ABCC6致病性变异与日本严重脑小血管疾病患者的出血表型相关
摘要
ABCC6致病性变异影响多个器官的缺血性和出血性病变，是日本遗传性脑小血管疾病(CSVD)的第三大常见病因，但其CSVD表型仍不明确。我们对158名连续就诊的日本严重CSVD成年患者进行了多中心横断面研究。进行了基因分析，并比较了ABCC6相关CSVD、常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病(CADASIL)以及基因未确定CSVD患者的临床和脑部MRI结果。通过单变量和多变量分析评估了ABCC6致病性变异与出血性卒中的关联，同时调整了年龄和高血压因素。9名患者(5.7%)携带致病性杂合ABCC6变异。与CADASIL相比(55.6% vs 13.6%，P = 0.039)，ABCC6相关CSVD的出血性卒中发生率更高；与基因未确定CSVD相比(55.6% vs 10.3%，P = 0.010)也是如此。多变量分析证实了独立关联(比值比8.4，95%置信区间2.0-38.4，P = 0.004)。在MRI上，与CADASIL相比，ABCC6相关CSVD显示前颞叶病变较少但微出血更多。当包括双等位基因病例时，这些发现的方向保持一致。这些发现表明，ABCC6在日本患者中与一种独特的、以出血为主的CSVD表型相关，支持ABCC6的贡献作用，并需要在更大规模、多族裔队列中进行验证。
引言
脑小血管疾病(CSVD)是腔隙性梗死、脑内出血和痴呆的主要原因。虽然大多数病例为散发性，但已发现几种单基因形式，其中常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病(CADASIL)最为普遍。尽管CADASIL已得到详细描述，提高了诊断准确性，但其他遗传性CSVD的临床谱系仍未得到充分界定。明确每种遗传性CSVD的表型不仅对准确诊断至关重要，也对个性化管理、预后评估、机制洞察和未来治疗开发具有重要意义。ABCC6相关CSVD就是这样一个特征尚不明确的实体。
ABCC6功能缺失是假性黄瘤弹性(PXE)的主要基因，会导致弹性纤维钙化和断裂，从而引起血管脆弱。PXE是一种由ABCC6致病性双等位基因变异引起的常染色体隐性遗传病；杂合子携带者通常不被认为患有PXE，尽管已有亚临床或部分表型的报道。最近，ABCC6也与CSVD相关：在日本严重CSVD队列中，5.7%的患者携带ABCC6致病性变异，是第三大常见遗传病因；在韩国年轻卒中队列中，5.1%的患者携带致病性变异，表明其与亚洲人群脑血管疾病的相关性。然而，ABCC6导致的CSVD表型仍不明确，且足够大规模的比较研究稀缺。ABCC6致病性变异还被报道与缺血性冠状动脉疾病和胃肠道出血表现相关，这引发了ABCC6相关CSVD可能在CSVD中表现出独特表型的可能性。
因此，我们将ABCC6相关CSVD的临床特征与CADASIL和基因未确定CSVD进行了比较。关于影像学特征，我们与CADASIL进行了详细比较，因为CADASIL的影像学标准已得到充分确立。为了直接解决携带者效应，我们预先指定了仅针对致病性ABCC6变异的杂合子主要分析，并将不同纯合度的致病性分析作为敏感性分析。
方法
伦理批准
本研究获得新潟大学伦理委员会的中央伦理批准(批准号801、802和G2020-0032)，所有参与中心均正式依赖此批准。每个参与机构都签署了正式协议，同意依赖中央IRB。从所有参与者或其法定授权代表/家属处获得书面知情同意，包括发表同意。所有数据均经过匿名化处理以保护参与者隐私。本研究按照《赫尔辛基宣言》进行，所有方法均按照相关指南和规定执行。
研究设计与参与者
