药物发现中的新兴筛选技术Emerging Screening Technologies in Drug Discovery | Technology Networks

筛选平台的快速演进正在改变实验室专业人员识别和验证治疗候选物的方式。实施这些先进系统可以加速药物研发管线，同时提高临床前模型的预测有效性。这直接影响科学成果和行业标准。随着对新型治疗药物需求的增加，实验室正从传统的二维检测方法转向高度多重化、生理相关的平台。现代工作流程现在整合了自动化系统、复杂的细胞模型和精确的基因工具。这些进步解决了药物开发中的历史淘汰率问题。通过采用这些方法，实验室人员能够获得更高质量的数据，确保最有前景的候选药物进入临床评估阶段。

高通量和微流控筛选平台

现代药物研究的基础在很大程度上依赖于快速评估大量化合物库和生物制剂的能力。高通量筛选(HTS)一直是这一过程的基石。它使实验室能够使用自动液体处理和机器人板操作来测试数百万个样品。然而，新兴的筛选方法现在需要比传统多孔板格式更高的效率、更低的试剂消耗和更高的数据保真度。

微流控技术代表了高通量方法学的重大进步。通过在亚毫米尺度上操控流体，微流控设备使实验室专业人员能够在微观液滴或连续流通道内进行复杂的生化和细胞检测。这种微型化显著减少了稳健筛选方案所需的昂贵试剂和稀有原代细胞样本的体积。

基于液滴的微流控技术特别将单个细胞和个体化合物封装在皮升级水性液滴中，这些液滴被惰性载油分隔。每个液滴作为一个独立的微反应器。这种方法支持超高通量处理，使筛选速率超过每秒数千个事件。确切速度取决于特定的光学检测平台和检测复杂性。这种速度对当代药物发现工作流程非常有利，特别是在处理大规模化合物库或评估异质细胞群时。

此外，管理这些系统生成的海量数据需要先进的实验室信息学。现代筛选设施通常将实验室信息管理系统(LIMS)直接与微流控控制器集成，以确保无缝的样本追踪和数据溯源。

向微型化格式的过渡从根本上改变了检测参数。下表突显了传统HTS框架与现代微流控实施之间的关键操作差异。

表1. 传统HTS和微流控平台的操作比较

将微流控技术整合到实验室工作流程中需要在流体动力学、声波分配和先进光学检测系统方面的专门培训。光电倍增管(PMT)或高速相机等检测器捕获来自快速移动液滴的荧光或发光数据，需要强大的数据采集基础设施。随着这些分析平台的成熟，它们无缝地与质谱和流式细胞术接口，为实验室人员提供多维分析能力。

3D细胞培养和类器官筛选方法

对二维(2D)细胞单层的历史依赖导致了较高的临床失败率。扁平培养物通常无法充分复制人体组织的复杂空间结构和生物微环境。为解决这些局限性，实验室专业人员越来越多地采用3D细胞培养系统，这些系统在化合物功效和毒性方面提供了改进的预测有效性。

实施3D细胞培养涉及各种方法，从无支架技术(如悬挂液滴板和超低附着容器)到使用合成水凝胶或天然细胞外基质(ECM)的支架技术。这些系统使细胞能够形成球状体。这促进了影响基因表达、代谢谱和药物渗透动力学的关键细胞间和细胞-基质相互作用。

类器官筛选进一步提升了3D模型的复杂性。类器官是由干细胞(成体干细胞或诱导多能干细胞)衍生的自组织三维组织结构。它们紧密模仿特定器官的功能和结构特征。将类器官整合到这些工作流程中为体外筛选提供了高度的生理相关性。

尽管有优势，但保持检测可重复性仍然是处理复杂3D模型的实验室科学家的核心关注点。标准化多块板之间类器官的大小、形态和成熟率至关重要。这种一致性减少了孔间变异性，并确保统计上稳健的命中识别。

实施3D和类器官筛选技术的关键实验室考虑因素包括：

• 基质选择和优化：实验室仔细选择ECM成分，以支持目标类器官的特定谱系和结构完整性，在基质硬度与生物信号传导能力之间取得平衡。
• 高内涵筛选(HCS)整合：分析3D结构需要配备共焦功能的先进自动显微镜。需要复杂的Z堆叠算法来捕获深层组织荧光，同时最小化光毒性。
• 数据分析和解卷积：从复杂的3D结构中提取表型数据需要高级算法。这些算法必须能够量化体积、密度、形态变化和空间生物标志物分布。
• 工作流程自动化：处理脆弱的类器官涉及专门的自动液体处理器。使用宽孔移液管尖端可最大限度地减少剪切力，并在板转移期间保持结构活力。

向3D细胞培养和类器官筛选的转变反映了由监管变化支持的范式转变。《FDA现代化法案2.0》允许在科学适当的情况下使用基于细胞的检测和复杂的体外模型作为动物测试的替代方案。这将这些药物发现筛选方法推向了临床前实验室科学的前沿。

CRISPR和基因组技术用于靶点验证

识别和验证精确的治疗靶点是药物开发的关键阶段。基因组筛选方法在基础研究(如Shalem等人(2014)的研究)之后已显著扩展。这种精确的基因编辑工具使实验室科学家能够系统地探查基因组，阐明基因-疾病关联和化合物作用机制。

