使用SIVA程序进行分析的代表性图像，该程序测量了从视盘发出的血管口径。小动脉为红色，小静脉为蓝色。SIVA软件自动检测视盘，并追踪距视盘边缘0.5至2.0个视盘直径区域的血管。视盘中心周围不同半径的圆形感兴趣区域标记为B（距视盘边缘0.5 – 1.0个视盘直径）和C（距视盘边缘0.5 – 2.0个视盘直径）。

所有参与者的视网膜图像被屏蔽并收集以便进一步分析。先拍摄右眼，然后拍摄左眼。每位参与者选定眼睛的以视盘为中心的图像，使用半自动计算机辅助程序“新加坡血管评估”（软件版本3.0，新加坡国立大学）进行分析。质量差的图像从分析中移除。在SIVA程序自动识别视网膜小动脉和小静脉后，由经过培训的评分员使用标准化方案进行调查（图1）。用于整体分析的圆形视网膜感兴趣区域为距视盘边缘0.5 – 1.0个视盘直径（图1中的B区）或距视盘边缘0.5 – 2.0个视盘直径（图1中的C区）。这种选择测量几何血管参数的特定感兴趣区域确保了视网膜血管已达到小动脉状态。通过将自动血管追踪与EasyScan设备获得的眼底图像进行比较，移除所有被追踪为血管的伪影。两位经验丰富的视网膜专家修订了SIVA软件自动生成的血管分类（即动脉/静脉），并评估了所有眼底照片，以识别和排除与年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和青光眼相关的视网膜病理特征。然后，由评分员纠正所有视网膜血管的错误分类，并丢弃显示年龄相关性黄斑变性迹象以及与其他病理特征（如渗出、水肿、棉绒斑、出血、微动脉瘤）和青光眼（可疑视盘凹陷）相关的图像。此外，获得最终的视网膜几何血管参数并用于进一步分析：视网膜血管口径，总结为中心视网膜动脉/静脉等效值、曲率迂曲度、分支系数、分支不对称因子、长径比和动静脉比，如先前研究所述。这些血管参数的可靠性评估和详细特征描述已在别处发表。SIVA程序基于修订的Knudtson–Parr–Hubbard公式计算CRAE和CRVE参数。这些参数代表中央视网膜血管的平均宽度。AVR由小动脉与小静脉口径的比率组成，并且不受由屈光不正和相机镜头调整引起的放大差异的影响。BC是主血管直径与其分支（也称为子血管）直径之间比率的估计值。因此，具有主血管与其分支血管直径可比大小的血管网络以较高的BC为特征，而分支直径相对于主血管的减小与较低的BC相关。此外，cTORT是一个迂曲度指数，定义为沿血管路径的曲率平方的积分除以总弧长。因此，cTORT考虑了弯曲和拐点。较直的血管以较低的迂曲度指数为特征。LDR是血管宽度的度量，定义为一个分叉点到下一个分叉点中点的血管长度。它表示为与第一个分叉点处父血管直径的比率。两个分支血管宽度的平方比用于计算AFa和AFv。

视网膜血管网络的分形维数

分形分析是一种用于测量自然现象复杂性的数学方法，是一种成熟可靠的方法，用于表征视网膜血管系统。该方法由Family等人于1989年引入眼科，此后，研究视网膜血管系统分形维数与疾病严重程度和进展之间关联的兴趣急剧增加。视网膜血管树可以用各种分形分析方法进行量化。血管分形维数表征了一个“全局”度量，包括视网膜血管树的整个分支模式。因此，更复杂的分支模式表示更大的分形维数值。不同尺度下的自相似性是分形结构的一个重要属性。这种自相似性意味着在不同的放大倍数或尺度下，可以感知到不同大小的相似模式。此属性可以用以下公式描述：N(r) ~ r^{-D}，其中N(r)是在尺度或放大倍数r下对分形结构复杂模式进行的某种测量；D是分形维数，表示随着分辨率放大倍数（尺度）的增加或减少，观察到多少新的相似模式。由于人类视网膜血管结构已被证明是几何多重分形，因此使用单分形和多重分形方法从骨架化的血管网络计算血管分形维数。与大多数研究不同，我们的方法没有使用视盘中心周围不同半径的圆形感兴趣区域。相反，为了获得可比较的分形维数值，骨架包含了整个45°视野中可观察到的整个分支模式。

