摘要
引言： 阿尔茨海默病(AD)不仅涉及淀粉样β和tau病理，还涉及突触功能障碍和自噬受损，但其潜在机制及其与AD进展的关系尚不完全清楚。涉及突触前神经连接蛋白(neurexins, Nrxn1/2/3)、分泌型小脑蛋白(cerebellins, Cbln1/2/3/4)和突触后谷氨酸δ受体(glutamate delta receptors, GluD1/2)的跨突触复合物在组织突触和突触可塑性方面发挥关键作用。疼痛模型研究表明，重组Cbln1治疗可挽救AMPA谷氨酸受体失衡，促进自噬，并抑制高兴奋性和疼痛行为。在此，我们测试了一个新假设：Cbln-GluD为基础的跨突触复合物的失调可能发生在AD患者脑中，这为了解疾病进展和潜在的治疗开发提供了见解。
方法： 我们分析了来自德克萨斯理工大学健康科学中心Garrison脑库和美国国立卫生研究院神经生物库的人类海马组织，研究了跨突触复合物组分以及自噬和神经可塑性通路的表达。将海马体中的表达在对照样本(Braak分期0/1)和显示轻度(Braak分期2)或重度(Braak分期5/6)神经原纤维缠结病理的AD样本之间进行比较。使用免疫共沉淀来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
结果： 我们发现AD海马体中Cbln1和GluD2的蛋白水平显著降低。在自噬通路中，PIST和beclin-1在AD海马体中也降低。免疫共沉淀显示GluD1与PIST以及PIST与beclin-1之间存在相互作用，表明跨突触复合物元素和人类海马体自噬之间可能存在调节性相互作用。我们进一步观察到BDNF降低，与神经可塑性减弱一致。最后，cofilin磷酸化在AD中降低，提示交通和cofilin-actin杆状结构形成受到破坏。
讨论： 这些结果表明，在人类海马体的早期和晚期AD中，对突触完整性重要的信号分子的稳态被破坏。跨突触复合物表达的丧失伴随着自噬和神经可塑性标志物的下调，这些标志物已知与AD病理相关。
1 引言
阿尔茨海默病(AD)的定义是神经病理学变化，集中在淀粉样β(Aβ)斑块(A)、tau缠结(T)和神经退行性变(N)(Jack等，2016)。AD还涉及神经炎症、异常自噬和神经可塑性减弱(Parhizkar和Holtzman，2022；Festa等，2021；Benarroch，2018)，它们在AD病理学中的相互作用尚不完全清楚。有证据表明，神经网络功能在AD早期阶段(包括海马体)受损，可能先于临床上可检测到的ATN病理和认知症状(Tang等，2023；Sperling等，2010；Cirrito等，2005)。鉴于缺乏高度有效且广泛可用的治疗方法，更好地了解神经可塑性变化可能为早期干预提供新途径。
涉及神经连接蛋白(Nrxn)、小脑蛋白(Cbln)和δ类谷氨酸受体(GluD)的三部分跨突触复合物在突触形成和可塑性方面发挥重要作用(Andrews和Dravid，2021；Wennagel和Charrier，2025)。Cbln1、Cbln2和Cbln4在海马体和大脑皮层表达，这些是AD中关键的脑区(Tao等，2018；Sudhof，2023)。GluD1和GluD2都在海马体和大脑皮层中表达，尽管GluD1占主导地位(Nakamoto等，2020；Hepp等，2015)。某些Nrxn-Cbln-GluD组合在特定脑区或突触类型中占主导地位(Wennagel和Charrier，2025)。与本研究相关的是，Nrxn1-Cbln2-GluD1复合物对海马体中的突触形成和维持很重要(Tao等，2018)。Nrxn1-Cbln2-GluD1复合物对海马体下脚(subiculum)中NMDA受体的上调也很重要，而Nrxn3-Cbln2-GluD1复合物下调AMPA受体(Sudhof，2023)。尽管这些组分的不同组合可产生不同效果，但可能存在一定程度的功能重叠，可用于在自然表达的脑区和突触之外实现治疗反应(Suzuki等，2020；Tao等，2018)。例如，Cbln1、Cbln2和Cbln4都能在CA1锥体神经元中增加AMPA和NMDA兴奋性突触后电流，即使这些突触天然采用通过GluD1的Cbln2介导的信号传导(Tao等，2018)。