我们于2010年10月至2022年2月在日本各地开展了一项横断面研究。当临床怀疑遗传性CSVD时，患者被连续转诊至我院进行基因检测。转诊标准在全国中心标准化，包括脑磁共振成像(MRI)上对称性白质高信号(Fazekas分级≥2/II)以及至少一种其他CSVD相关发现(如腔隙性梗死、扩大的血管周围间隙、外囊病变或微出血)，以及中风、认知障碍或步态障碍等神经系统症状。神经系统症状或体征的发病年龄在20至60岁之间(认知障碍定义为蒙特利尔认知评估量表(日文版)得分≤25分)。所有符合这些预定义标准的转诊患者均被纳入研究，转诊后无病例被排除。
基因分析
基因检测遵循先前报道的方案。从血样中提取基因组DNA。最初，对NOTCH3和HTRA1进行常规基因检测，以确定CADASIL和HTRA1相关CSVD病例。携带半胱氨酸改变型NOTCH3或NOTCH3 p.R75P变异的患者被诊断为CADASIL。通过外包服务(Macrogen，韩国)，对剩余患者进行全外显子组测序，以调查CSVD致病基因。使用R(4.1.0版)中的Copy Number estimation by a Mixture Of Poissons (cn.MOPS)软件包分析拷贝数变异，并通过液滴数字聚合酶链反应确认。
变异分类
每个变异的等位基因频率参考了两个公共数据集：基因组聚合数据库(gnomAD v4.1.0)，包含约80.7万名不同祖先的个体；以及日本多组学参考面板(14KJPN)，包含1.4万名健康日本人的全基因组测序数据(2.8万个等位基因)。
为评估变异致病性，我们使用了多种资源：ClinVar数据库用于已知临床意义，VaProS网站上的体外分析工具(PolyPhen2、SIFT和Provean)预测功能损伤，联合注释依赖性损耗的PHRED评分估计有害性，以及先前文献。根据美国医学遗传学与基因组学学院(ACMG)标准对变异进行分类，确保一致可靠的遗传变异解释。仅包括根据ACMG分类为致病性的ABCC6变异；这包括PXE报告的变异和符合ACMG标准的新型功能丧失变异(如具有适当支持证据的致病性非常强(PVS)1)。意义未明的错义变异被排除在主要分析之外，但包括在杂合子敏感性分析中，因为这些变异虽然在PXE中因证据不足未被分类为致病性，但仍可能具有未被识别的致病潜力。无论纯合度如何，均识别携带ABCC6变异的参与者；主要分析仅限于杂合致病性携带者。
临床和影像学分析
在三组之间比较临床发现：ABCC6相关CSVD、CADASIL和基因未确定病例。使用标准化调查表收集临床数据，包括血管危险因素、神经系统体征和症状以及残疾程度，以确保一致性。家族史定义为一级或二级亲属中记录的痴呆、中风或白质脑病发作。残疾程度使用改良Rankin量表和Barthel指数进行评估。
对于影像学分析，将ABCC6相关CSVD与CADASIL进行比较，并参照已确立的CADASIL影像学表型。我们未将基因未确定组指定为主要影像学比较对象，因为已知致病性变异的缺失并不排除未检测到或尚未识别的遗传病因，使该组异质性较高，不适合作为主要影像学比较对象。所有中心均使用3.0特斯拉扫描仪获取脑部MRI扫描。T2加权图像主要用于微出血评估；当T2图像不可用时(ABCC6相关CSVD组n=1，CADASIL组n=2)，使用磁敏感加权成像(SWI)。各中心序列参数可能存在轻微差异，但所有图像均进行中央审查以确保评估一致性。所有扫描均由两位作者(S.K.和S.A.)独立评估，对患者的基因型和临床信息不知情；分歧由第三位作者(M.U.)调整，并通过共识确定最终评分。由于使用了裁决后的共识评分，未计算评分者间可靠性。白质高信号使用Fazekas量表分级；前颞叶病变严重程度按四点量表(0-3)评级。腔隙性梗死和微出血根据神经影像学血管变化报告标准进行定义。
统计分析
