摘要
阿尔茨海默病（AD）是一种影响全球数百万人的神经退行性疾病。由于神经组织难以获取，定义早期病理生物学事件仍然具有挑战性。由于嗅觉神经元是可及的，且嗅觉丧失在AD中普遍存在，我们评估了来自对照者、脑脊液（CSF）生物标志物确认的AD患者以及认知正常但CSF生物标志物阳性提示临床前AD阶段的个体的嗅上皮刷检活检。我们通过单细胞RNA测序（n=22名受试者）显示，即使在临床前AD受试者中也能检测到保守的神经炎症T细胞、髓系细胞和嗅觉神经元变化，并通过流式细胞术证实了CD8 T细胞活化增强。嗅上皮中激活的记忆T细胞状态是临床前AD的一个标志，与晚期疾病中CSF T细胞表型平行，同时伴有小胶质细胞样炎症程序和嗅觉神经元炎症损伤的证据。总之，我们的发现建立了一个平台，允许在AD最早期阶段分析神经组织。
引言
嗅觉丧失与阿尔茨海默病（AD）的发展密切相关，但驱动AD中嗅觉丧失的机制及其与疾病进展的关系仍不清楚。嗅上皮（OE）位于上鼻腔，包含嗅觉感觉神经元（OSN），其轴突投射到嗅球中的肾小球，与僧帽/簇状细胞形成突触，这些细胞发出二级投射到初级嗅觉皮层，包括内嗅皮层的一部分——这是AD中最早受损的大脑区域之一。与AD脑实质类似，OSN已被证明会积累β-淀粉样蛋白斑块和神经原纤维tau缠结，表明OE可能忠实地反映中枢AD神经病理学。此外，由于脑脊液（CSF）的淋巴引流穿过筛板，OE可能为监测AD特有的神经炎症过程提供了一个易于获取的部位。
对嗅裂（鼻腔嗅觉感受区域）活检的组织学研究揭示了与神经退行性相关的嗅觉丧失相关的局部细胞变化。然而，这些检测大多依赖于尸体组织或晚期疾病患者的样本，早期阶段尚未得到充分探索。最近在单细胞转录组学分析和微创内镜引导细胞刷检活检方面的进展，使得在常规门诊就诊期间采集的样本中能够对局部细胞环境进行高分辨率分析，且适用于任何疾病阶段。因此，我们假设嗅觉活检将为难以获取的神经系统组织提供一个实用的替代品，有助于识别AD中的早期致病事件。
本研究根据2024年修订的阿尔茨海默病协会生物标志物诊断标准，对三个队列的OE临床刷检活检进行了分析：认知正常且CSF Aβ42/Aβ40水平正常的成人（对照）、认知异常且Aβ42/Aβ40水平异常的成人（临床AD），以及认知正常但Aβ42/Aβ40水平异常（可能进展为临床AD）的成人（临床前AD）。通过整合跨队列的神经元和免疫特征，我们识别了追踪疾病阶段的分子变化，并提供了可操作的治疗或诊断探索靶点。最终，这些发现将OE采样定位为研究AD最早、最可治疗阶段的病理生物学的实用策略。
结果
嗅裂刷检活检用于取样嗅裂细胞
嗅觉神经元的细胞体位于鼻腔上部的表面上皮中，这一区域称为嗅裂（图1A、B）。这些嗅觉感觉神经元（OSN）检测吸入的气味并投射到脑内的嗅球形成突触。因此，OE内的神经元和相关细胞可通过鼻内镜可视化，并在清醒受试者中使用小细胞刷进行活检取样（图1C，补充视频1）。活细胞悬液可用于制备单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术或其他检测。从AD患者或对照者活检中获得的scRNA-seq可视化（n=22名受试者）显示捕获了OE细胞和相关的局部免疫群体，包括T细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、支持细胞、微绒毛细胞（MV）和OSN（图1D-F，补充图1和补充数据1）。刷检活检方法可靠地获取嗅觉细胞，以及数量不等的邻近表面呼吸道上皮，允许对包含220,509个细胞的组合数据集进行下游分析，而不会受到更深层基质、血管或全身循环免疫细胞的污染。
嗅上皮在临床前AD中与CSF T细胞炎症平行
