单核细胞-内皮细胞相互作用作为克隆性造血介导的心血管疾病的可靶向节点 - AI与医疗健康

摘要

背景

克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）增加了心血管疾病的风险，但其驱动这一关联的分子机制尚未完全阐明。我们假设异常的单核细胞-内皮细胞相互作用促进了CHIP介导的心血管疾病。

方法

我们对4名TET2 CHIP个体、6名DNMT3A CHIP个体和25名对照个体的血液和外周血管组织进行了单细胞RNA测序。基于配体-受体对的表达情况，我们预测了单核细胞和内皮细胞之间的相互作用，然后在体外模拟携带CHIP突变的单核细胞与内皮细胞的相互作用。我们进行了计算机全基因组扰动筛选，以识别能够调节这些相互作用的遗传靶点，然后通过体外实验评估抑制预测靶点对单核细胞-内皮细胞相互作用的影响。

结果

CHIP患者与非CHIP患者的单核细胞和内皮细胞上配体-受体对的表达突显了6个与跨内皮迁移相关的关键配体-受体对信号传导可能性的差异。单核细胞与人主动脉内皮细胞的共培养表明，携带CHIP突变的单核细胞与不携带CHIP突变的单核细胞相比，其迁移速度降低。扰动筛选表明有11个可靶向的遗传靶点能够挽救TET2 CHIP单核细胞。体外实验中，抑制内皮细胞中的ICAM1和单核细胞中的CXCR2显著增加了TET2突变单核细胞在内皮细胞上的迁移速度。

结论

CHIP突变改变了单核细胞和内皮细胞之间的相互作用。靶向CXCR2和ICAM1的治疗可能恢复TET2 CHIP患者中单核细胞与内皮细胞之间的正常相互作用。

图形摘要

引言

克隆性造血（CHIP）的特征是造血干细胞获得体细胞突变。CHIP与不良心血管结局相关，包括冠状动脉疾病、心力衰竭和外周血管疾病。CHIP独立于糖尿病等已知风险因素增加心血管疾病（CVD）的风险。CHIP的小鼠模型表明，携带TET2和DNMT3A突变的造血细胞足以诱导血管疾病。然而，血液细胞中的突变如何导致人类患者血管疾病的机制尚未完全理解。

人类血管难以研究，因为大多数血管组织无法从活体患者中轻松取样。然而，脂肪组织是一种高度血管化的组织，可以从活体患者中轻松取样。我们同时从糖尿病患者身上采集了外周血和脂肪组织，然后进行靶向DNA测序以确定CHIP状态。利用单细胞RNA测序和配体-受体相互作用的知识，我们基于CHIP状态预测了单核细胞和内皮细胞之间相互作用的可能性。我们识别了CHIP患者单核细胞-内皮细胞相互作用的突变特异性改变，并寻求通过遗传靶点的扰动来减轻这些影响。我们的发现为CHIP对单核细胞和内皮细胞之间相互作用的影响提供了新的见解，并提出了可能影响CHIP患者血管疾病风险的治疗策略。

方法

外周血单核细胞和脂肪组织样本采集

本研究的患者样本通过范德堡大学医学中心的HIV、脂肪组织免疫学和代谢（HATIM）研究（NCT04451980）和克隆性造血与血管炎症（CHIVE）队列招募。该研究获得了范德堡大学医学中心机构审查委员会（编号：210022和201583）的批准，所有研究参与者在样本采集前均提供了知情同意。

所有研究参与者在样本采集时均患有糖尿病。HATIM队列的参与者提供了外周血和脂肪组织样本，如原始出版物所述。CHIVE队列的参与者仅提供了外周血样本，如原始出版物所述。

CHIP状态确定

CHIP状态使用已建立的靶向测序方法确定。简而言之，使用Qiagen Mini试剂盒（Cat #27104）按照标准程序从全血中提取DNA。在Illumina Novaseq 6000上使用定制基因面板进行测序，该面板设计用于靶向CHIP驱动基因，读深度为600倍。使用Mutect2-GATK识别潜在的体细胞突变。总读深度低（<100）、变异等位基因读深度低（<3）和/或变异等位基因分数低于CHIP阈值（<2%）的变异被剔除。