GluD受体不像AMPA和NMDA受体那样是传统的谷氨酸门控离子通道。相反，它们被称为谷氨酸受体是基于与发现时识别的AMPA、NMDA和红藻氨酸受体亚基的序列同源性(Tricoire和Hepp，2023；Piot等，2023)。虽然已报道GluD受体的阳离子通透性(Kumar等，2023)，但这些电流的重要性存在争议(Itoh等，2024)，GluD1/2最重要的作用可能是作为调节谷氨酸受体密度和自噬的非离子型信号传导的转导子(Fossati等，2019；Gawande等，2022)。GluD1和GluD2已被发现与PIST相互作用(Yue等，2002；Narasimhan等，2025)，并且在GluD1条件性敲除小鼠的感觉皮层中beclin-1表达显著降低(Gawande等，2022)，进一步将跨突触复合物与自噬机制联系起来。
虽然AD中Nrxn-Cbln-GluD跨突触复合物功能障碍尚未得到探索，但神经连接蛋白表达已在J20 AD小鼠中进行研究，发现它们的海马体和皮层β-神经连接蛋白水平低于野生型(Naito等，2017)。对Cblns在AD中的研究同样稀少。Cbln4在培养的源自小鼠海马体的神经元中保护免受Aβ诱导的损伤，可能通过促进GABA能连接(Chacon等，2015)，而Cbln1和神经元五聚素1的合成融合蛋白改善了5xFAD AD小鼠模型的症状(Suzuki等，2020)。GluD受体在AD中的作用尚不清楚。
在慢性疼痛模型中进行的最新研究中，这些模型的特征是神经可塑性和神经免疫信号的变化，发现GluD1信号功能障碍在边缘区域(杏仁核)中异常神经元兴奋性和AMPA受体的自噬周转中起重要作用，可以通过将重组Cbln1给药到脑中来缓解(Narasimhan等，2025)。基于此和上述文献中的其他证据，我们假设Cbln-GluD复合物的失调可能发生在AD中。目前关于跨突触复合物功能障碍是否是人类AD神经病理学特征的知识存在空白。为了避免来自动物模型的可转化性问题，我们使用人类大脑分析了来自对照个体和AD患者的海马体样本中Cbln、GluD以及自噬和神经可塑性的标志物，这些AD患者显示轻度[Braak分期(BB) 2]或重度(BB5/6)tau神经病理学。据我们所知，跨突触复合物和自噬机制的相互作用尚未在人类或AD环境中进行研究。我们的数据表明，Cbln-GluD跨突触信号传导的缺陷与AD患者海马体中自噬、神经可塑性和肌动蛋白介导的交通异常相关。未来的研究需要确定这些通路在正常和病理海马生理条件下如何功能上相互关联。
2 方法
2.1 受试者和样本
人类海马体样本来自德克萨斯理工大学健康科学中心(TTUHSC)Garrison脑库(GBB)和美国国立卫生研究院(NIH)神经生物库(NBB)(Freund等，2018)。根据Braak分期(一种死后tau病理测量方法)定义了三组研究对象：对照组(BB0/1)、轻度tau病理AD患者(BB2)和重度tau病理AD患者(BB5/6)。
2.1.1 GBB样本
来自对照个体(BB0/1, n=5)和AD患者轻度(BB2, n=3)或重度(BB5/6, n=6)tau病理的海马体组织用于蛋白质研究。所有受试者均为女性，来自真实世界环境，即没有任何受试者在死亡前是痴呆观察性临床研究的一部分，这使该队列在研究痴呆相关分子机制方面具有独特性。组织经家属知情同意捐赠给TTUHSC Garrison老龄化研究所。使用死后人类标本的研究不需要联邦法规45 CFR 46下的机构审查委员会批准。人口统计学和病理信息见补充表S1。右半球固定在10%缓冲福尔马林中，并由持证神经病理学家检查。补充图S1显示了来自一个对照海马体、一个BB2 AD海马体和一个BB5/6 AD海马体的pTau染色的代表性示例，这些示例由Tissue Techniques病理实验室(美国德克萨斯州达拉斯)进行，供神经病理学家使用。左半球以1 cm冠状切片，真空密封，并储存在-80°C。使用2,100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉)验证了储存组织的质量。所有标本的RNA完整性数(RIN)为4或更高，组间RIN无显著差异。