CSF是中枢神经系统抗原被外周免疫系统采样的通道。这种交换部分通过CSF经淋巴鼻咽丛（穿过OE）引流至颈深淋巴结而发生。最近，在临床AD患者中发现了在CSF中巡逻的致脑炎性CD8记忆T细胞。鉴于OE与这一CSF引流途径的直接解剖学联系，我们假设AD受试者的OE中也可能存在类似的炎性T细胞特征。为了研究这一点，我们将22个新获得的OE活检样本（对照：n=6，临床前AD：n=9，临床AD：n=7）的单细胞转录组数据与已发表的CSF数据集（对照：n=9，临床AD：n=9）进行整合，以比较AD连续谱中T细胞亚型及其功能。
传统的scRNA-seq聚类方法将细胞分配到离散类别，这可能会掩盖T细胞转录程序的连续性和重叠性。为了克服这一点，我们使用了先前发表并经实验验证的基因表达程序（GEPs），这些程序来自对38个组织700名个体170万个T细胞的共识非负矩阵分解（cNMF），将每个T细胞建模为功能和身份定义信号的混合体。将经过验证的GEPs投射到OE和CSF T细胞上之前，进行了跨队列协调和批次校正（详见方法），从而实现了20,039个CSF T细胞和10,678个OE T细胞的可重复特征描述和无人监督的跨组织比较（图2A-C，补充图2A）。
除了黏膜相关恒定T（MAIT）细胞外，OE和CSF共享相似的T细胞亚群，而OE含有更高比例的总记忆CD8 T细胞（OE=41%，CSF=21%，p<0.001），以及更低的CD4/CD8比率（OE=0.40，CSF=0.70，p<0.001），与CSF相比（补充图2B、C）。使用一个包含4个T细胞功能GEP（标记为TIMD4/TIM3、ICOS/CD38、CTLA4/CD38、OX40/EBI3；图2D）的实验验证的抗原特异性激活（ASA）阈值，我们的模型发现，在临床AD vs 对照组的CSF总记忆CD8 T细胞中，ASA阳性细胞的比例显著更高（20.3% vs 11.8%，p=0.037，图2E），并且在多个CD8记忆T细胞亚群中一致。值得注意的是，来自OE的T细胞在相同的T细胞亚群中与CSF的激活情况平行，但在更早的临床前AD阶段即可检测到与对照组的差异（13.4% vs 4.1%，p=0.017，图2E）。为了在蛋白质水平验证这些发现，我们通过流式细胞术定量了CD38+HLA-DR+CD8+T细胞（一种抗原驱动的T细胞受体（TCR）激活的既定表型），并再次发现临床前AD阶段OE CD8 T细胞中的炎症特征相比对照组增加（p=0.031，图2F，补充图2D、E）。这些发现表明，OE内的T细胞激活可能在AD早期出现，并与CSF中检测到的免疫改变平行。
髓系细胞与AD相关的OE炎症有关
OE是一个黏膜屏障，拥有密集的驻留髓系细胞群，支持神经免疫监视。在我们的数据集中，大多数OE髓系细胞簇表达嘌呤能受体P2RY13（补充图2A-D），这是一种与神经突接触/监视相关的小胶质细胞受体，支持了在嗅觉神经上皮中多个髓系细胞亚群具有神经元相互作用的潜能。与这一生物学一致，人类和动物研究已经在嗅觉黏膜中识别出专门的巨噬细胞，包括具有小胶质细胞样特征的群体。其他研究表明，髓系细胞和T细胞之间的相互作用可以促进tau相关的神经退行性变，提示OE髓系细胞群可能参与AD相关的炎症通路。因此，我们假设炎症性、神经元相互作用的髓系程序在人类OE中是可检测的。
根据这一原理，我们通过单细胞RNA-seq对整个OE髓系细胞区进行了分析，以推断共享的髓系程序及其在每个细胞中的使用情况（图3A、B，补充图3D-H）。身份和功能的GEPs来自先前发表的、经实验验证的cNMF参考数据集，包含91,523个人类髓系细胞，涵盖了在无人监督框架中学习到的小胶质细胞和炎症状态。这些参考GEPs被投射到3,528个OE髓系细胞上，并根据主导身份程序负载分配细胞身份（小胶质细胞样、巨噬细胞和树突状细胞）。各条件下每种髓系身份的基础比例相似（补充图3C）。然后，我们聚焦于四个经过验证的功能程序——补体免疫抑制、清道夫免疫抑制、全身炎症和炎症小胶质细胞——在单细胞分辨率下进行分析（图3B）。为了避免个体差异的混淆，我们在供体水平上量化了程序的阳性率。这种设计能够捕获跨手动标记细胞身份的功能状态，同时允许在临床阶段之间进行公平的供体水平比较。