外周血单核细胞的单细胞RNA测序

将冷冻保存的PBMC在37°C下解冻，然后用完全RPMI（RPMI（Corning，#10-040-CV）+ 10% FBS + 1% PS，cRPMI）洗涤以去除冷冻介质。将每个样本的500,000个细胞与磷酸盐缓冲盐水一起铺板，并在37°C和5% CO2条件下孵育4.5小时。然后将细胞与独特的哈希标签抗体寡核苷酸偶联物（HTOs）一起孵育30分钟（Biolegend，TotalSeq-B）。使用10X Chromium 3'文库制备试剂盒（10X Genomics）制备样本，并立即在10X Chromium控制器上运行以创建scRNAseq文库。为确保捕获足够数量的髓系细胞以进行充分有力的比较，我们对部分样本在测序前富集了CD14+细胞。这是使用EasySep人类单核细胞分离试剂盒（StemCell Technologies，#19059）完成的。

在范德堡高级基因组技术核心的Illumina Novaseq6000上进行下一代测序，输出使用10X Genomics的标准CellRanger流程进行处理。后续分析在Terra.bio上进行。

单细胞RNA测序数据处理

使用R16（v4.4.0）包SoupX17（v1.6.2）去除环境RNA。进一步分析主要使用R包Seurat18（v4.4.0）进行。去除线粒体读数大于25%、总转录本少于800个或基因少于200个的细胞。使用R包DoubletFinder19（v2.0.3）识别双细胞。去除双细胞和缺乏哈希标签寡核苷酸的细胞。还去除了来自线粒体和核糖体基因的读数。使用Seurat函数NormalizeData()对基因计数进行归一化，然后使用FindVariableFeatures()（nFeatures = 3000）进行分析。使用ScaleData()函数对计数进行缩放，并使用RunPCA()和RunUMAP()函数（dims = 1:15）进行降维。使用R包harmony20（0.1.1）校正批次效应，并使用Seurat函数FindNeighbors()和FindClusters()进行聚类。使用scType21（v1.0）进行细胞类型注释。

单细胞RNA测序数据的差异表达

单细胞RNA测序分析因高稀疏性而变得复杂。为解决此问题，我们使用了元细胞（metacells）方法，其中将转录相似的细胞折叠成单个测量值。使用Python22（v3.10.11）包Metacell-223（v0.8.0）确定元细胞分配。在85%的元细胞中至少有10个转录本的基因被考虑用于后续分析。使用R包DESeq224（v1.40.2）中的负二项Wald检验和Benjamini Hochberg p值调整计算差异表达。将年龄、性别和BMI作为协变量。

单核细胞-内皮细胞信号传导预测

使用R包CellChat25（v1.6.1）使用标准方法预测细胞信号传导。通过将经典单核细胞和内皮细胞分类为源细胞和靶细胞，并根据突变特异性CHIP状态分层，确定单核细胞-内皮信号传导。使用Wilcoxon符号秩检验评估统计显著性。

单核细胞-内皮细胞共培养和运动分析

我们使用CRISPR将TET2、DNMT3A或AAVS1（对照）突变引入造血干细胞。通过在CD34扩增培养基中培养7天，然后在含有IMDM + 20% FBS + 0.5% P/S和以下重组人细胞因子（Gibco）的单核细胞分化培养基中培养7天，将细胞向单核细胞谱系分化：SCF（#300-07-10UG）25 ng/mL，IL-3（#200-03-10UG）30 ng/mL，FLT3-L（#300-19-10UG）30 ng/mL，以及M-CSF（300-25-10UG）60 ng/mL。同时，将人主动脉内皮细胞（Lonza，#CC-2535）在12孔玻璃底板（MatTek，#P12G-1.5-14-F）上培养至融合，该板预先用纤连蛋白（Corning，#356008）处理，使用血管细胞基础培养基（ATCC，#PCS-100-030），包括20% FBS和EGM-2 SingleQuots（Lonza，#CC-4176）。计数单核细胞并转移到含有内皮细胞的12孔板中。在范德堡细胞成像共享资源中心使用Zeiss LSM 880进行成像，孵育器设置为37°C，5% CO2。每5分钟拍摄一次图像，持续30分钟。