2.1.2 NBB样本
来自对照个体(BB0/1, n=5)和AD患者轻度(BB2, n=9)或重度(BB5/6, n=9)tau病理的海马体组织用于qPCR实验。显示在补充表S2中的人口统计学和病理信息由NIH NBB提供。组织根据NBB请求ID#1455和联邦广泛保证号FWA00006767获取。
2.2 蛋白质印迹
组织在RIPA缓冲液(cat#89901，Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中裂解，含有cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物(cat#11836153001，MilliporeSigma，美国马萨诸塞州伯灵顿)，或在Pierce IP裂解缓冲液(cat#87787，Thermo Fisher)中含Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂(cat#78440，Thermo Fisher)。使用Pierce BCA测定(cat#A55865，Thermo Fisher)测量蛋白质浓度。蛋白质在含β-巯基乙醇的LDS缓冲液中准备用于凝胶电泳。将等量总蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上，转移到PVDF膜上，并在含5% w/v脱脂奶粉的TBST(TBS和0.1% Tween 20)中封闭2小时。然后在4°C下用一抗兔抗体孵育膜过夜：抗Cbln1(1:500；cat#PA5-101513，Thermo Fisher)、抗Cbln2(1:1000；cat#PA5-36471，Thermo Fisher)、抗GluD1(1:1000；cat#13040-1-AP，Proteintech，美国伊利诺伊州罗斯蒙特)、抗GluD2(1:1000；cat#AGC039，Alomone Labs，以色列耶路撒冷)、抗beclin-1(1:1000；cat#PA1-16857，Thermo Fisher)、抗PIST(GOPC，cat#12163-1-AP，Proteintech)、抗BDNF(1:500；cat#PA5-85730，Thermo Fisher)、抗磷酸化cofilin(1:1000；cat#3313，Cell Signaling，美国马萨诸塞州丹弗斯)和抗cofilin(1:1000；cat#3318，Cell Signaling)。PVDF膜随后用TBST洗涤3次，并在室温下用抗兔过氧化物酶偶联二抗(cat#1706515，Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫库莱斯)孵育1小时。使用SuperSignal™ West Femto最大灵敏度底物(cat#34094，Thermo Fisher)或Pierce ECL(cat#32106，Thermo Fisher)检测蛋白质，并使用Azure c400成像仪(Azure Biosystems，美国加利福尼亚州都柏林)成像。为检测总cofilin表达，用Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer(cat#46430，Thermo Fisher)剥离p-cofilin印迹并重新探针抗cofilin。β-肌动蛋白管家基因作为加载对照，并用一抗小鼠抗体(cat#MA1-140，Thermo Fisher)后接抗小鼠过氧化物酶偶联二抗(cat#1706516，Bio-Rad)探针。使用ImageJ软件对条带强度进行量化并归一化到β-肌动蛋白(cat#MA1-140，Thermo Fisher)。ImageJ中的矩形工具用于手动框出每个条带进行密度测定。框大小相等且不重叠，边界在泳道之间。