图2：分形分析中使用的样本图像。左列图像是使用EasyScan系统获得的原始图像，而右列图像是它们各自用于分形分析的骨架图像。行（A）来自健康的认知正常个体（MoCA评分范围：29.6–25.2），行（B）来自轻度认知障碍受试者（MoCA评分范围：25.2–19），行（C）来自认知恶化程度高于轻度认知障碍的参与者（MoCA评分范围：21至11.4）。MoCA，蒙特利尔认知评估。

Liebovitch和Toth提出的盒计数法是估计分形对象分形维数最流行的单分形方法。该方法通过用矩形坐标网格覆盖对象并将数据分割成盒子，然后通过计算盒子数量来分析子集来生成数据。因此，公式（1）中的测量值N(r)是与血管分割或骨架重叠的边长为r的盒子数量，盒维数（DB）可以作为N(r)相对于r的双对数图斜率的绝对值来计算。多重分形方法用于研究尺度对多重分形维数的影响。在这种方法中，结构中的多重分形行为通过寻找广义维数Dq来描述，该维数与表示不同尺度分形性质的q值相关。Dq与q的图通常是S形的，并且随着多重分形配置而减小。该方法已被有效用于证明扩散限制聚集分形维数的几何多重分形性。某些研究考虑确定的Dq值（例如，D0, D1, 和 D2），这些值在满足D0 ≥ D1 ≥ D2条件时描述对象的多重分形特征。特别地，容量维数Do（或盒计数）被报道始终大于信息维数D1，而信息维数又始终大于相关维数D2（即全部满足Do > D1 > D2）。在所有研究中，所有三个广义维数（Do, D1, 和 D2）都显著低于DLA分形维数（D ≈ 1.7）。D1测量随机事件的不确定性或熵，对于经常发生的事件较低或信息量较少，而对于可能较少发生的事件则较大或信息量较多。D2通过区域内两个像素之间的关联来估计分形维数。因此，在我们的研究中，使用q值范围在-10到+10之间的广义维数谱分析视网膜图像中的多重分形行为，其中所有维数都经过统计检验。因此，计算并比较了Do, D1, 和 D2，以检查一致性，其中Do > D1 > D2。使用公共领域Java图像处理程序ImageJ以及FracLac插件来计算#### 视网膜血管网络的多重分形分析

视网膜血管树已被证明具有几何多重分形特性。因此，我们使用单分形和多重分形方法从骨架化的血管网络中计算血管分形维数。与大多数研究不同，我们的方法没有使用视盘中心周围不同半径的圆形感兴趣区域，而是将整个45°视野中可观察到的完整分支模式骨架化，以获得可比较的分形维数值。

图2展示了分形分析中使用的样本图像。左列为原始图像，右列为相应的骨架图像。行(A)来自健康认知个体，行(B)来自轻度认知障碍受试者，行(C)来自认知功能较轻度认知障碍更差的参与者。

我们采用Liebovitch和Toth提出的盒计数法，这是最常用的单分形方法。该方法通过用矩形坐标网格覆盖对象，将数据分割成盒子，并计数盒子数量。测量值N(r)是与血管骨架重叠的盒子数量，盒维数DB通过N(r)相对于r的双对数图斜率绝对值计算。

多重分形方法用于研究尺度对多重分形维数的影响，通过寻找广义维数Dq来描述不同尺度的分形性质。Dq与q的图通常呈S形且递减。我们分析q值在-10到+10之间的广义维数谱，并计算D0、D1和D2，确保满足D0 > D1 > D2的条件。所有三个广义维数均显著低于扩散限制聚集分形维数（D≈1.7）。