在所有髓系细胞中，我们观察到临床AD中炎症小胶质细胞功能程序的明显富集。值得注意的是，这一趋势在临床前AD中方向一致，效应大小在临床疾病中增加并变得显著（图3C）。此外，受试者水平分析显示，与对照组相比，临床前AD和临床AD中人类表型基因本体术语存在显著相似性，其中许多与CSF代谢物异常和脑病变相关（图3D）。患者水平差异表达分析揭示了一组15个基因，其在临床前AD和临床AD阶段相对于对照组表达均显著增加或减少基于上面已经输出的部分，我继续翻译接下去的正文内容，并严格按照您的格式要求，以【全文结束】结尾。
（接上文翻译）
（图3E，补充数据2、3）。例如，HLA-DQA2是临床前AD和临床AD中最显著上调的基因，它位于6号染色体高度多态性的HLA II类区域——这也是AD GWAS分析所关注的区域——并编码一种肽结合分子，决定抗原呈递和下游T细胞对自身及外来抗原的反应。EGR3是一种对突触囊泡循环调节至关重要的转录因子，在临床前AD和临床AD阶段相对于对照组，其表达均显示最强下降（图3F）。总而言之，我们的数据表明，OE中的髓系细胞改变可能随着AD进展而加剧，并且至关重要的是，在无症状的临床前阶段即可检测到。
嗅觉感觉神经元在AD中表现出分子和免疫串扰变化
位于OE中的OSN，其轴突供给嗅球，在整个生命过程中通过基底干细胞和祖细胞进行替换以维持功能。因此，外周嗅觉系统持续进行着神经发生、神经元成熟、轴突生长和靶向以及突触形成，这可能使这些传入通路特别容易受到多种病理机制的影响。尸检研究表明，OE反映了中枢AD神经病理学，但尚无研究报道来自AD患者活体OE活检的scRNA-seq分析。通过分析捕获到神经元的受试者子集（n=5名临床AD；8名临床前AD；5名对照，补充数据1），我们根据代表即刻神经前体（INP）、未成熟OSN（iOSN）或成熟OSN（mOSN）的经典基因对细胞进行分类（图4A、B）。患者水平差异表达揭示了临床前AD和临床AD的OSN相对于对照组均有广泛的转录变化，其中8个基因在疾病阶段显示出平行的改变（图4C、D，补充数据4、5）。例如，AKR1B1在临床前AD和临床AD的OSN中均高于对照组，它编码醛糖还原酶——多元醇通路中消耗NADPH的第一个酶——并具有前列腺素F2α合酶活性；这两种机制都可以放大氧化和炎症信号，且醛糖还原酶活性已被证明可调节Aβ诱导的小胶质细胞激活，使得AKR1B1上调成为OE中神经免疫串扰的可能促成因素。相反，CERT1在两组AD中均最低，它编码神经酰胺转移蛋白（CERT/CERTL），将神经酰胺从内质网运输到高尔基体用于鞘磷脂合成；实验性增强CERTL可减少AD模型中的脑C16-神经酰胺、Aβ负荷和神经炎症，而人类CERT1变异会破坏神经元鞘脂稳态——这共同支持了CERT1降低可能使OSN偏向促淀粉样蛋白、促炎性神经酰胺信号传导。其他感兴趣的差异表达AD转录本包括FIBP的富集，它放大下游FGF信号级联并增强小胶质细胞激活，将其定位为AD受试者中炎症性神经元-髓系串扰的关键介质。而LBH的持续耗竭——之前在死后AD脑的海马神经元中观察到，并与β-淀粉样蛋白积累呈负相关——同样在OSN中可测量到（补充图4）。
