摘要
创伤性脑损伤（TBI）是长期神经功能障碍的主要诱因，而衰老加剧其易感性并恶化康复效果。老年个体在TBI后面临更严重的认知和运动障碍，且对治疗的响应性较低，因为衰老和TBI均会独立升高神经炎症并导致认知衰退。本研究评估了人脂肪干细胞来源小细胞外囊泡（hASC-sEVs）对TBI小鼠模型神经康复和神经炎症的治疗作用。3个月、15个月和20个月龄的雄性C57BL/6小鼠接受受控皮质撞击（CCI），伤后48小时经鼻给予hASC-sEVs，对照组接受PBS。剂量反应研究在伤后7天（dpi）确定20 µg为最佳治疗剂量，可改善运动功能、减少神经炎症并促进神经发生。后续30 dpi研究通过质谱分析评估认知功能、神经炎症、神经发生及小胶质细胞和星形胶质细胞的蛋白质组学变化。hASC-sEV治疗显著改善行为学结果并降低神经炎症标志物（GFAP、IBA-1、MHC-II），但老年小鼠疗效减弱。蛋白质组学分析显示hASC-sEVs减少炎性蛋白（TNF-α、IL-1β、IFNG、CCL2）并调控线粒体功能障碍和活性氧通路。这些结果表明hASC-sEVs作为无细胞疗法在TBI治疗中具有潜力，尤其对老龄化人群。
1. 引言
创伤性脑损伤（TBI）是全球主要医疗挑战，导致慢性记忆障碍、痴呆、tau蛋白病理、精神病、癫痫、中风和神经退行性疾病等多种疾病。全球每年TBI病例估计达6900万例。美国疾病控制与预防中心（CDC）报告显示，2025年数据显示，75岁以上老年人群占TBI相关住院人数的32%和死亡率的28%。TBI病理生理学包括急性损伤的初次反应和涉及神经炎症的继发反应。衰老已被证实是TBI预后的独立预测因素，与青壮年相比，老年人群在急性和慢性脑损伤后表现出更高的发病率和死亡率。衰老与“炎性衰老”（inflammaging）相关慢性低度炎症，导致认知衰退，并在TBI后进一步加剧。细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP）加剧炎性衰老和认知老化。年龄相关的免疫反应变化可能在老年TBI动物中导致更差的神经学结果，因其大脑中SASP相关慢性炎症促进疾病和功能障碍。研究显示，老年TBI动物表现出脂质过氧化标志物升高和抗氧化酶活性降低。此外，海马体相关的创伤后神经炎症和小胶质细胞、星形胶质细胞的持续活化也受到衰老的深远影响。
小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的主要免疫细胞，除免疫监视外，还参与神经发生、突触修剪和神经营养因子产生。年轻大脑中小胶质细胞维持平衡反应，有助于神经保护；而老年脑或TBI后的小胶质细胞表现为引发的促炎表型，MHC II、IL-1β、TNF-α、CD86、ED1等标志物表达增加，而对IL-10和IL-4等抗炎信号的响应减弱。TBI后，小胶质细胞从分支状转变为肥大或丛状形态，上调Iba-1，这种变化在老年TBI大脑中更显著，分支状小胶质细胞减少，反应性形式在皮质、齿状回和丘脑中增加。
星形胶质细胞是CNS的另一关键胶质群体，通过钙信号传导、血流调节和血管活性分子释放支持神经元和血管功能。TBI后，星形胶质细胞经历反应性胶质化，表现为肿大、GFAP和波形蛋白上调以及胶质瘢痕形成。瘢痕虽隔离损伤组织并恢复血脑屏障，但可能阻碍轴突再生。星形胶质细胞反应性损害谷氨酸清除，加剧兴奋毒性。
小胶质细胞和星形胶质细胞在TBI后动态互作，通过双向信号传导介导保护性和损害性反应。小胶质细胞通过嘌呤能受体响应星形胶质细胞释放的ATP和损伤相关分子模式（DAMPs），清除碎片并与浸润的免疫细胞协调。但过度活化通过活性氧和嘌呤类物质传播神经炎症，导致继发损伤和神经认知衰退。