使用ImageJ软件的FracLac插件计算多重分形属性。在网格设计面板中定义12个不同的网格位置，以捕获不同网格方向或位置引起的变异。我们测试了9、12和15个网格位置，发现斜率（D0）和R²值保持不变，因此采用推荐的12个网格位置。使用线性缩放方法设置20个不同大小的盒子，最小10像素，最大约图像尺寸的60%。选择“greater dim”和“check pix”选项以确保使用边界框较长边作为图像维度，并仅计数包含有意义像素的盒子。广义维数谱设置为-10到10，步长为1，选择Dq与q的图。在数据处理选项中，为多重分形优化器选择“仅显示最佳样本”，为多重分形过滤器选择“无过滤器”。在图形选项中选择双对数图回归和“绘制网格”选项。

视网膜电图（ERG）

多项ERG变化已在阿尔茨海默病患者中记录。早期研究报道，视觉皮层受累可能导致基本视觉感觉功能障碍，继而参与视觉认知缺陷和与视觉相关的行为症状的发展。此外，闪光ERG已被用于证明路易体痴呆患者在明视和暗视条件下的视网膜功能障碍。全视野ERG也被建议用于研究阿尔茨海默病中是否也可能发生节前神经元功能障碍。有趣的是，ERG还被提出可能用作中枢多巴胺和血清素水平的标志物。

我们使用全视野ERG（RETevalTM，LKC Technologies公司，美国马里兰州盖瑟斯堡）根据国际临床视觉电生理学会（ISCEV）协议评估视网膜的生物电活动。RETevalTM系统是一种全视野闪烁ERG记录设备，设计为手持式、低成本的传统ERG筛查替代方案，无需散瞳。它可在约3分钟内完成双眼测量，无需任何眼部接触。通过协议选择器可选用多种基于闪烁或单闪光的协议，用于其他ERG/VEP测试。该设备的闪光源强度与ISCEV标准的明适应3.0闪烁ERG协议一致。ERG检查由一位经验丰富、经过RETevalTM设备使用培训的检查者进行。根据制造商建议，将一次性自粘皮肤接触电极阵列（Sensor Strip；LKC Technologies）放置在脸颊上，位于下眼睑外侧半部分下方约2毫米处，并将导线连接到该条带上以启动ERG记录。参与者坐直，遮盖对侧眼，要求注视设备投射的红色光束。先测试右眼，再测试左眼。皮肤接触电极条在使用后丢弃，以防止使用过的条带重复筛查其他受试者。ERG振幅和隐式时间值根据ISCEV建议进行测量。使用的协议是ISCEV 6步，先明适应。评估包括明适应ERG（刺激强度3.0 cd·s/m²，频率28.3 Hz闪烁反应）和暗适应ERG，包括视杆反应、最大暗适应反应和视锥反应。由141至424次闪光诱发的ERG的隐式时间和振幅值分别对每只眼睛进行处理。

所有比较均使用我们收集的ERG数据以及RETevalTM设备制造商提供的参考数据。具体而言，RETevalTM系统中的ERG常模基于244名年龄4-85岁、经过仔细检查视力正常的个体收集的参考数据。将眼睛分类为正常的标准是：最佳矫正视力20/25或更好，视盘凹陷<50%，无青光眼或视网膜疾病，无既往眼内手术（除非是1年以上进行的非复杂性白内障或屈光手术），眼压≤20 mmHg，无糖尿病，无糖尿病视网膜病变。

色觉量化

阿尔茨海默病是可能导致后天性色觉缺陷并最终导致色盲的慢性疾病之一。例如，有报道称，老年人的视锥对比度测试得分可能受到认知下降的影响。因此，我们测试了研究受试者的后天性色觉缺陷，考虑到视锥功能丧失可能由神经、全身、眼部疾病以及眼或脑外伤引起。使用商用平板电脑视锥对比度测试仪（CCT，Provideo CCT Plus System，Innova Systems Inc.，美国伊利诺伊州Burr Ridge）测试色觉缺陷的类型和严重程度。基于平板电脑的CCT得分范围0至100，在便携式平板显示器上测量，系统固件版本14.2.6。色觉检查在暗室中进行，从右眼到左眼，平板电脑显示器与被试者面部平面平行，置于近距（75厘米）。检查前对平板电脑液晶显示器进行校准。当双眼均符合纳入标准时，使用左眼的结果，以减少因CCT测试经验不足可能导致的错误。