主要分析集中于携带致病性ABCC6变异的杂合子携带者。进行了两步敏感性分析：首先，包括所有致病性病例，无论纯合度如何(杂合子和双等位基因)；其次，添加携带意义未明变异的杂合子携带者，以评估对变异分类的稳健性。由于数据限制，未进行正式的亲缘关系过滤，但从临床和家系信息确认队列中未包括已知亲属。对于与微出血(MB)相关的结果，我们在Tukey fence定义的离群值排除后重复比较，该方法在每个诊断组内独立应用。在杂合致病性ABCC6组中，Q1和Q3分别为12和35(四分位距=23)，给出上限69.5；一个病例(Patient 7；总微出血数=524)超过此阈值，在敏感性分析中被排除。在CADASIL组中，Q1和Q3分别为1.0和16.5(四分位距=15.5)，上限为39.75；四个病例超过此阈值，在平行敏感性分析中被排除(最初有两个病例缺乏微出血数据，分析n=38)。
统计分析系统地解决了我们的主要研究问题。首先，我们调查了在日本人群中相对常见的ABCC6中p.M848fs变异频率是否在CSVD患者中高于日本公共数据库或我院的肌萎缩侧索硬化症队列。为此比较使用Fisher精确检验，统计显著性设为P < 0.05(单尾检验)。
为比较三组(ABCC6相关CSVD、CADASIL和未确定病例)之间的临床特征，对连续变量使用Kruskal-Wallis检验，对分类变量使用卡方检验。事后分析对连续变量使用Dunn-Bonferroni检验，对分类变量使用Bonferroni校正，以考虑多重比较。
为评估ABCC6致病性变异对出血性卒中的影响，我们开发了两个逻辑回归模型：模型1包括高血压和神经系统体征或症状的发病年龄，这是亚洲人群中CSVD和出血性卒中报告最一致的两个危险因素。鉴于队列中样本量和结果事件数量有限，未输入额外协变量以避免模型过拟合。模型2仅包括高血压。为每个模型计算调整后的比值比(OR)及95%置信区间(CI)。
为比较ABCC6相关CSVD和CADASIL之间的影像学发现，对连续变量使用Wilcoxon秩和检验，对分类变量使用Fisher精确检验。受试者工作特征曲线分析确定了与ABCC6相关CSVD相关的11.5个微出血阈值(敏感性：77.8%，特异性：71.4%)，使用Youden's J统计量。将多个微出血定义为>11(即≥12)，并使用基于此截断值的Fisher精确检验进行两组间比较。
结果
CSVD患者中ABCC6变异频率和特征
研究队列包括从日本91个神经学中心招募的158名连续先证患者，确保了广泛的全国代表性。在14例(8.9%)中鉴定出ABCC6变异，包括11名杂合子携带者、一名纯合突变和两名复合杂合突变。值得注意的是，一名患者(Patient 14)被临床和病理诊断为PXE。包含44名CADASIL患者和78名基因未确定CSVD患者的队列用于比较携带ABCC6变异的患者；排除了携带其他基因变异的患者。
本研究中鉴定的每个ABCC6变异的频率和致病性分类总结在表1和补充表S5中。移码变异最为常见，占突变等位基因的58.8%(10/17)，其中p.M848fs尤为普遍(52.9%，9/17)。所有移码变异(p.M848fs和p.L1313fs)均根据ACMG指南分类为致病性，并已在PXE中报道。观察到两个等位基因的无义变异：p.Q378X(n=1)，先前在PXE中报道；p.W14X(n=1)，一个早期发生在编码序列中的新型变异。尽管先前未报道，但p.W14X因ACMG(预测功能丧失；PVS1)被视为致病性。在一个病例中鉴定出涉及外显子7-10、23-25和30-31的大片段缺失，占ABCC6突变等位基因的5.9%(1/17)。ABCC6中的拷贝数变异已在PXE中报道，此类大片段缺失预计会导致截短或缺失的蛋白质产物，破坏ABCC6的ATP结合盒转运蛋白功能，可能导致血管钙化和小血管脆弱。错义变异占23.5%(4/17)，包括p.N428S(n=1)、p.R419Q(n=2)和p.S587C(n=1)。其中，p.R419Q被分类为致病性，并已在PXE中报道，而p.N428S和p.S587C被归类为意义未明变异，从主要分析中排除。