2.3 免疫共沉淀
Protein G Dynabeads(cat#10007D，Thermo Fisher)在PBS中与10 μg抗PIST抗体(cat#sc393026，Santa Cruz，美国德克萨斯州达拉斯)或抗beclin-1抗体(cat#sc-48341，Santa Cruz)在4°C下轻轻旋转孵育过夜。抗体-珠复合物使用2 mM DSS(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；Thermo Fisher)在PBS中在室温下交联30分钟。用50 mM Tris–HCl(pH 7.5)淬灭反应15分钟。珠子用Pierce IP裂解缓冲液(cat#87787，Thermo Fisher)洗涤3次以去除未反应的交联剂。交联珠子在4°C下与对照海马体或AD海马体的池化裂解物(总蛋白质1,000 μg)轻轻旋转孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤后，用0.1 M甘氨酸(pH 2.8)洗脱结合的蛋白质，用1 M Tris–HCl(pH 8.0)中和，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析，使用针对PIST(GOPC，cat#12163-1-AP，Proteintech)、beclin-1(cat#66665-1-Ig，Proteintech)和GluD1(cat#13040-1-AP，Proteintech)的抗体，后接适当的HRP偶联二抗。使用Pierce ECL(cat#32106，Thermo Fisher)使蛋白质条带可视化。
2.4 实时PCR
使用RNAzol RT(cat#RN190，Molecular Research Center, Inc. 美国俄亥俄州辛辛那提)从NBB样本中提取RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher)评估RNA浓度。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(cat#K1642，Thermo Fisher)合成cDNA。使用QuantStudio 7 RT-PCR系统(Thermo Fisher)进行实时PCR，使用PowerUp SYBR Green Master Mix(cat#A25742，Thermo Fisher)。引物序列见补充表S3。使用2−ΔΔCt方法计算相对表达，归一化到ACTB(β-肌动蛋白)，统计比较采用ΔΔCt值。
2.5 统计分析
使用GraphPad Prism 8.0版(GraphPad Software Inc.，美国马萨诸塞州波士顿)或使用Prism输出在Microsoft Excel中手动计算进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验检验正态性，并使用Brown–Forsythe检验评估同方差性。满足正态性和同方差性条件的数据使用单因素方差分析与Tukey多重比较检验进行分析。不满足这些条件的数据通过非参数Kruskal–Wallis检验与Dunn多重比较检验进行分析。Eta平方(η²，Prism 8.0输出中标记为R平方)用作方差分析分析的效应大小度量。Cohen's d的绝对值(简称为d)用作Tukey多重比较检验效应大小幅度的度量。
其中M₁是第1组的均值，M₂是第2组的均值，MS残差是Prism 8.0输出提供的残差均方。作为Kruskal–Wallis检验后的效应大小度量，我们根据Kruskal-Wallis H统计量计算eta平方(ηH²)。