平板电脑CCT系统显示的刺激由一系列随机化的彩色字母组成，背景为灰色，这些字母仅对红色、绿色或蓝色视锥细胞可见，并以递减的视锥对比度步长呈现（图5）。测试时，屏幕中央显示单个字母，观察者必须用鼠标从相邻的10个字母匹配显示屏中选择所看到的字母。然后，根据观察者的正确或错误反应，使用阶梯程序向上或向下调整颜色对比度，以确定个体能看到的最低（最不可见）的红色、绿色和蓝色视锥对比度。红色、绿色和蓝色视锥CCT得分根据正确识别的字母数量，以0-100的尺度表示。如前所述，CCT得分75或以上定义为正常。此外，CCT可用于老年患者白内障术后。

图5：视锥对比度测试（CCT）设计原理，显示长波、中波和短波CCT得分（即红色、绿色和蓝色CCT得分）。图像修改自Rabin等人（2011）。

视觉表现测试

Ceeable视野分析仪（CVFA）是一个基于云的数字平台，用于检测和诊断视网膜疾病，并作为监测视觉疾病进展的辅助工具。CVFA为可能无法获得传统视野检查服务的患者群体提供快速、准确、低成本的视觉测试。该系统基于3D计算机自动阈值Amsler网格测试。受试者一只眼遮盖，坐在带有头-颏架的触摸屏电脑前，用手指追踪视野中缺失的Amsler网格区域。通过在不同灰度级别重复测试，呈现不同对比度的Amsler网格。得到的3D数据代表测试视野范围内的测量对比敏感度，并存储在关系型MySQL数据库中。该平台包括自动化和集成的伪影去除、分析和表征系统，可分析3DCTAG视野数据，并根据视野数据变换和暗点数据变换客观识别和表征出现的视野缺损。每次测试后，自动生成并显示地形等高线图、3D中央视觉山丘图以及全面的视野和暗点特征。

认知功能评估

使用蒙特利尔认知评估（MoCA）评估认知功能，这是一种广泛使用的筛查工具，用于检测认知障碍。该简短评估是一页30分的测试，大约需要10-12分钟。由经验丰富的检查者进行测试。它侧重于几个认知领域：短期记忆、视空间能力、执行功能、语言能力、时间和地点定向力以及注意力、集中力和工作记忆。MoCA总分范围0-30，较低分数（<26分）表示认知能力较差。得分≥26分的患者通常被认为认知正常，平均得分27.4，而轻度认知障碍患者平均22.1分，阿尔茨海默病患者平均16.2分。MoCA测试的优点之一是它测量了痴呆症的一个重要组成部分（即执行功能），而这是简易精神状态检查未测量的。它也允许对视力受损者进行认知测试。

统计分析

所有统计分析使用IBM SPSS Statistics for Windows 24.0版进行。所有值均以均值和标准差表示。p值<0.05被认为具有统计学意义。使用Shapiro-Wilk正态性检验检验统计分析中使用的协变量的正态分布。Shapiro-Wilk检验对所用协变量无显著性，因此使用参数检验。使用独立样本t检验比较认知健康组和认知障碍组之间变量的均值。使用皮尔逊积矩相关法寻找血管参数与功能参数之间的关联。然后进行偏相关分析，在控制其他协变量的情况下，评估每个血管参数与功能参数之间的独特关联。

结果

在最初招募的69名参与者中，32人患有认知障碍（46%）。我们排除了患有图像质量差、年龄相关性黄斑变性、青光眼、糖尿病视网膜病变以及植入心脏起搏器受试者的数据。6名受试者有人工晶体眼，但除白内障手术外无任何眼科病史。所有糖尿病（n=9）和高血压（n=10）参与者均控制良好，无视网膜病变体征。应用所有排除标准后，最终分析共纳入20名认知障碍受试者。表1显示了这些参与者的基线特征。此外，我们发现一些无认知障碍的参与者（n=17）患有某些疾病，这些疾病可能与结果（即认知障碍）共享风险因素。另外，虽然视网膜图像质量可接受，但一名认知健康受试者的图像无法被SIVA软件读取以进行进一步分析。因此，在排除上述具有风险因素的参与者和不符合年龄匹配标准的个体后，共有19名无认知障碍的健康参与者被整合到一个数据组中，以便与认知障碍患者组进行严格比较（表1）。