尽管这些变异未在PXE中报道且缺乏足够的致病性证据，但它们与PXE相关的眼部表现和中风相关。考虑到这些变异虽因证据有限未被分类为致病性，但仍可能具有未被识别的致病潜力，它们仅被包括在探索性杂合子分析中。因此，主要分析中包括9例(5.7%)携带ABCC6致病性杂合变异的病例。当包括三名额外的双等位基因致病性变异患者(两名复合杂合子和一名纯合子)时，致病性病例总数为12例(7.6%)，用于敏感性分析。此外，当添加两名携带意义未明变异的携带者(p.N428S和p.S587C)时，杂合子病例总数变为11例(7.0%)，并在补充敏感性分析中进行了分析。
CSVD队列中p.M848fs的等位基因频率(0.052)显著高于一般日本人群(14KJPN数据集中1.4万名个体，2.8万个等位基因的0.014；P=0.001)和我院肌萎缩侧索硬化症队列(145名个体，290个等位基因的0.010；P=0.011)，支持其潜在相关性。
ABCC6相关CSVD的临床特征
ABCC6相关CSVD组的中位发病和诊断年龄分别为44[四分位距(IQR)：39-54.0]和46[IQR：45.0-54.0]岁，与CADASIL和基因未确定组相似(表2)。与CADASIL(55.6% vs 13.6%，P=0.039)和基因未确定组(55.6% vs 10.3%，P=0.010)相比，ABCC6相关CSVD组的出血性卒中显著更常见。ABCC6相关CSVD和CADASIL组之间的高血压患病率无显著差异(66.7% vs 31.8%，P=0.200)，与基因未确定组相似(66.7% vs 62.3%，P=1.000)。多变量逻辑回归证实了ABCC6致病性变异与出血性卒中之间的显著关联，即使在调整年龄和高血压后也是如此(未调整：OR：9.6，95% CI：2.3-42.8，P=0.002；模型1：OR：8.4，95% CI：2.0-38.4，P=0.004；模型2：OR：9.0，95% CI：2.1-41.2，P=0.003；表3)。当在敏感性分析中包括三名额外的双等位基因病例(两名复合杂合子和一名纯合子)时，与出血性卒中的关联仍然显著(模型1：OR 6.7，95% CI 1.8-25.0，P=0.004；模型2：OR 7.2，95% CI 2.0-26.5，P=0.003)，且ABCC6组的高血压患病率显著高于CADASIL(66.7% vs 31.8%；P=0.045)。在包括两名携带意义未明变异的杂合子携带者(p.N428S和p.S587C)的额外敏感性分析中，整体模式与仅杂合子分析相似，ABCC6-CADASIL组间高血压差异未达到显著性，与仅杂合子模式一致。
ABCC6相关CSVD和CADASIL的影像学特征
ABCC6相关CSVD的影像学特征与CADASIL不同(表4)。ABCC6相关CSVD组的前颞叶病变评分较低[中位数(IQR)：0(0-0) vs. 2(0-3)，P=0.004]。腔隙性梗死数量在ABCC6组中趋于较低，但组间无显著差异[中位数(IQR)：1(0-8) vs 7.5(2.8-13.3)，P=0.106]。相比之下，ABCC6相关CSVD组的脑出血率显著高于CADASIL组(55.6% vs. 11.9%，P=0.010)，特别是在幕下(22.2% vs. 0%，P=0.028)和脑叶(33.3% vs. 2.4%，P=0.014)区域。ABCC6相关CSVD组中具有多个微出血的患者比例也更高(77.8% vs. 28.6%，P=0.010)。在ABCC6相关CSVD组中，微出血在脑叶区域频繁观察到[中位数(IQR)：8.5(0.8-20) vs. 0.5(0-4.8)，P=0.031]，与脑内出血类似。在ABCC6相关CSVD组中观察到幕下区域微出血增加的趋势，尽管差异无统计学意义中位数(IQR)：2(0.75-8.5) vs. 0(0-1.8)，P=0.050。