这里识别出的强大的嗅觉T细胞和髓系炎症变化，以及实验证据表明在鼠模型中耗竭任一免疫群体可阻断tau介导的神经退行性变，表明OSN可能特别容易受到OSN与免疫细胞之间炎症相互作用的影响，甚至在临床前阶段也是如此。对OSN与髓系细胞或T细胞之间配体-受体相互作用的建模，预测了AD受试者OSN中与对照组相比存在强差异表达相互作用。例如，颗粒酶A（GZMA）等促炎信号，与AD中适应性T细胞介导的中枢神经系统病理生物学有关，在两种疾病阶段的OE样本中均可识别（图4E）。与临床AD相似，来自临床前AD受试者的OSN具有显著更高水平的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）信号——一种在APP小鼠中与Aβ斑块共定位、抑制后可减弱Aβ神经毒性、并在人类AD患者脑脊液中升高的细胞因子——几乎针对所有免疫亚群。总之，神经元和免疫细胞状态的协调变化指向临床AD和临床前AD受试者OE活检中免疫-神经元串扰的破坏。
OE模块评分提供AD相关神经免疫程序的组织水平读数
最近开发血清学检测的努力已导致FDA批准pTau217/β-淀粉样蛋白1-42血浆比率用于检测55岁以上成人的淀粉样蛋白斑块，这是该领域的一个显著进展。虽然对临床前AD诊断有希望，但目前批准的等离子体检测使用仍限于临床显性AD。这些基于血液的检测量化了病理学的生化终产物——反映淀粉样蛋白和tau蛋白积累——但对神经组织的访问有限，可能不太能够解析产生这些变化的上游细胞过程。相比之下，OE本身积累标志性AD病理学，可能揭示与淀粉样蛋白和tau蛋白沉积平行或在之前的转录程序。因此，我们询问从OE裂活检中得出的一个聚合基因模块是否可以在组织水平上总结AD相关程序，提供一个可能发生在淀粉样蛋白和tau蛋白病理学上游或与之平行的神经免疫活动的读数。
为了解决这个问题，我们接下来检查了AD相关变化是在免疫区室、神经元区室还是整个OE中最可检测。免疫区室包括T细胞、巨噬细胞和DC，而神经元/支持区室包括神经元、支持细胞和微绒毛细胞（图5A）。接下来，我们对每个区室进行了受试者水平伪批量差异表达分析，比较临床前AD或临床AD与对照组，并按细胞区室可视化受试者之间的基因表达，包括额外临床数据，如通过宾夕法尼亚大学嗅觉识别测试（UPSIT）评分和ApoE等位基因状态测量的嗅觉功能（图5B）。我们发现，使用嗅觉区室或免疫区室的Z评分均能产生对照组与临床前AD或临床AD组之间的显著差异（图5C，补充数据6、7）。此外，组合（即免疫和神经元）OE模块在区分临床AD和临床前AD时，AUC为0.81（95% CI：0.68-0.94）（图5D）。该模块与CSF Aβ42/Aβ40比率显著相关（R=-0.57，p=0.018），但与CSF p-Tau-181或MoCA评分无关，表明这些基因可能反映与认知状态无关的、与淀粉样蛋白相关的早期OE分子变化（图5E）。综上所述，这些结果表明嗅觉裂活检捕获了协调的AD相关神经元和免疫转录变化，为在可及的人体组织中研究早期疾病机制提供了一个框架。
讨论
AD研究因无法对活体脑组织进行采样而受阻，然而OE拥有初级感觉神经元和广泛的免疫环境，可能为了解中枢神经生物学提供窗口。通过生成22名活体受试者（涵盖对照、临床前AD和临床显性AD）嗅觉裂刷检活检的单细胞转录组图谱，我们揭示了与疾病相关的连续变化，这些变化在生物标志物阳性、认知未受损的患者中可检测到，并在临床AD中镜像出现。激活的CD8记忆T细胞和炎症性髓系程序存在于临床前组，并且在临床组中也存在——通常程度更大——而OSN显示出与先前在死后AD脑中报道的重叠的应激相关转录特征。总之，这些发现将微创OE采样定位为研究早期AD病理生物学的实用平台。