尽管已有大量临床前研究，将神经保护策略转化为TBI临床疗法仍具挑战。细胞疗法是新兴方向，脂肪组织提供易获得的间充质干细胞（MSCs），再生和分化能力不受供体年龄影响。人脂肪干细胞（hASCs）具高分离效率和低伦理争议，是再生应用的候选者。hASCs分泌的生物活性分子通过小细胞外囊泡（sEVs）调控局部组织微环境，参与免疫调节、轴突生长、血管生成和组织修复。sEVs携带蛋白质、mRNA和非编码RNA，保留亲本细胞的治疗功能，包括神经再生、抗凋亡、氧化应激减少和组织重塑，被视为有前景的治疗剂。
越来越多的证据支持MSC来源sEVs在TBI后促进功能恢复的潜力。它们通过生物活性物质调节免疫反应、抑制神经炎症并支持修复。前期研究表明，静脉注射hASCs改善年轻大鼠TBI后的运动和认知结果，但在老年动物中效果减弱。此外，TBI后48小时经鼻给予hASC-sEVs可增强年轻小鼠的恢复，但其在老年TBI模型中的疗效尚待明确。MSC-EVs还促进神经元和星形胶质细胞分化、调节T细胞反应并缓解氧化应激。尽管前景可观，仍需优化递送策略、剂量和治疗时间以实现临床转化，特别是对老年人群。
2. 材料与方法
2.1. 动物护理
所有外科手术均遵循南佛罗里达大学动物护理与使用委员会（IACUC）指南，努力减少动物不适。使用3个月（年轻）、15个月（中年）和20个月（老年）雄性C57BL/6小鼠。动物在标准条件（20°C，50%湿度，12小时昼夜循环）下适应一周后随机分为假手术组、TBI+PBS（未治疗）组或TBI+sEVs（治疗）组。TBI通过受控皮质撞击（CCI）诱导，假手术组仅做中线头皮切口。所有实验由对治疗分组盲法的实验人员完成。
2.2. 受控皮质撞击（CCI）小鼠模型
经1-2%异氟烷麻醉后，将年轻（3月龄）和老年（15-20月龄）C57Bl/6小鼠固定于立体定位框架。通过呼吸频率和足部反射确认麻醉深度，维持体温37°C。眼膏后中线头皮切口暴露颅骨，手持钻头在前-后0.2 mm和内-外0.2 mm坐标制作4 mm颅骨切除术，移除骨瓣。使用3 mm撞击器头（20°角以匹配皮质曲率）进行CCI，参数设置为4.0 m/s速度、-0.95 mm深度（轻度CCI）和300 ms停留时间。为避免立即颅骨重建加重脑水肿和组织损伤，保留颅骨窗口开放。术后缝合伤口并置于加热恢复舱至自主活动。所有动物维持标准饮食。假手术组仅执行颅骨切口和撞击过程。
2.3. 人脂肪干细胞小细胞外囊泡（sEVs）的分离与收集
2.3.1. 细胞培养
人脂肪干细胞（hASCs）来自ZenBio公司（BMI 27.9），所有供体为非吸烟非糖尿病女性。hASCs在T75培养瓶中生长至90%融合度后，更换为无血清基础培养基，48小时后收集条件培养基（CM）。
2.3.2. sEVs分离与表征
CM经3000×g离心15分钟去除细胞碎片，用10 kDa分子量截留过滤器（MWCO）浓缩后通过qEV柱（IZON，35 nm）分离sEVs。sEVs经PBS洗脱，每500 µL收集分馏物。实验室通过Western blot（CD9、CD63、CD81）、纳米颗粒追踪分析（NTA3.1，90-275 nm粒径范围）和自动化Western blot（CD9、CD63、TSG101、ALIX）验证sEVs。
2.4. sEVs鼻内递送
CCI术后48小时，经1-2%异氟烷轻度麻醉小鼠，鼻内递送sEVs（P10移液器头双侧鼻腔等量递送）。对照组接受PBS，治疗组接受10、20或50 µg剂量，每鼻孔最大5 µL。两鼻孔给药间隔10分钟恢复期。3月龄和15月龄小鼠测试10和20 µg剂量，但预测20月龄小鼠治疗反应减弱，故额外评估50 µg剂量。
2.5. 行为学测试