成像后，使用TrackMate26通过Fiji27跟踪单核细胞运动。细胞检测使用LoG检测器进行，估计物体直径为15微米。初始阈值化去除了低置信度调用的对象。未对ch1的平均强度或ch1的对比度设置过滤器。使用Simple LAP跟踪器进行跟踪。链接最大距离设置为50微米，间隙闭合最大距离设置为50微米，间隙闭合最大帧间隙设置为1。未对轨迹中的观察次数设置过滤器。量化并比较各组之间的平均速度。使用双样本T检验计算统计显著性。

使用单细胞基础模型Geneformer-30M进行计算机扰动分析

我们使用Geneformer预测了可能将CHIP单核细胞转变为对照状态的遗传扰动，Geneformer是一个在约3000万个细胞的单细胞RNA测序数据上训练的基础模型。使用先前发表的scRNAseq数据中高VAF CHIP患者的经典单核细胞，我们对预训练的Geneformer-30M模型进行微调，以区分有和没有TET2和DNMT3A CHIP的人的单核细胞。通过使用预训练的Geneformer权重初始化模型并添加最终的分类特定转换器层来实现Geneformer的微调。使用Geneformer-30M Hugging Face模型的默认超参数值进行微调。我们通过基于五折交叉验证策略计算分类器的准确性和宏观F1来评估性能，其中80%的细胞用于训练，20%的细胞用于测试，重复五次。我们提取了微调分类器的倒数第二层，并使用UMAP降维可视化这些嵌入。使用能够区分TET2和对照细胞（或DNMT3A和对照细胞）的微调分类器，我们进行了计算机扰动，以预测基因敲除对细胞状态的影响。Geneformer-30M模型和微调脚本可在HuggingFace上获取，用于构建分类器（classifier.py）和计算机扰动（in_silico_perturber.py和in_silico_perturber_stats.py）。

由CellChat和Geneformer都预测的基因被优先用于体外验证。根据药物的可用性，选择抑制剂来靶向在单核细胞上表达的受体或在内皮细胞上表达的受体。对于涉及单核细胞药物扰动的实验，细胞在第6天重新铺板在含有1 uM、2 uM、5 uM或10 uM MCE的AZD5069的单核细胞分化培养基中，并培养24小时。对于涉及内皮细胞药物扰动的实验，在共培养前24小时将药物添加到内皮细胞中，浓度为0.1 nM、1 nM、2 nM、5 nM的MCE的lifitegrast sodium（SAR1118）。按照上述方法进行单核细胞速度的成像和分析。

可视化

使用R包ggplot229（v3.4.4）和Python包seaborn30（0.13.2）完成数据可视化。使用BioRender.com准备示意图。

代码可用性

代码将在出版后在

数据可用性

scRNAseq数据将在出版后在

结果

我们对19个外周血单核细胞（PBMC）样本和31个脂肪组织样本进行了单细胞RNA测序（scRNAseq），这些样本来自糖尿病患者。血液样本来自5名DNMT3A CHIP患者、3名TET2 CHIP患者和11名对照（表1），过滤低质量细胞后共获得51,254个细胞。我们平均每细胞获得3,482个读数和1,584个基因。脂肪组织样本来自5名DNMT3A CHIP患者、3名TET2 CHIP患者和23名对照（表2），过滤低质量细胞后共获得93,975个细胞。我们平均每细胞获得2,972个读数和1,292个基因。我们在PBMC和脂肪组织样本中捕获了预期比例的细胞类型（图1a，图1b）。

TET2和DNMT3A突变的单核细胞在内皮细胞上的运动减少

由于血液中的CHIP突变优先分化为单核细胞，我们接下来专注于在糖尿病背景下表征CHIP中单核细胞和内皮细胞之间的相互作用。我们使用CellChat基于配体-受体对的表达情况，从人类患者队列的单细胞RNA测序数据中预测单核细胞和脂肪组织内皮细胞之间相互作用的可能性。我们发现了几种与单核细胞跨内皮迁移相关的突变特异性信号传导差异（图2a，图S6，表S1-2）。值得注意的是，与对照相比，DNMT3A CHIP中的ITGB2和ICAM信号显著增加（p值< 0.05），而TET2 CHIP中的CXCL信号显著增加（p值< 0.05）。