表1：应用纳入/排除标准后，认知障碍和认知健康个体的基线特征。

在22项关联中，仅发现6项显著。这些参数是AVR、LDRt、D0、D1、D2和IT。皮尔逊积矩相关发现血管参数与IT之间存在显著关联（表2），但在控制其他协变量后的偏相关中这些关联不显著。偏相关分析结果见表3。

表2：视网膜血管和功能参数之间的统计学显著关联。

表3：偏相关分析后视网膜血管和功能参数之间的关联。

分形分析经过优化，以检测所检查血管结构中的细微变化。具体而言，对于认知健康（n=19）和认知障碍（n=20）个体的两组图像，使用骨架提取了不同q值（-10 < q < 10）的广义维数Dq。图6显示了广义维数谱Dq与自变量q的关系。正如预期，视网膜血管树显示出多重分形性质，通过下降的S形曲线揭示，随着尺度变化，分形维数呈现不同特征。此外，我们观察到认知健康受试者的标准差较低（即波动较小），相比之下认知障碍个体波动较大（图7）。两组计算出的广义维数D0、D1和D2的均值和标准差见表4。我们的结果还表明，整体分形维数低于DLA（Dq=2 ~1.71）。两组对应的广义维数显示出统计学显著差异（表4）。

图6：认知健康个体（n=19，蓝色轨迹）和认知障碍个体（n=20，红色轨迹）的广义维数谱Dq与q的关系。

图7：在轻度认知障碍个体中观察到的视网膜地形特征。（顶行）一名79岁女性轻度认知障碍受试者的中央和鼻侧红外光图像，显示黄斑外特征，如象限上方的周边不规则形状亮斑状玻璃膜疣样区域，以及双眼的色素分散。（左下）一名81岁女性轻度认知障碍受试者的中央和鼻侧红外光图像，显示迂曲血管、黄斑外特征如玻璃膜疣样区域以及左眼色素分散。（右）一名健康对照者（71岁）的鼻侧红外光图像。所有图像均使用EasyScan设备（i-Optics公司，荷兰）获取。EasyScan相机是双色共焦SLO：红外（785 nm）和纯绿（532 nm）。不同颜色与不同穿透深度有关。红色箭头指示玻璃膜疣和黄斑外位置观察到的白点位置。橙色矩形包围的ROI指示观察到色素分散的位置。绿光图像（见图1眼底图像）在视网膜神经纤维层反射，显示直到第4分叉的血管结构。红外光图像到达脉络膜血管层。

表4：认知障碍患者与认知正常个体相比得到的几何血管参数。

我们发现，与年龄匹配的对照组相比，认知障碍患者视网膜血管分支模式的分形维数显著降低（见表4）。正如预期，认知障碍组的MoCA得分显著低于年龄匹配的对照组（p < 0.001）。尽管认知障碍个体显示出较高的长径比趋势，但这种差异无统计学意义。我们观察到，认知障碍患者的不对称因子显著高于年龄匹配的对照组（见表4）。此外，在部分轻度认知障碍老年受试者中注意到周边玻璃膜疣样区域和视网膜色素分散（见图7）。几何血管参数和功能测量与MoCA得分无显著相关性。对于所有全视野ERG测量，认知障碍受试者观察到较小的振幅和较大的峰值时间（见表5）。此外，认知健康组和认知恶化组之间的振幅和隐式时间存在统计学显著差异。隐式时间的变异性小于振幅。此外，随着视网膜病理变化的出现，隐式时间的增加在所有认知恶化患者中高度一致，并且对照组数据和病理值之间几乎没有重叠：对照数据的变异范围在29.4至29.8 ms之间，而认知障碍患者在29.6至32.8 ms之间。