2.5.1. 升高体摆动测试（EBST）
EBST评估TBI后单侧脑损伤常见的运动不对称性。小鼠置于透明隔间适应2分钟，尾部抬起后记录超过10°摆动方向。20次摆动中10次为无偏侧（基线无偏侧）。基线评估于CCI术前1天进行，术后24小时重新评估后随机分配至假手术、TBI+PBS和TBI+20 µg EVs组。术后1、3、5天进行EBST，分阶段队列数据汇总分析。
2.5.2. Y迷宫测试
Y迷宫评估TBI小鼠空间工作记忆和海马功能。三臂（A、B、C）呈120°角。每只小鼠从A臂引入，自由探索10分钟。记录自发交替行为（连续进入三臂为正确三联体，重复进入同一臂为错误）。视频跟踪系统分析路径。
2.5.3. 开场测试（OFT）
OFT测量探索和焦虑样行为。小鼠置于40×40 cm开放场箱中探索10分钟，记录探索距离和平均速度。
2.5.4. 新物体/新场所识别测试（NPNOR）
测试前24小时进行OFT适应。次日，小鼠在40×40 cm箱中探索两相同物体（熟悉阶段5分钟），3小时后进行场所测试（移动物体）和物体测试（替换新物体）各10分钟。记录探索时间。
2.6. 免疫组化分析（IHC）
2.6.1. 脑组织采集与切片
CO2安乐死后经心脏灌注PBS去除血液，4%多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖转移，40 µm冠状切片保存于低温冷冻保护剂中。
2.6.2. 小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元标志物染色
每六片冠状切片进行GFAP（星形胶质细胞标志物）、IBA-1（小胶质细胞标志物）、MHC II（主要组织相容性复合体）和DCX（双皮质素，新生神经元标志物）免疫染色。使用全自动Western blot系统分析蛋白质表达。
2.6.3. 病变体积分析
每六片冠状切片经苏木精QS染色，使用Cavalieri估计法量化同侧半球病变体积。
2.7. 小胶质细胞和星形胶质细胞分离
CO2安乐死后经心脏灌注冷盐水去除血液，断头取脑沿中线矢状面分割。使用Adult Brain Isolation Kit（Miltenyi Biotec）分离，70 µm滤网过滤，流式分选CD11b+CD45int小胶质细胞和ACSA-2星形胶质细胞。
2.8. 基于质谱的蛋白质组学
分选后的小胶质细胞和星形胶质细胞经iST样本制备套件处理，使用nanoElute2纳米流超高效液相色谱系统（UHPLC）结合timsTOF Pro质谱仪分析。使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行蛋白质通路激活/抑制预测。
2.9. 定量与统计分析
使用GraphPad Prism（v9.0.1）进行免疫组化、病变体积和行为学数据分析。7 dpi剂量反应实验用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验确定最佳剂量。30 dpi两因素ANOVA评估年龄和sEVs治疗交互效应。使用重复测量ANOVA分析纵向运动功能。蛋白质组学数据经DIA-NN库免费模式分析，应用FDR<0.05阈值。
3. 结果
3.1. hASC-sEV剂量反应显示20 µg在7 dpi时最有效改善年轻和老年小鼠TBI引起的运动障碍
EBST显示，TBI后1天所有年龄段受伤小鼠的运动不对称性显著高于假手术组。伤后48小时给予不同剂量sEVs后，年轻小鼠（3月龄）10 µg和20 µg剂量在术后3天和5天显著改善摆动偏侧性，其中20 µg恢复更明显。15月龄组10 µg和20 µg剂量术后3天摆动偏侧性显著降低（p<0.0001），术后5天20 µg持续降低偏侧性。20月龄小鼠三剂量中20 µg术后3天减少偏侧性（p<0.0058），术后5天10 µg和20 µg持续降低（p<0.0001），而50 µg无进一步改善。