其中H是Prism 8.0输出提供的Kruskal–Wallis统计量，k是组数，ntotal是所有组中的总样本数。秩相关系数(r)作为Dunn多重比较检验后的效应大小呈现。
其中z是Prism 8.0输出提供的标准化z检验统计量，ntotal是被比较的两组中的总样本数。条形图显示均值±SEM。p值小于0.05被认为具有显著性。每个AD组的蛋白质和RNA表达相对于对照组的均值确定，对照组定义为等于1。
3 结果
3.1 AD海马体中跨突触复合物组分的蛋白水平降低
为检查AD患者海马体中跨突触复合物组分是否受到破坏，我们首先检查了GBB样本集中Cbln1/2和GluD1/2的蛋白水平。实验组对海马体Cbln1蛋白水平的影响显著(p=0.0001，η²=0.839)，但对Cbln2则未观察到(p=0.4242，η²=0.158)。与BB0/1对照样本相比，AD海马体中BB2(p=0.0005，d=4.38)和BB5/6(p=0.0001，d=4.33)的Cbln1显著降低(图1A)。相比之下，AD海马体中BB2(p=0.8747，d=0.36)或BB5/6(p=0.3947，d=0.86)的Cbln2与对照相比无显著差异，但随着Braak分期增加呈下降趋势(图1B)。我们观察到实验组对GluD1(p=0.0026，η²=0.697)和GluD2(p=0.0224，η²=0.613)蛋白水平的影响显著。GluD1在BB2 AD海马体中相对于对照降低(p=0.0101，d=2.72)和BB5/6 AD海马体(p=0.0023，d=3.42)，但相对于对照在BB5/6 AD海马体中未降低(p=0.5284，d=0.70，图1C)。GluD2在BB2(p=0.0340，d=2.38)和BB5/6(p=0.0426，d=2.10)AD海马体中相对于对照显著降低(图1D)。这些结果支持AD中跨突触复合物组分的蛋白水平降低。
3.2 AD海马体中自噬关键介质表达降低
然后，我们检查了GBB样本集中PIST和beclin-1的蛋白表达。这些蛋白质是自噬的调节因子，据报道在GluD1/2下游发挥作用(Yue等，2002；Narasimhan等，2025)。值得注意的是，GluD1(海马体中的主要GluD)已在小鼠中被发现与PIST相互作用(Narasimhan等，2025)。实验组对海马体PIST(p=0.0047，η²=0.738)和beclin-1(p=0.0127，η²=0.583)蛋白水平的影响显著。我们发现与对照相比，BB5/6 AD海马体中PIST显著降低(p=0.0039，d=3.33)，但BB2中未降低(p=0.2992，d=1.22，图2A)。与对照相比，BB2 AD海马体(p=0.0443，d=2.06)和BB5/6 AD海马体(p=0.0161，d=2.17)中beclin-1蛋白显著降低(图2B)。这些结果支持AD海马体中自噬关键调节因子的降低。
3.3 对照和AD海马体中GluD1与PIST的相互作用
据报道GluD1和PIST在小鼠中存在相互作用(Yue等，2002；Narasimhan等，2025)，但据我们所知，这尚未在人类神经元或海马体中进行研究。因此，我们进行了免疫共沉淀实验，使用池化的人类海马体组织来检查GluD1和PIST之间以及PIST和beclin-1之间的相互作用。我们检测到GluD1和PIST之间的相互作用(图2C)。此外，beclin-1在抗PIST抗体的免疫沉淀(IP)后被检测到(图2D)，反之亦然(图2E)。这种GluD1-PIST-beclin-1的相互作用轴表明，在正常生理条件下和AD病理条件下，人类海马体中GluD1利用的跨突触复合物可能调节自噬。
3.4 AD海马体中突触可塑性标志物BDNF降低