表5：从认知障碍患者记录的明适应3.0闪烁ERG（28.3 Hz）测量值与RETeval系统的常模数据比较。

使用三维计算机自动化阈值Amsler网格测试（Ceeable Inc.）进行的视觉表现测试表明，该方法对于大多数认知障碍老年受试者来说，在观察者对网格阈值的判断上存在变异性。因此，由于这些个体普遍无法遵循详细的任务说明，变异性可能加剧，因此未将Ceeable平台获得的视觉表现结果用于整体分析。使用计算机化视锥对比度测试（CCT，Innova Systems Inc.）进行的视觉表现测试显示出颜色视觉的功能丧失（见表6）。绿色缺陷的患者多于红色或蓝色缺陷。两组对应的得分显示出统计学显著差异。

表6：认知障碍组的长波、中波和短波CCT得分（即红色、绿色和蓝色CCT得分）。

讨论

在本研究中，比较了表征视网膜结构和功能的多模式参数，以评估认知障碍患者视网膜功能方面的视网膜血管改变。该研究旨在获得多种视网膜测量指标，如视网膜的结构和功能指标。这种特殊设计提供了机会，发现和研究各种信息之间的关系，例如视网膜微血管（动脉和静脉）的口径、迂曲度和网络复杂性，与功能特征（如对比敏感度、通过ERG测量的电反应）之间的关系，同时结合分形-血管和神经分析。

视网膜血管变细是认知障碍患者公认的指标。然而，尚未研究其与通过低成本全视野ERG技术测量的视网膜功能的关系。在认知下降患者中，30 Hz闪烁ERG b波隐式时间与AVR、D0、D1、D2和LDRt之间存在显著相关性，这一发现很有趣，需要进一步研究以阐明潜在的病理生理学，并验证其作为眼睛替代标志物预测认知下降发展的临床效用。当使用闪烁ERG方法评估感光细胞功能时，振幅降低和30 Hz闪烁ERG b波隐式时间增加通常在所有涉及感光细胞的视网膜病理中观察到。此外，先前研究表明，随着年龄增长，光色素光密度仅有适度下降。因此，ERG参数与血管测量之间的显著相关性可能更与认知下降相关，而非衰老。

血管参数与30 Hz闪烁ERG隐式时间之间缺乏显著的“独特”关联，可能由于我们数据样本量较小，因为在皮尔逊相关中看到了显著趋势，这些趋势在较大样本量的偏相关中可能仍然显著。其次，血管参数在生理上是相关的——例如，血管分支、动静脉比和血管口径可能与分支网络的分形维数相关。因此，如偏相关分析所示，在这些参数与功能参数之间寻找独特关联在统计上可能是稳健的，但在实践中，可能不遵循视网膜的生理连接方式。然而，如皮尔逊积矩相关所示（表2），多个血管参数与功能参数之间的关联可能描述了视网膜的生理连接方式。尽管如此，我们提供了两种相关性（表2、3），以显示统计学显著趋势以及该趋势在偏相关中的变化。

据报道，CCT得分在老年人中因认知下降而受到影响。在我们的研究中，不仅大多数认知下降患者被发现绿色缺陷多于红色或蓝色缺陷，而且所有CCT得分都严重低于与衰老相关的正常下降水平，以及报道的八九十岁老年人的水平。尽管白内障形成可能影响八九十岁有晶状体眼患者的CCT得分，但我们研究中的6名人工晶体眼患者均报告进行了顺利的白内障手术并植入了后房型人工晶体。因此，我们相信这些有人工晶体的患者具有清晰的光学介质，不会显著影响我们的CCT结果。有趣的是，有报道称，因阿尔茨海默病导致认知恶化的个体在Stroop测试中难以区分绿色和蓝色刺激，该测试依赖于需要完整色觉的认知测量。这些结果进一步证明，纹状体外病变可能导致蓝色盲型颜色缺陷，并且阿尔茨海默病中纹状体外皮层受到严重的神经病理学干扰。因此，认知下降导致的病理变化发生在接受来自外侧膝状体颜色信息的纹状区，这为大脑中颜色视觉缺陷提供了额外的依据。