当在敏感性分析中包括三名双等位基因致病性病例(两名复合杂合子和一名纯合子)时，整体影像学模式与表4中呈现的结果一致，但腔隙性梗死[中位数(IQR)：1(0-7.3) vs 7.5(2.8-13.3)，P=0.021]和幕下微出血[中位数(IQR)：2(0.8-8.5) vs 0(0-1.8)，P=0.031]的差异变得显著，而杂合子分析中观察到的脑叶微出血差异不再显著[中位数(IQR)：8.5(0.75-20) vs 0.5(0-4.8)，P=0.082]。双等位基因病例本身的腔隙负担较低(总共0-3个)。当在补充敏感性分析中添加两名携带意义未明变异的杂合子携带者(p.N428S和p.S587C)时，结果与仅杂合子分析相似：腔隙无显著差异，而脑叶微出血仍然显著更高，幕下微出血在ABCC6组中也达到显著性(P=0.019)。
在排除Tukey fence定义的离群值(ABCC6组中的Patient 7和CADASIL组中的四个病例)后，多个微出血(≥12)的差异仍然显著(6/8 vs 8/38，P=0.006)。ABCC6相关CSVD组继续显示更高的总微出血计数[中位数(IQR)：17(9-32.8) vs 3.5(1-11)，P=0.080]，幕下[中位数(IQR)：2(0-4.3) vs 0(0-1)，P=0.043]和脑叶区域[中位数(IQR)：8.5(1.5-15.5) vs 0(0-2)，P=0.018]的参与显著更高。这些发现证实，即使在两组中对称排除离群值后，ABCC6相关CSVD中的出血为主模式仍然稳健。
讨论
我们在一个全国性、多中心的日本队列中确定了与ABCC6致病性变异相关的易出血CSVD表型，在调整年龄和高血压后，出血性卒中的几率更高。在九名杂合子携带者的主要分析中，这种关联是显著的，包括双等位基因致病性病例和携带意义未明变异的杂合子携带者的敏感性分析证实了发现的稳健性。与CADASIL相比，影像学差异——前颞叶病变较少和出血标志物负担更大——是明显的，CADASIL是一种具有已确立影像学标准的单基因CSVD，允许进行详细的直接比较。腔隙的差异在杂合子分析中不显著，但在包括双等位基因病例时变得显著。与先前的病例系列相比，我们的分析利用了来自日本91个神经学中心的全国性、多中心队列，增强了在此人群中的可推广性。
ABCC6相关CSVD中观察到的出血倾向增加可能反映了PXE病理；弹性纤维钙化和断裂可能会损害血管完整性，可能增加出血事件风险。PXE中类似的病理变化发生在胃动脉中，提示在脑小血管中发生类似的过程。此外，毛细血管形态和细胞外基质组成的改变可能进一步使ABCC6相关CSVD患者易患出血。
我们的影像学分析确定了特征性的ABCC6相关CSVD特征，特别是出血模式。携带ABCC6致病性变异的患者显示出显著更多的脑叶微出血和幕下微出血的边界增加(P=0.050)，以及与CADASIL相比显著更多的脑叶和幕下脑内出血和最少的前颞叶受累。重要的是，出血事件在东亚人群(包括日本)的CADASIL中并不少见；一项荟萃分析报告亚洲队列中脑内出血发生率(17.7%)高于欧洲队列(2.0%)，一项全国性日本调查显示47.7%的CADASIL患者存在脑微出血，支持CADASIL作为此人群中适当的比较对象。此外，我们的队列包括六名NOTCH3 p.R75P患者，这是一种与出血倾向CADASIL相关的变异。
就分布而言，特征性的脑叶和幕下出血模式可能有助于鉴别诊断。值得注意的是，由于脑叶出血在也表现为出血性病变的COL4A1/2相关CSVD中很少见，脑叶和幕下出血模式可能提示ABCC6相关病理。
