该程序的目标是通过纳米粒子追踪分析(NTA)仪器，使用半自动方法分析外泌体的尺寸并对其进行定量。这是通过使用差速离心步骤从人血液中获得外泌体沉淀物来实现的。外泌体被重悬于一个针对起始血浆量预设的浓度，以获得适当的散射强度。
在NTA过程中，然后将悬浮液过滤以分离外泌体与较大颗粒。接下来，使用含有200纳米大小聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液对NTA仪器进行校准。然后将外泌体溶液注入NTA仪器，并通过在最终测试前执行预测试来选择NTA的理想设置。
最终，可以获得显示所有测量粒子定量结果并按尺寸列出粒子的结果。该方法的演示至关重要，因为每种制备的外泌体溶液的溶液和设置必须单独执行，以获得最佳结果。测量的外泌体应处于适当浓度，以便实时视图模式每屏幕显示约600个粒子。
此外，应执行预测试以找到测量的最佳灵敏度范围。高灵敏度设置会导致显示更多小粒子，但也会增加与背景噪声相关的问题。该程序将由我们实验室的研究生Anto May演示。
开始外泌体制备，通过静脉穿刺收集三管柠檬酸盐管中的全血，总计九毫升。
然后将血液倒入15毫升Falcon管中，在4摄氏度下以1,500 G离心20分钟，以启动细胞与血浆的分离。将上清液转移到新的15毫升Falcon管中。然后在4摄氏度下以2,800 G再次离心20分钟，以从血浆中去除所有细胞。
将无细胞血浆(CFP)以每管1毫升转移到超速离心管中。接下来在4摄氏度下以100,000 G离心90分钟以分离外泌体。移除900微升上清液，并将沉淀物在超速离心管中剩余的100微升中重悬。
加入900微升PBS后，在4摄氏度下以100,000 G离心30分钟。如前所述，移除900微升上清液，并用剩余的100微升重悬沉淀物。将5至20微升的重悬液转移到40毫升蒸馏水中。
通过450纳米过滤器过滤悬浮液，以分离外泌体与较大颗粒。使用此最终悬浮液进行粒子测量，以使用粒子追踪仪器。
首先，通过双击软件图标启动程序。
在协议过程中，单击各种软件选项卡以在它们之间切换。遵循屏幕上的说明。要自动实施启动程序，请选中细胞质量检查和自动对齐两个框。
如有必要，可以通过按细胞检查选项卡上的按钮A或B分别重复这些步骤中的任何一个。在出口端口下方放置一个烧杯以收集废液，并且不要将气泡注入系统。打开纳米粒子追踪分析(NTA)仪器的入口和出口端口，并通过注射器将10毫升蒸馏水通过入口端口注入细胞通道。
在最后一点水被注入时立即关闭入口和出口端口。确保测量细胞无气泡。通过单击"确定"执行细胞质量检查。
几秒钟后，软件将显示细胞质量结果，如果软件的实时视图屏幕上仍可视化任何粒子，或者如果质量检查结果仅为良好或较差，则重复蒸馏水注入，直到从测量细胞中去除剩余粒子。此外，在每次测量后重复此步骤，以避免粒子积累。
接下来，准备含有均匀的200纳米大小聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液。为了对齐激光和显微镜的焦点，将仪器制造商提供的悬浮液浓缩液一滴加入500毫升蒸馏水中，从而得到所需浓度，使实时视图中每屏幕显示600±100个粒子。
将对齐悬浮液注入NTA仪器，如同对蒸馏水所做的那样。单击"确定"开始对齐，这是一个自动化例程，系统将自动找到两个焦点的最佳位置。当出现提示表明系统现在准备好进行实验时，单击"确定"开始测量。
偶尔在实验之间手动清洁细胞通道，通过用30%乙醇溶液冲洗细胞。每当软件显示自动错误报告时，请清洁通道。
要执行系统测量，首先在每次样品测量前用蒸馏水冲洗通道。然后将外泌体悬浮液注入通道。下一步是在软件中调整主要参数以调整灵敏度。
通过单击"粒子数与灵敏度"来显示不同灵敏度水平下每屏幕测量粒子的曲线，以找到最佳灵敏度范围。选择曲线最大斜率之前的灵敏度水平。较高的灵敏度水平允许显示更多小粒子，但也增加了与背景噪声相关的问题。
要调整最小亮度，为外泌体测量选择20的起始亮度。要将此功能用作过滤器，请调节此参数以消除强光散射粒子。向下调节以放大弱散射伪影，根据实验需要调整亮度。
接下来，设置数字过滤器以消除像素噪声和不需要的散射过大粒子。通过调节最小和最大尺寸，为外泌体测量使用10到500像素的范围。通过设置快门为300（等于3.3毫秒）来调整快门，改变相机打开的时间段。
要调整实时读出参数，可通过单击实时图像按钮随时在数字和模拟视图模式之间切换。在整个实验过程中，监视散射强度条，该条以颜色编码指示器显示样品的饱和状态。
如果散射条为红色，则不要分析外泌体。
要开始测量，请单击测量选项卡。在运行选项数组中选择设置。
在每次采集前，选择检查运动，重复检查粒子漂移测试，选择实验次数和它们之间的时间延迟。如有必要，执行样品检查。最后，单击运行视频采集按钮。
在新窗口中，定义循环次数和测量位置数量。确认粒子被追踪为单个粒子的最短时间持续时间。
通过设置视频分辨率，较低的分辨率会导致较短的追踪持续时间。最后，选择文件名并单击"确定"开始测量。
粒子数与灵敏度曲线显示一个位置在某一时刻的粒子。在自动灵敏度扫描过程中，选择图形最大斜率之前的灵敏度值。在此测试实验中，伪影未被消除，可能会影响图形。实时视图屏幕上粒子的可视化有助于设置正确的灵敏度值。
过低的值会导致检测到很少的粒子。而过高的值会显示较差的图像，质量粒子在最佳灵敏度水平下表现为彼此隔离的单个点。
测量后的结果选项卡允许读取参数，包括追踪的粒子总数、每个位置的平均粒子数和粒子浓度，以及粒子尺寸与粒子数量百分比的数值比。
测量后计算的图形显示了粒子的尺寸分布。显示模式中的图标可用于更改图形的设置。此外，还有不同的方法来分析外泌体。
此方法展示了一种非常简单而优雅的方法，以快速过程执行类似的分析方法，在短时间内生成结果。为了比较多个样品，我们建议对所有样品保持相同的稀释水平。除灵敏度和视频分辨率外，所有设置都可以通过使用分析软件在之后更改。
这样，以外泌体数量和尺寸对不同实验中获得的数据进行比较分析变得可用，以半自动方式进行。
本文介绍了一种从全血中分离外泌体并使用半自动仪器通过纳米粒子追踪进行进一步分析的方法。该技术提供了一种极其敏感的方法，用于在液体悬浮液中可视化和分析粒子。
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