3.2. hASC-sEV剂量反应效应显示20 µg在7 dpi时最有效减少年轻和老年小鼠皮质病变体积
苏木精QS染色和Cavalieri估计法显示，3月龄和15月龄TBI组20 µg sEVs显著降低皮质损伤（p=0.0022，p=0.0296）。20月龄组中仅20 µg剂量相比其他剂量显著减少病变体积（p<0.0001）。
3.3. hASC-sEV剂量反应分析显示20 µg在7 dpi时最有效减少年轻和老年TBI小鼠炎性标志物表达
免疫组化显示，3月龄TBI+PBS组GFAP+表达显著高于假手术组（p<0.0001），10 µg和20 µg EVs组减少GFAP+表达（p=0.0015，p=0.0386）。15月龄组两剂量均显著降低GFAP+（p=0.0001，p<0.001）。20月龄组三剂量均显著减少GFAP+（p<0.0001，10 µg；p=0.0004，50 µg）。海马体中20 µg EVs组所有年龄组均显著减少GFAP+。IBA-1+染色在3月龄和15月龄TBI组中10 µg EVs组减少（p<0.0001），20 µg组三年龄均显著减少（p<0.0001）。20月龄组50 µg剂量IBA-1+减少（p<0.0001），海马体中所有三剂量均有效。
3.4. 7 dpi时年轻和老年TBI小鼠中hASC-sEV对双皮质素（DCX）表达的剂量反应
经DCX免疫标记和体视学定量，3月龄TBI+20 µg EVs组DCX+细胞数显著高于假手术和TBI+PBS组（p<0.0001）。15月龄组10 µg和20 µg EVs组相比假手术组显著增加（p=0.0147，p=0.0015），但20月龄组TBI+20 µg和50 µg EVs组相比假手术组显著增加（p=0.0001），与TBI+PBS组无统计学差异。
3.5. 30 dpi时hASC-sEV增强年轻和老年TBI小鼠认知功能
确定20 µg剂量最有效后，将研究延长至30 dpi（图3A），包括新场所识别（NPR）和新物体识别（NOR）测试。OFT显示不同年龄治疗组间平均速度和距离无显著差异。NPR测试显示年龄（F(2,18)=21.17）和治疗（F(2,18)=37.00）影响显著（p<0.0001），TBI+PBS小鼠各年龄段NPR时间均短于假手术组（p<0.05），但EV治疗后显著增加（3月龄p=0.0006，15月龄p=0.0028，20月龄p=0.0064）。NOR测试治疗影响显著（F(2,18)=97.06，p<0.0001），治疗后探索时间显著增加（p<0.0001）。年龄与治疗交互效应显著（F(4,34)=3.318，p=0.0213），表明老年动物对治疗的响应减弱。Y迷宫显示年龄对交替性无显著影响，但20月龄组总臂进入次数显著减少（F(2,18)=24.2，p<0.05）。
3.6. 30 dpi时hASC-sEV减少老年小鼠皮质脑损伤和胶质细胞活化
30 dpi时，TBI诱导的病变体积受年龄影响（3月龄小鼠病变体积显著低于15-和20月龄，p<0.0001），EVs显著减少各年龄组病变体积（p<0.05），且年龄-治疗交互效应显著（F(4,15)=18.35，p<0.0001）。GFAP+免疫染色在15-和20月龄TBI+PBS组皮质面积高于3月龄组（p=0.0006，p<0.0001），EV治疗后各年龄组GFAP+减少（p<0.05），但15-和20月龄组减少幅度小于3月龄组。海马体GFAP+表达结果相似（p<0.05）。IBA-1+（皮质F(2,8)=122.3，p<0.0001；海马体F(2,8)=64.37，p<0.0001）和MHC-II（丘脑F(2,8)=398.5，p<0.0001）表达年龄依赖性减少（交互F(4,14)=5.819，p=0.0057；F(4,15)=13.82，p<0.0001）。DCX+细胞数年龄依赖性减少（p<0.0001），但EV治疗组与同龄TBI+PBS组无显著差异。