与先前研究一致，我们发现认知下降患者血管分支复杂性降低。然而，与这些研究相比，我们的研究使用了更稳健的方法，考虑了视网膜微血管网络的实际多重分形特性。值得注意的是，由于年龄相关性黄斑变性和阿尔茨海默病导致的认知恶化的共同发现表明存在一定程度的重叠，我们评估了所有视网膜图像以识别和排除与年龄相关性黄斑变性相关的视网膜病理特征。有趣的是趣的是，在我们的认知障碍患者中，我们观察到一些轻度认知障碍个体在视网膜上象限存在黄斑外玻璃膜疣。这一趋势此前已有报道，认为与有周边玻璃膜疣的阿尔茨海默病患者的认知恶化显著相关。两项早期研究可能为此提供了证据，描述了视网膜玻璃膜疣沉积物中存在β-淀粉样蛋白。此外，在阿尔茨海默病患者的上象限周边区域已检测到丰富的β-淀粉样蛋白病理。

在阿尔茨海默病导致的认知恶化患者中也记录到了多项ERG变化。早期研究报道，视觉皮层受累可能是导致基本视觉感觉功能障碍的原因，这可能导致视觉认知缺陷和与视觉相关的行为症状。全视野ERG已被用于研究阿尔茨海默病导致的认知恶化中是否也可能发生节前神经元功能障碍。节前神经元可能的功能障碍可以解释阿尔茨海默病患者中观察到的P50隐式时间增加，而青光眼或多发性硬化症中获得的数据支持这一点，其中P50隐式时间的延迟可归因于神经节细胞和节前神经元的功能障碍。此外，闪光ERG已被用于证明路易体痴呆患者在明视和暗视条件下的视网膜功能障碍。该研究指出，视网膜功能障碍可能与尸检时发现的外丛状层中感光细胞的轻微改变和大量苍白包涵体有关，提示特异性视网膜病变。在我们的研究中，我们还发现a波振幅显著降低，表明在暗视条件下与视杆细胞反应延长相关的异常感光细胞功能。视网膜血管变细与暗视全视野改变严重程度之间的关联此前已在视锥细胞变性患者中报道过，例如色素性视网膜炎，在这些患者中，氧化应激被认为可能起着与阿尔茨海默病类似的致病作用。此外，一项近期研究报告称，向C57/BL6小鼠视网膜下注射β-淀粉样蛋白会导致暗视反应下降。有趣的是，与我们的研究一样，红外SLO图像揭示了由不规则形状的明亮区域描绘的玻璃膜疣样区域。此外，携带ApoE-ε4等位基因的小鼠中，混合视杆-视锥反应显著下降，该等位基因是迟发性阿尔茨海默病最常见的遗传风险因素，与Aβ协同作用。因此，这些近期动物模型研究以及我们的初步结果表明，使用ERG评估视网膜生物电活动可能为早期认知障碍的视网膜生物标志物探索增加重要价值。此外，认知健康组和认知障碍组平均值的90%置信区间不重叠这一事实，支持了为隐式时间值定义独特域的机会，这些域可以与所分析个体中认知障碍的存在与否相关联。

对相关文献的彻底检索未发现任何报道使用所需仪器成本低于45,000美元的多模式方法研究认知障碍中视网膜血管和功能异常的文章。本研究的主要优势在于实施的低成本多模式方法，用于测量组合的结构-功能参数，而非单个标志物。我们方法的便携性和低成本将有助于在社区环境中进一步扩展数据收集，用于人群健康管理。另一个优势是进行了多重分形分析，而大多数研究依赖于单分形分析，这种方法取得的成功有限。