我们假设这些单核细胞-内皮信号传导的差异可能与物理相互作用的差异相关。我们设计了一个体外实验，以量化携带CHIP突变的单核细胞与对照单核细胞相比，在血管内皮细胞层上单核细胞运动速度的差异（图2b）。我们发现，与对照相比，TET2突变（p值= 2.6×10^-5）和DNMT3A突变（p值= 2.2×10^-3）单核细胞在内皮细胞上的运动速度显著降低（图2c，表S3-4）。

计算机药物筛选确定可恢复TET2 CHIP单核细胞-内皮细胞相互作用的药物扰动

我们寻求恢复CHIP单核细胞和内皮细胞之间的正常相互作用。为了优先考虑TET2 CHIP的候选药物，我们转向单细胞基础模型Geneformer。凭借从3000万个细胞的单细胞RNA测序数据预训练中获得的上下文知识，Geneformer优先考虑在确定细胞状态中起关键作用的基因。我们发现，来自TET2 CHIP患者和对照的CD14+单核细胞使用基于RNA的传统嵌入无法区分（图3a），但Geneformer能够清楚地区分这两组（图3b，图S1）。然后我们进行了计算机扰动，并使用Geneformer预测细胞状态的变化。Geneformer建议了11个可靶向的遗传目标，可能将TET2 CHIP单核细胞转变为对照状态（表S5）。

我们将这些预测与CellChat识别的配体-受体对进行了比较（图3c）。这两种正交方法提名了两个配体-受体对候选：ITGB2-ICAM1和CXCL2/CXCL3-CXCR2。虽然TET2单核细胞中ITGB2的表达低于对照（图3d），但其结合伙伴ICAM1的计算机敲除被预测可将TET2单核细胞转变为对照状态。与对照相比，TET2单核细胞中CXCL2和CXCL3的表达较高（图3e），但表达水平未达到差异表达评估的阈值。然而，Geneformer的计算机扰动预测抑制CXCL2和CXCL3将恢复TET2 CHIP单核细胞的转录谱，使其与对照单核细胞相似。

我们在体外测试了抑制这些相互作用对单核细胞在内皮细胞上运动的影响。我们选择靶向在内皮细胞上表达的ICAM1，使用lifitegrast sodium（SAR1118）。在与单核细胞共培养前24小时用这种ICAM1抑制剂培养内皮细胞，与用DMSO培养的TET2突变单核细胞相比，2nM浓度下增加了TET2突变单核细胞的运动（图4a，表S1；p值= 1.2×10^-2）。当两者用相同药物和浓度处理时，TET2突变单核细胞速度显著低于对照单核细胞速度，DMSO处理（p值= 2.6×10^-5）、0.1nM SAR1118处理（p值= 1.7×10^-5）和1nM SAR1118处理（p值= 2.6×10^-2）；但当用2nM SAR1118处理时，TET2突变单核细胞和对照单核细胞之间的速度没有统计学显著差异（p值= 0.83），这表明药物治疗对TET2突变单核细胞具有特异性。

我们还选择靶向在单核细胞上表达的CXCR2，使用AZD5069。在与内皮细胞共培养前24小时用这种CXCR2抑制剂培养单核细胞，与用DMSO培养的TET2突变单核细胞相比，2uM、5uM和10uM浓度下增加了TET2突变单核细胞的速度（图4b，表S1；p值= 6.5×10^-4，2.6×10^-7，4.7×10^-10）。当两者用相同药物和浓度处理时，TET2突变单核细胞速度显著低于对照单核细胞速度，DMSO处理（p值= 2.8×10^-6）、1uM AZD5069处理（p值= 1.4×10^-5）和5uM AZD5069处理（p值= 6.1×10^-3）；但当用2uM AZD5069（p值= 5.3×10^-2）和10uM AZD5069（p值= 0.32）处理时，TET2突变单核细胞和对照单核细胞之间的速度没有统计学显著差异，这再次表明药物治疗对TET2突变单核细胞具有特异性。