CRISPR筛选技术通过将向导RNA(gRNA)文库引入目标细胞群来发挥作用。这些文库将Cas核酸酶引导至特定基因组位点，创建靶向修饰。实验室使用三种主要的CRISPR筛选模式：

1. CRISPR敲除(CRISPRko)：利用活性Cas9核酸酶产生双链断裂，导致功能丧失突变。这对于识别肿瘤学筛选中的必需生存基因或阐明合成致死通路非常有用。
2. CRISPR干扰(CRISPRi)：使用催化失活的Cas9(dCas9)与转录抑制子(如KRAB)融合，暂时抑制基因表达而不永久改变DNA序列，使实验室能够研究剂量依赖性药物反应。
3. CRISPR激活(CRISPRa)：将dCas9与转录激活子(如VPR)结合以过表达特定基因。这有助于识别耐药机制或补偿性生物网络。

成功执行全基因组CRISPR筛选需要严格的实验室执行。工作流程通常从定制合成或采购质粒文库开始，然后进行慢病毒包装以促进高效的细胞转导。实验室人员严格控制感染复数(MOI)。这增加了每个细胞平均只接收一种基因扰动的可能性。

此外，减轻脱靶效应是一个主要关注点。现代筛选工作流程整合了先进的生物信息学工具来设计高度特异性的gRNA。它们还采用严格的测序验证，以确认观察到的表型是预期靶向修饰的直接结果。

在施加选择性压力(如候选药物化合物)后，对存活的细胞群进行基因组DNA提取。然后使用下一代测序(NGS)来量化特定gRNA的代表性。生物信息学分析有助于揭示哪些基因修饰赋予了对治疗剂的敏感性或耐药性。通过将CRISPR筛选平台与发现管线合并，研究人员能够以更高的置信度验证靶点。这种准确性降低了由于缺乏疗效而导致晚期临床淘汰的可能性。

抗体发现和体内筛选用于罕见疾病靶点

虽然小分子治疗药物继续构成药物领域的很大一部分，但生物制品——特别是单克隆抗体——构成了一个快速扩展的领域。此外，行业面临着越来越多解决罕见疾病靶点的需求，这些靶点通常缺乏已建立的病理模型，并需要高度专业化的筛选方法学。

抗体发现依赖于能够探查庞大免疫库的复杂筛选技术。传统杂交瘤技术正逐渐被体外展示技术(如噬菌体展示和酵母展示)所增强或取代。这些平台使实验室科学家能够针对纯化的靶抗原筛选数十亿种抗体变体。

最近，单B细胞筛选技术推进了抗体发现管线。利用光流体平台或自动细胞分选机器人，实验室人员直接从人类供体或免疫动物中分离单个B细胞。这些先进的筛选方法促进了天然配对抗体重链和轻链的快速克隆和测序。这保留了天然免疫库，并产生了具有强大亲和力和可开发性特征的药物候选物。

解决罕见疾病靶点通常需要从体外系统过渡到体内筛选技术。虽然体外模型提供了高通量，但它们通常无法完全复制复杂的系统相互作用、生物分布和整个生物体毒性。

体内筛选越来越多地利用复杂的动物模型：

• 斑马鱼(Danio rerio)模型：斑马鱼与人类具有相当大的遗传同源性。大约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼直系同源物，对于与人类疾病相关的基因，这一比例上升到84%。它们在幼虫阶段的光学透明性使实验室能够利用荧光报告基因实时追踪药物分布和表型反应。这在体外多孔板检测和哺乳动物模型之间提供了有效的桥梁。
• 人源化小鼠模型：对于罕见遗传疾病和免疫肿瘤学应用，实验室设计小鼠模型以表达人类疾病等位基因或携带人类免疫系统。这些定制的体内筛选模型提供了验证针对高度特异性、罕见疾病靶点的治疗干预所必需的关键转化数据，然后才开始人体临床试验。

空间转录组学和先进体内成像的整合进一步增强了这些方法。实验室专业人员绘制药物候选物对完整生物体内不同组织的分子影响。这有助于验证治疗是否达到其预期的罕见疾病靶点，而不会引起显著的脱靶病理。

最大化新兴筛选技术的成果

筛选平台的持续完善深刻影响着现代药物科学的轨迹。对实验室专业人员而言，适应这些进步需要多学科方法，融合细胞生物学、流体动力学、基因工程和生物信息学数据管理。

从传统检测向复杂、生理相关平台的转变大大提高了临床前数据的转化准确性。3D细胞培养、类器官模型和微流控等例子。同时，整合CRISPR和先进的抗体发现平台确保研究人员拥有识别和验证难以捉摸的治疗靶点(包括与罕见遗传疾病相关的靶点)所需的精确工具。随着体内模型变得越来越复杂，整个发现管线可以从假阳性进展的减少中受益。

最终，这些筛选平台的成功实施取决于实验室人员的专业知识。通过保持严格的质量控制、优化自动化工作流程并采用下一代分析方法，实验室可以继续加速安全、高效治疗药物向临床环境的交付。

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