在各种敏感性分析中，结果基本一致：出血为主的影像学特征得以保留；只有包括双等位基因病例改变了显著性分布(腔隙显著；脑叶微出血不显著)，而添加携带意义未明变异的携带者(p.N428S和p.S587C)重现了仅杂合子的发现。在两组中处理离群值后，多个微出血(≥12)的差异仍然显著(6/8 vs 8/38，P=0.006)；ABCC6组的脑叶微出血也显著更高(P=0.018)，支持稳健性。在我们的队列中，p.M848fs占主导地位，与日本PXE数据一致，而常见的欧洲等位基因p.R1141X未被观察到。这种人群特异性谱可能提示变异依赖效应(例如，p.R1141X与缺血性冠状动脉疾病相关)，但我们的样本量不允许进行正式的亚组分析；它也可能有助于解释与主要非日本报告的差异，后者强调缺血性卒中，而我们的日本队列表现出出血倾向表型。关于纯合度，本研究中大多数ABCC6相关CSVD病例为杂合子(11/14)，一名纯合子和两名复合杂合子。鉴于有报道称杂合子携带者存在亚临床/部分表型，我们不能排除杂合子效应对观察到的CSVD特征的影响；然而，单等位基因致病性变异的临床意义仍不确定，需要在更大规模、多族裔队列中进一步研究。
我们的发现应解释为风险关联而非因果效应。尽管如此，ABCC6致病性变异与出血性卒中的关联在调整年龄和高血压后仍然显著，并伴有与CADASIL相比的汇聚影像学差异，前颞叶病变较少，出血标志物负担更大，但总体卒中发生率或缺血性卒中无差异。ABCC6组的高血压患病率倾向于高于CADASIL组(66.7% vs 31.8%)，我们未调整血脂异常或其他代谢介质；实验数据表明ABCC6缺乏可促进血脂异常和动脉粥样硬化，这可能有助于出血负担。然而，在我们的队列中，各组间的血脂异常患病率相当(ABCC6 37.5%，CADASIL 40.9%，未确定40.3%)，无显著差异。临床上，ABCC6致病性变异可能作为出血性CSVD表型的风险修饰因子，强调了全面血管风险评估和在独立、多族裔队列中验证的必要性。
本研究存在局限性。首先，适中的样本量和横断面设计限制了稳健性，无法进行因果推断。其次，MRI采集同时使用T2*和SWI，中心间协议存在轻微差异；尽管进行了中央、标准化评分，但这些差异可能影响微出血检测。第三，ROC推导的"多个微出血"(>11)阈值是探索性的，缺乏外部验证。第四，影像学比较仅针对CADASIL进行；与其他单基因CSVD的直接比较数据不可用。第五，NOTCH3 p.R75P变异在东亚相对常见且与出血性病变相关，但仅在六名患者中识别，无法进行有意义的亚组分析。第六，我们未评估APOE ε2/ε4，这限制了对共存脑淀粉样血管病(CAA)的形式排除；然而，鉴于队列的相对年轻发病年龄和幕下为主的微出血模式，且皮质表层铁沉积无明显过量，CAA的主要混杂似乎不太可能。第七，血脂谱和抗血栓暴露未纳入多变量模型；未来研究应明确评估这些潜在的中介和混杂因素。第八，由于外显子组测序可能遗漏深内含子或结构变异，一些明显的杂合子可能在ABCC6中携带未检测到的第二个突变(如个别病例中PXE相关眼部发现所暗示)，这可能使纯合度特异性估计产生偏差。最后，由于患者招募基于疑似遗传性CSVD的转诊，研究队列可能富含相对严重或典型病例，表现出广泛和对称的白质高信号。如果未转诊，轻度或非典型病例可能代表性不足。我们没有关于可能符合条件但未转诊患者的系统数据。然而，由于转诊标准在全国参与中心标准化，且所有符合这些预定义标准的转诊患者均被包括在内，转诊过程对队列内比较的影响可能不大，尽管对严重CSVD以外的可推广性可能有限。此外，转诊站点的临床判断可能引入了一些我们无法量化的选择效应。
ABCC6致病性变异与日本患者中一种独特的CSVD表型相关，可能以出血负担增加和出血为主影像学特征为特征。这些发现支持ABCC6在CSVD中的贡献作用，并强调了在不同人群中进行验证的必要性。
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