讨论

在这里，我们进行了首次针对人类CHIP的多组织单细胞RNA测序分析，使用了来自糖尿病患者的外周血和脂肪组织样本。我们基于配体-受体对的表达，确定了TET2和DNMT3A CHIP中单核细胞和内皮细胞之间相互作用可能性的增加。我们证明了携带CHIP突变的单核细胞在内皮细胞上的运动速度降低，与不携带CHIP突变的单核细胞相比。我们使用单细胞基础模型进行全基因组计算机扰动筛选，并确定了能够减轻TET2突变对单核细胞-内皮细胞相互作用影响的药理扰动。这些发现允许得出几个结论。

首先，我们证明了在CHIP中，单核细胞和内皮细胞的相互作用以突变特异性方式改变。先前的研究已经调查了CHIP突变单核细胞和内皮细胞在小鼠模型和癌细胞系中的相互作用，但这是首次在人类患者样本中证明这种效应的研究。此外，先前的工作仅限于DNMT3A突变细胞。在这里，我们表明TET2突变也改变了单核细胞-内皮相互作用，影响了单核细胞在内皮细胞上的运动速度。单核细胞在内皮细胞上速度的降低可能会增加CHIP突变单核细胞穿过内皮屏障的可能性。我们发现，虽然两种基因型都降低了单核细胞在内皮细胞上的运动速度，但粘附增加的机制可能是突变特异性的。我们发现DNMT3A CHIP中ITGB2-ICAM1信号增加，而TET2 CHIP中CXCL2/CXCL3-CXCR2信号增加。这些差异可能解释了TET2和DNMT3A CHIP中观察到的血管疾病风险的变异性。

其次，我们首次证明单细胞基础模型能够识别挽救体外表型的药理靶点。正如单细胞基础模型Geneformer所预测的那样，我们发现抑制内皮细胞中的ICAM1和单核细胞中的CXCR2在TET2 CHIP的体外模型中挽救了单核细胞在内皮细胞上的运动。虽然传统的单细胞RNA测序分析方法并未在TET2 CHIP中聚焦于ICAM1和CXCR2，但Geneformer预测这两种治疗都将是有效的。通过体外实验，我们发现两种药物都增加了TET2突变单核细胞在内皮细胞上的速度。这些发现与开发突变特异性治疗以解决CHIP相关心血管疾病风险增加相关。值得注意的是，这组实验据我们所知是首次使用AI基础模型来识别和实验验证血管疾病靶点。因此，本研究提供了我们认为将加速心血管医学治疗发现率的范式转变的早期例子。

总体而言，通过整合外周血和脂肪组织的单细胞分析、计算机扰动和体外验证实验，我们确定了突变血细胞可能对CHIP患者血管疾病风险产生贡献的机制。

致谢

本研究由以下机构资助：K23DK135414（SSB，JRK），Doris Duke CSDA 2021193（CNW），K23 HL156759（CNW），Burroughs Wellcome Fund 1021480（CNW），R01 DK112262（JRK），田纳西艾滋病研究中心拨款P30 AI110527（补充CNW，JK），范德堡英格拉姆癌症中心支持的范德堡流式细胞术共享资源（P30 CA068485）。本工作还得到了NIH拨款DP5 OD029586、R01 AG088657、R01 AG083736、Burroughs Wellcome Fund医学科学家职业奖、E.P. Evans基金会、Pew-Stewart癌症研究学者奖（由Pew慈善信托基金和Alexander and Margaret Stewart信托支持）、Hevolution/AFAR衰老生物学和老年科学新研究者奖（AGB）的支持。ACP和JCV得到了NIH培训拨款T32 GM145734-01的支持。YP和HKG得到了NIH培训拨款T32 GM007347的支持。

成像通过范德堡细胞成像共享资源进行（由NIH拨款CA68485、DK20593、DK58404、DK59637、EY08126、S10 OD021630和S10 RR027396支持）。