本研究存在一些重要局限性。由于眼介质混浊导致图像质量差而排除眼睛，以及混杂因素的存在，限制了样本量。此外，我们在获取高质量的结构和功能数据方面遇到了一些挑战，尤其是在容易疲劳的认知障碍老年患者中。如果研究受试者视力较差，这些挑战可能更加复杂。此外，由于样本量小，我们没有检查SIVA平台中大量参数与功能参数之间的关系。除了视网膜血管分支模式的复杂性、AVR、不对称比、LDR、分支系数、迂曲度和血管口径外，其他几何血管参数（例如，其他分叉参数、分支系数角等）也可能与认知下降导致的视网膜生理变化有关，并且功能参数对这些变化敏感。另一个局限性可能是研究患者的认知功能仅通过MoCA测试评估。因此，无法进行认知障碍的鉴别诊断，需要包括病理检查和脑神经影像学在内的认知功能详细评估，以确认阿尔茨海默病导致的认知恶化。然而，尽管阿尔茨海默病是老年人中最常见、进行性的痴呆症原因，但我们的研究独立于其认知障碍的病因招募受试者，这有助于我们评估在社区环境中收集数据用于人群健康管理。有报道称，在有认知能力的正常老年人中，一生中可以识别出淀粉样蛋白沉积，并且无症状淀粉样蛋白沉积的患病率可能与有症状淀粉样蛋白沉积相似。一项早期研究表明，在一组无临床显著损害的参与者中，淀粉样蛋白沉积与较差的认知功能无关，这表明有显著淀粉样蛋白负荷的老年人可以保持认知正常。Pagani等人（2016）也表明，认知障碍与阿尔茨海默病严重程度之间没有确定性关系。尽管如此，需要对研究受试者进行纵向随访，以支持淀粉样蛋白成像在识别临床前阿尔茨海默病方面的潜力，或者证明在某个特定时期内淀粉样蛋白沉积不足以引起阿尔茨海默病。因此，我们使用不可知认知障碍评估的多变量和多模式方法，可以成为在社区环境中扩展方法学以评估处于认知恶化风险下个体的眼-脑状况的起点。

尽管在偏相关分析后，功能与血管参数之间的显著相关性不复存在，但这并不意味着本研究中发现的统计趋势不反映神经-血管成分的整体改变和疾病。此外，我们研究的横断面设置无法促进对认知障碍与视网膜功能和结构特征之间时间及因果关系的调查。然而，由于我们研究中使用的严格排除标准，我们只分析了质量非常好的数据，这使得我们的结果更加稳健。尽管存在上述局限性，但视网膜血管变细和血管分支网络复杂性降低与早期研究观察到的结果相当。我们继续在此研究下收集数据，并期望在更大样本量下进一步探索多重关系和统计趋势。

结论

在早期阶段检测认知障碍的困难给认知下降诊断的开始带来了限制。不幸的是，一旦早期认知障碍或痴呆症在临床上变得明显，就没有成功的治疗方法。这项研究表明，存在可能对认知障碍下降敏感的多模式视网膜标记物，并进一步证明存在统计趋势，表明视网膜神经元功能障碍与微血管变化之间存在相关性。这一趋势表明，视网膜几何血管和功能参数可能与认知下降导致的视网膜生理变化有关。我们怀疑，对组合结构-功能参数的分析，而不是单个生物标志物，可能作为认知下降的有用临床标志物，也可能为认知障碍的鉴别诊断提供更高的敏感性和特异性。然而，由于我们的研究样本量较小，我们方法临床适用性的全部范围仍具有挑战性，有待确定。本研究还支持使用基于视网膜结构-功能关系的认知障碍多模式诊断生物标志物方法，该方法还具有在社区环境中低成本实施以检测认知下降特异性视网膜病理的优势，这可以实现早期诊断和疾病进展监测。如果能确认眼睛和大脑测量之间的临床相关性，对被认为有认知障碍风险的人进行眼睛筛查，可能有助于开发一种低成本的早期诊断替代方法，并可能用于监测新兴疗法的有效性。

声明

作者贡献

DCD构思并设计了研究。DCD、GS、EA、MK、SO和CMS进行了研究。DCD、GS、EA和SO分析了数据。DCD和GS贡献了试剂、材料和分析工具。DCD、GS和EA参与了手稿的撰写。

资金

本研究部分得到Finker Frenkel Legacy Foundation、NIH中心基金（P30-EY014801）对迈阿密大学的资助、Research to Prevent Blindness, Inc.对迈阿密大学的无限制资助以及阿尔茨海默病协会（AARGD-17-531255，DCD）的支持。