脑源性神经营养因子(BDNF)是突触可塑性的重要参与者，可以调节配体门控离子通道的丰度和功能，并调节神经元兴奋性(Wan等，2024；Caldeira等，2007)。在AD患者中，脑和血清BDNF降低与更快的认知能力下降相关(Laske等，2011；Buchman等，2016)。在小鼠中，运动诱导的学习和记忆改善被证明是由BDNF和海马体中自噬之间的双向正反馈介导的(Khoury等，2023)。使用GBB样本集，我们发现实验组对海马体BDNF蛋白水平的影响显著(p=0.0201，η²=0.542)。与对照相比，我们在BB5/6 AD海马体中观察到BDNF降低(p=0.0170，d=2.15)，但在BB2 AD海马体中未达到显著性(p=0.1705，d=1.44，图3)。这支持了AD病例中BDNF依赖性调节海马体突触可塑性和自噬的进行性缺陷。
3.5 AD海马体中cofilin磷酸化的失调
Cofilin是肌动蛋白动力学的调节因子，可解聚肌动蛋白丝，cofilin磷酸化的活性调节影响AMPA受体的交通，使其对突触可塑性很重要(Gu等，2010；Sumi等，1999)。GluD1敲除小鼠具有降低的p-cofilin水平和改变的NMDA亚基比率，将GluD1信号传导与cofilin和可塑性的调节联系起来(Gupta等，2015)。Cofilin的过度去磷酸化已被发现破坏微管动力学以及导致胎儿大鼠脑神经元培养物中形成破坏性的cofilin-actin杆状结构，且cofilin聚集物与人死后海马体切片中的Aβ斑块共定位(Minamide等，2000)。Cofilin-actin杆状结构的形成也被人类Aβ1-42合成寡聚体在培养的海马体神经元和大鼠脑切片中诱导(Davis等，2011)。在培养的大鼠海马体神经元中，cofilin-actin杆状结构的形成被发现阻断细胞内交通并导致突触丧失(Cichon等，2012)。有趣的是，用组成型去磷酸化(活性)cofilin通过AAV9转导的Tau-P301S;cofilin+/−小鼠中海马体tau病理增加，但用磷酸化模拟(非活性)cofilin则无此现象(Woo等，2019)。最后，在人肺内皮细胞中的工作发现beclin-1也促进cofilin磷酸化，将自噬和cofilin调节联系起来(Leonard等，2019)。
鉴于cofilin动力学与GluD1、自噬、可塑性和AD病理的联系，我们检查了总cofilin和磷酸化cofilin(p-cofilin)水平(图4)。我们观察到实验组对海马体p-cofilin与cofilin比率的影响显著(p=0.0052，η²=0.731)。BB5/6 AD海马体样本与对照相比显示出显著降低的p-cofilin/cofilin比率(p=0.0042，d=3.27)，而BB2 AD海马体显示出降低的趋势但不显著(p=0.2775，d=1.27，图4)。因此，跨突触复合物、自噬和可塑性通路(图1-3)的观察到的变化与cofilin磷酸化缺陷相关。
3.6 AD海马体中GluD2 mRNA在晚期Braak分期下调
最后，使用来自NIH神经生物库的样本，我们比较了对照海马体(n=5)与BB2(n=9)或BB5/6(n=9)AD海马体中跨突触复合物组分的mRNA水平(图5)。目标包括NRXN1/2、CBLN1/2和GRID1/2 (GluD1/2)，以及编码neuroligin-1的NLGN1，它形成与Nrxn1α的替代跨突触复合物，以及编码星形胶质细胞分泌蛋白hevin的SPARCL1，它桥接并调节Nrxn1α-neuroligin相互作用。
实验组对海马体mRNA表达的影响在NRXN1(p=0.0509，η²=0.258)、NRXN2(p=0.7091，η²=0.034)、CBLN1(p=0.7507，η²=0.028)或CBLN2(p=0.959，η²=0.004)中均不显著。一致地，与对照相比，AD海马体中BB2或BB5/6的NRXN1(p=0.9250，d=0.21和p=0.0888，d=1.25，图5A)、NRXN2(p=0.7314，d=0.42和p=0.7335，d=0.42，图5B)、CBLN1(p=0.7561，d=0.40和p=0.7892，d=0.37，图5C)或CBLN2(p=0.9549，d=0.16和p=0.9811，d=0.10，图5D)的mRNA均无显著变化。