3.7. 30 dpi时TBI小鼠hASC-sEV的胶质细胞蛋白质组学分析
蛋白质组分析显示，3月龄组中TBI诱导的炎症信号通路（MAPK、MHC I/II、中性粒细胞脱颗粒、促炎性IL-6/15信号）激活，EVs治疗抑制这些通路。15月龄组cGAS-STING（先天免疫重要调节物）TBI后增加，EVs治疗减少。兴奋毒性通路、一氧化氮（NO）和活性氧生成、线粒体功能障碍及Nrf2介导的氧化应激减少，15月龄组更明显。15-和20月龄组TBI后转录和剪接减少，EVs治疗逆转。功能通路分析显示TBI+PBS/sham组吞噬作用、内吞作用、小胶质细胞活化和细胞免疫反应预测激活，EV治疗抑制。上游调节因子（TCF7L2、CD38、CD44、CD40、IL5、IL1、TNF、TLR4、NFkB、IL1B、IFNG）激活Z得分TBI后增加，EV治疗减少。
星形胶质细胞分析显示3月龄组无显著变化，15-和20月龄TBI+PBS/sham组促炎上游调节因子（CD38、NFKB1、TNF、IL1B PTEN、IFNG）激活，TBI+EVs/TBI+PBS组抑制。15月龄TBI+PBS/sham组转录调节因子TCF7L2激活，TBI+EVs/TBI+PBS组抑制。20月龄组IL-1β调节蛋白响应。
4. 讨论
衰老加剧TBI后结局已获广泛认可。本研究扩展至年龄对治疗响应的影响。hASC-sEVs在年轻和老年小鼠中均显示治疗效应。sEVs携带的蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA提供显著神经保护和再生能力。前期经鼻给予hASC-sEVs后，sEVs富集于损伤区域并被神经元和小胶质细胞摄取，10 µg剂量减少年轻小鼠CCI引起的病变和神经炎症。干细胞研究显示老年啮齿动物疗效减弱。本研究评估hASC-sEVs经鼻递送在TBI后48小时（临床相关时间窗）的疗效，发现20 µg剂量效果最优，7 dpi时显著减少病变体积，7和30 dpi时降低IBA-1和GFAP表达，并改善短期运动和长期认知功能。
老年小鼠TBI后炎症标志物（GFAP、IBA-1、MHC-II）基础水平较高，EV治疗后慢性炎症仍持续，表明衰老与治疗响应的交互作用。蛋白组学分析显示，TBI+PBS/sham组小胶质细胞促炎信号激活，EV治疗抑制。15月龄组cGAS-STING通路TBI后激活，EV治疗减少。兴奋毒性通路、NO/ROS生成、线粒体功能障碍减少。星形胶质细胞EV治疗间接作用可能通过小胶质细胞-星形胶质细胞或神经元-星形胶质细胞互作实现。
本研究显示hASC-sEVs改善TBI后运动和认知恢复，但疗效年龄依赖。30 dpi时老年小鼠病变体积和神经炎症标志物（IBA1、GFAP）仍较高，蛋白组学分析显示15月龄小鼠胶质反应显著差异。研究局限包括：仅使用雄性小鼠；年龄可能影响sEVs摄取；50 µg高剂量无效；未探索无TBI老年小鼠sEVs作用；未评估48小时后治疗窗口。未来需扩展治疗时间窗，评估单次和多次治疗在TBI慢性期的疗效，更贴近真实临床场景。
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