我们的分析支持这样一种观点，即OE活检提供了从其他组织不易获得的阶段相关神经读数。它采样了一个初级感觉神经上皮，位于CSF流出道附近的神经-免疫界面，其中OSN和驻留免疫细胞似乎记录了AD脑中描述的CNS相关信号。因此，OE活检可以提供关于神经免疫程序的组织水平背景，这是血浆或无细胞CSF等体液无法解析的。在更大研究中经过优化和确认后，OE分析可能有助于阐明早期AD病理生物学，与淀粉样蛋白和p-tau检测相辅相成。可以设想开发一个靶向面板，从最低限度处理的刷检活检材料中测量，并通过纵向随访评估预后价值。我们从22名受试者中报告的OE程序与AD脑文献一致，并为重点实验随访提供了具体基础。例如，OE髓系细胞中HLA-DQA2的上调与遗传和转录组学证据一致，表明HLA II类基因座内的通路导致晚发性AD风险，与激活的抗原呈递表型相容。相反，基于网络的人类AD皮层分析将EGR3调控降低确定为突触囊泡循环程序失调的潜在驱动因素，这与我们在AD各阶段观察到的髓系细胞下调一致。加上激活的T细胞表型和OSN-免疫串扰，这些模式支持一个模型，其中AD进展伴随着增强的神经炎症特征，这一框架也有助于解释AD中早期出现的嗅觉障碍。
已发表的嗅觉黏膜组织学报告，无论是来自活体还是尸检样本，都识别了AD病理学的经典标志，如淀粉样蛋白斑块和tau蛋白病变，但这些受试者患有晚期疾病，即Braak V-VI期。最近更优雅的AD单细胞研究分析脑区域也必然依赖于尸检样本。在这里，我们识别了活体受试者OE中特定的免疫细胞功能变化，伴随着神经元转录改变。这些发现与一个模型一致，即不仅是内嗅皮层，外周嗅觉器官也是AD病理生物学在早期、甚至临床前阶段的位点。是否存在因果关系，或病理学沿传入嗅觉通路传播，仍有待确定。例如，证据表明特定疱疹病毒可能沿着嗅球处的OSN突触，进而潜在地将神经炎症变化传播到内嗅皮层的下一个节点。无论如何，早期AD事件显然发生在OE，这提供了利用临床前AD受试者的OE刷检活检来进一步确定旨在阻止神经免疫或其他病理信号的最早期治疗靶点的理由。此外，OE和CSF之间的跨区室比较是使用匹配的T细胞群体和现代整合方法进行的，但队列组成、测序方案和诊断标签的跨研究差异仍可能影响明显的一致性。因此，我们将OE-CSF相似性解释为趋同模式，而非等同性的证明，并且我们不会推断跨组织的因果关系。明确的验证将需要在相同个体中进行前瞻性配对的OE和CSF采样，并进行正交蛋白质和功能分析。
嗅觉裂活检，即使由经验丰富的外科医生进行，捕获大量神经元的成功率也高度可变。这可能是由于多种因素，包括局部解剖变异、已知的表面上皮被呼吸样化生替代的可变模式，以及细胞悬液中神经元的选择性活力问题。因此，我们透明地报告了每位患者的产量和细胞类型分数，以使变异性明确（图1E）。最重要的是，我们特意设计我们的分析，聚焦于细胞类型内的转录对比，而非细胞类型的比例丰度。这种方法即使在总产量或特定细胞类型产量因活检而异时也能进行生物学推断。通过这样做，我们避免了可能将采样变异与疾病相关差异混为一谈的基于组成的声明，转而强调保守的、细胞内在的转录程序作为AD相关生物学最可靠的指标。此外，我们的分析基于公开可用的、在数百名受试者中验证过的人类基因表达程序，确保了一个完全可重复的工作流程，该流程将随着更多嗅觉活检数据集的生成而有效扩展。这里描述的单细胞图谱也可作为未来解卷积批量RNA-seq数据集以推断细胞类型分辨信号的参考，而不受活检组成的影响。作为一种免疫屏障防御结构，我们发现嗅觉上皮免疫细胞群体在嗅觉刷检活检中可靠捕获。未来的研究可能希望使用5' V(D)J兼容试剂将转录组与TCR序列结合，从而能够跨AD阶段进行T细胞克隆型分析。
内镜嗅觉裂刷检活检可以提供一种可行且可重复的方法，在任何疾病阶段对活体人类可及的神经上皮进行采样。在我们的队列中，对OE中免疫和OSN程序的单细胞分析揭示了与生物标志物定义的AD阶段相关的转录状态。需要更大规模、纵向研究，整合OE分析与CSF和血浆生物标志物、淀粉样蛋白和tau PET以及临床结局，以确定预后价值和机制。如果这些发现得到证实，OE分析可以通过阐明早期病理生物学，并通过为疾病修饰疗法的选择和监测提供信息，来补充现有模式。
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