我们观察到实验组对海马体mRNA表达的影响在GRID1(p=0.0249，η²=0.309)和GRID2(p=0.0069，η²=0.392)中显著。与BB2 AD海马体相比，BB5/6 AD海马体中GRID1 mRNA显著增加(p=0.0192，d=1.41)，但与对照相比，BB2 AD海马体(p=0.5088，d=0.63)或BB5/6 AD海马体(p=0.3620，d=0.78)中无差异(图5E)。相比之下，与对照和BB2 AD海马体相比，BB5/6 AD海马体中GRID2 mRNA显著下调(p=0.0237，d=1.61和p=0.0133，d=1.49)，而对照与BB2 AD海马体之间无差异(p=0.9730，d=0.12，图5F)。实验组对NLGN1 mRNA的影响不显著(p=0.6957，η²=0.036)，与对照相比，BB2(p=0.9822，d=0.10)或BB5/6(p=0.7313，d=0.42)AD海马体中NLGN1 mRNA均无显著变化(图5G)。最后，不同实验组之间SPARCL1 mRNA表达无显著差异(p<0.0729，ηH²=0.16)。与对照相比，BB5/6 AD海马体(p=0.768，r=0.60)或BB2 AD海马体(p=0.2058，r=0.49)中SPARCL1无显著差异，但呈下降趋势(图5H)。这些结果与蛋白表达分析相结合，支持一个模型，其中AD中海马体小脑蛋白水平的降低可能是由蛋白水平相互作用引起的，而海马体δ类谷氨酸受体的变化可能反映蛋白水平相互作用和转录调控。
4 讨论
在这项工作中，我们分析了来自Garrison脑库和NIH神经生物库的海马体组织，以比较AD患者(BB2和BB5/6)和非AD对照个体之间跨突触复合物以及与自噬和神经可塑性相关的蛋白质的蛋白和mRNA表达。我们的蛋白结果表明，参与突触完整性、自噬和神经可塑性的重要蛋白质的稳态在AD中受到破坏。此外，cofilin磷酸化的紊乱可能反映神经可塑性和功能性自噬所需的细胞内交通受损。
我们的数据提供了原理证明，即跨突触复合物的失调在人类AD海马体中被观察到。我们发现跨突触复合物蛋白和其他直接或间接调节神经可塑性和自噬的蛋白表达降低，但目前尚不清楚这种破坏是AD病理的原因还是结果。
我们的结果与之前关于AD的研究一致，包括BDNF降低(Buchman等，2016)、Beclin-1降低(Pickford等，2008)以及AD中p-cofilin降低(Bamburg等，2010)，证实了我们人类组织样本分析的有效性。据我们所知，这是首次报道AD海马体组织中跨突触复合物组分缺乏的研究。AD中PIST的下调以及人类海马体中PIST和GluD1的共沉淀，表明跨突触复合物可能调节海马体自噬，也是我们工作中的新发现，尽管需要额外研究来阐明调控关系。
与我们的蛋白结果相比，我们的qPCR实验显示编码跨突触复合物组分的mRNA变化很少。虽然AD中Aβ和ptau的清除不足会在降解其他蛋白质时造成瓶颈(Thibaudeau等，2018；Drummond等，2020)，但突触蛋白在AD中通常因可溶性Aβ寡聚体诱导的突触变性或受损交通而减少(Wilcox等，2011；Perdigao等，2020；Zhu等，2026)。这些现象，加上蛋白和mRNA水平之间的相对差异，支持一个模型，其中跨突触复合物蛋白的丧失主要由蛋白病变驱动，而不是mRNA下调。
病理性突触丧失是AD的一个特征，与认知能力下降强烈相关(Mecca等，2022；Long和Holtzman，2019)。Cbln1蛋白具有突触生成活性(Yuzaki，2011)，因此，我们发现与对照相比，AD患者的海马体缺乏Cbln1以及GluD1/2。这表明增强Cbln或GluD跨突触复合物组分可能抵消AD中的突触丧失。虽然我们没有以细胞类型特异性方式检查Cbln1/2或GluD1/2的表达，但几乎没有证据表明它们在胶质细胞类型中表达。观察到的蛋白水平降低因此可能是神经元效应。在研究的跨突触复合物组分中，最大的缺陷在Cbln1和GluD2中观察到，表明恢复这些蛋白水平的干预可能最有益。
证据表明，使用Cbln1或含有Cbln1和五聚素-1(CPTX)部分的融合蛋白来加强跨突触连接的干预，在各种疾病模型中可能有益地调节AMPA受体水平(Suzuki等，2020；Narasimhan等，2025)。GluD1不仅参与海马体中的突触形成和维持，而且对于需要Cbln2存在的兴奋性突触传递也是必不可少的(Tao等，2018)。在5xFAD AD小鼠模型中，CPTX融合蛋白增加了EPSC的频率和振幅，并在CA1 Schaffer侧支中挽救了长期增强作用(LTP)(Suzuki等，2020)。有趣的是，CPTX导致野生型小鼠突触中AMPA受体积累，但在5xFAD小鼠中似乎降低了AMPA受体积累。此外，重组Cbln1通过下调AMPA受体减轻了啮齿动物疼痛模型中杏仁核神经元的高兴奋性(Narasimhan等，2025)。需要更好地了解Cbln1对AMPA受体和兴奋性的调节和作用在AD不同阶段的临床前模型和人类大脑中。这些是需要进行的关键调查，因为神经元高兴奋性和兴奋毒性可能有助于AD发病根源和早期AD传播中的神经元应激，而在晚期AD中这种模式反转并观察到低兴奋性(Targa Dias Anastacio等，2022；Liu等，2019；Decourt等，2022)。
GluD1在海马体中比GluD2更丰富(Nakamoto等，2020)，它们在突触形成和稳定方面表现出重叠功能(Lemoine等，2020；Ryu等，2012)。这引发了一个问题：GluD2缺乏是否可能在GluD1缺乏的情况下单独引起生物学上相关的病理。虽然我们找不到海马体中靶向GluD2敲除的报告，但海马体中GluD2特异性效应是可能的。具体来说，最近报道称GluD2在生理温度(37°C)下对D-丝氨酸和GABA表现出离子型反应，但在室温(22°C)下没有。相比之下，GluD1在37°C下对这些配体缺乏类似的反应(Vinnakota和Kumar，2026)。这种差异表明，即使存在正常水平的GluD1，海马体中GluD2的丧失也可能产生生理效应。
有趣的是，我们观察到GluD1的双相变化，在BB2 AD海马体中减少，在BB5/6 AD海马体中恢复。原因尚不清楚，但据报道，GluD1通过与mGlu5的相互作用通过AMPA受体的内化在海马体长期抑郁中发挥重要作用(Suryavanshi等，2016)。我们推测，早期AD中GluD1的减少会加剧海马体高兴奋性，而其在晚期AD中的增加可能是突触后神经元为抵消这些变化而产生的补偿反应。
自噬通路的失调(已知在AD病理中发挥作用)(Zhang等，2024)与我们的研究中Cbln和GluD缺乏相关。我们的免疫共沉淀结果显示，跨突触复合物机制(GluD1)可以与自噬激活剂(PIST)相互作用。然而，自噬是由多种类型变化触发的多功能细胞过程，而AD是一种高度多因素的疾病。需要进一步工作来评估AD中自噬下调在多大程度上由跨突触复合物信号传导缺陷驱动，而不是自噬的其他效应因子，以及自噬失调如何反过来影响突触功能和神经可塑性。
这项工作有一些局限性需要注意。首先，由于这项工作涉及死后人类组织，无法确定跨突触复合物的丧失是AD进展的原因还是结果。同样，我们只能识别分子联系，但不能确定跨突触复合物丧失与自噬和神经可塑性标志物改变之间的因果关系。最后，GBB的标本仅来自女性患者，我们只有三个早期AD标本。因此，需要进行更大的后续研究来确认我们的发现，并确定它们是否反映了男性患者中AD的进展。尽管如此，目前的研究确定了AD脑中新的分子差异，为更好地了解AD发病机制和早期进展的机制研究提供了理由，并评估可能基于跨突触复合物的神经营养效应和减缓疾病进展的救援范式。
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