背景：我们之前的观察性队列研究——鹿岛扫描研究（KSS），发现了生活方式与通过脑部磁共振成像检测到的脑小血管病（SVD）以及包括认知障碍和血管疾病在内的疾病结果之间的关联。然而，尚未考虑诸如遗传背景、饮酒和运动习惯以及社会经济状况等已确立的结果修饰因素。特别是关于遗传因素，预计ALDH2 rs671变异、东亚特有的多样性以及APOE状态会有强烈影响。KSS-2的目标是检查遗传背景、生活方式因素（包括饮酒习惯）、社会经济状况和/或SVD标记物在认知障碍、血管疾病和死亡中的相互作用。
方法：KSS-2是一项针对健康日本人群的前瞻性区域性观察研究，将阐明从中年开始根据不同基因型维持大脑健康的最佳生活方式。自费进行脑健康检查的日本成年人被纳入研究，并将进行为期10年的随访。我们将扩展KSS的方案，以包括遗传背景和潜在混杂因素，包括生活方式（包括饮酒和运动习惯）和社会经济状况，并进行生存分析。研究结果为认知障碍、血管事件和死亡。
结果：从2018年9月1日至2024年12月31日，我们纳入了908名健康成年人（平均年龄64.2岁；范围35至84岁；41%为男性）。
结论：本研究将为制定个体化的健康干预策略提供重要见解。
引言
背景
健康人的预防医学需要早期发现疾病，并考虑多种风险因素（包括基因多态性）之间的相互作用。由小血管（如毛细血管和脑膜动脉）损伤引起的脑小血管病（SVD），即使在任何神经系统症状出现之前，也可以通过脑成像识别为残留病变（即SVD标记物）。SVD的主要原因包括高血压性动脉硬化（即1型SVD）和脑淀粉样血管病（即2型SVD），它们是卒中和痴呆症的主要致病因素。可以通过脑MRI评估腔隙、脑微出血（CMBs）、白质高信号（WMH）、脑室周围高信号（PVH）、血管周围间隙（PVS）、皮质浅表性铁沉积（cSS）以及基于这些SVD标记物的综合评分系统（即总SVD评分），从而估计个体中SVD的主要致病途径。识别与个别SVD标记物以及总SVD评分相关的因素，将为卒中和痴呆的预防和管理提供重要的见解。
我们一直在继续一项名为鹿岛扫描研究（KSS）的观察性队列研究，该研究始于2005年。我们展示了健康日本成年人在接受包含脑MRI的健康筛查测试时与SVD相关的若干关联。例如，该队列首次报告深部或幕下区域的CMBs与健康成年人的认知障碍相关。我们还证明了总SVD评分（即总SVD评分）可以预测随后的脑心血管事件。
在这项新研究，鹿岛扫描研究2（KSS-2）中，我们计划纳入那些在普通人群中（尤其是日本人）尚未完全理解其与SVD关联的因素。这些因素包括基因多态性、饮酒习惯和社会经济状况。关于基因多态性和饮酒习惯，我们特别关注参与酒精代谢的醛脱氢酶2（ALDH2，rs671）和乙醇脱氢酶1B（ADH1B，rs1229984）。ALDH2基因不仅与饮酒习惯相关，还与各种疾病相关，包括恶性肿瘤、血管痉挛性心绞痛、卒中和痴呆。以前的研究报道罕见的NOTCH3变体和rs12204590变体（靠近FOXF2）与WMH负担相关。据报道，ALDH2与CMBs相关，而载脂蛋白E（APOE）与严格意义上的叶状微出血和cSS相关，但很少有研究调查健康人群与SVD标记物之间的联系。社会经济状况被认为是血管疾病和痴呆的主要可改变风险因素，但对于这一因素是否能独立与SVD相关知之甚少。因此，KSS-2的目标是阐明这些基因型、包括饮酒习惯的生活方式因素、社会经济状况和/或SVD标记物对健康日本中年人群认知障碍、血管疾病、肾功能不全、SVD进展和死亡的独立或协同影响。
图1 鹿岛扫描研究概述
鹿岛扫描研究（KSS）（上图）于2005年至2011年间，在日本医疗机构接受脑MRI检查的1738名参与者中开展，地方政府和雇主推荐并部分资助。KSS报告了生活方式与生活方式相关疾病、通过MRI诊断的脑小血管病（SVD）以及疾病结果之间的关联。目前KSS-2的协议（下图），从2018年至2024年招募患者，扩展了方法，包括基因背景、生活方式（包括饮酒和运动习惯）以及社会经济状况作为已确定的影响结果的因素。ALDH2，醛脱氢酶2基因；APOEε4，载脂蛋白ε4单倍型（rs429358 T>C和rs7412 C>C）。
方法
设计
KSS-2是一项针对神经健康成年人的前瞻性区域性观察性队列研究，将根据加强流行病学观察性研究报告指南进行报告。自2018年9月1日起，受试者在我们的中心（友爱会大田医院）自行承担费用进行包含脑MRI的健康筛查（在许多情况下，地方政府或他们工作的公司提供部分财政支持）时招募。受试者的入组于2024年12月31日结束。我们纳入了908名健康成年人（平均年龄64.2岁；范围35至84岁；41%为男性）。受试者将在入组后进行为期10年的随访。
参与者群体 - 纳入和排除标准
KSS-2的纳入和排除标准与KSS类似。纳入标准为：年龄≥20岁；无工具性日常生活活动能力障碍；提供书面知情同意书。排除标准为：无法进行脑MRI检查；有创伤性脑损伤或神经系统疾病的病史；有缺血性心脏病的病史；或体检中有神经系统异常。
基线评估
基线评估的详细信息见表1。所有受试者首先由普通医生或认证神经外科医生进行检查。怀疑有神经功能缺损或MRI上有异常发现的受试者随后由认证神经科医生进行神经学检查。记录的临床特征基本上与之前的KSS相同：年龄、性别、体重指数、吸烟状况、缺血性心脏病病史、教育年限、实际血压（BP）值以及高血压、糖尿病和血脂异常的存在。用于识别高血压、糖尿病和血脂异常的定义与之前的KSS相似（表S1）。基线时吸烟的受试者被分类为当前吸烟者。布林克曼指数使用问卷计算（表S2）。缺血性心脏病病史和教育背景通过与每位受试者的访谈获得。此外，在KSS-2中，我们还记录了通过问卷收集的酒精摄入量、运动习惯、职业和收入信息[表S2和S3]，以及心电图上房颤或心脏肥大的发现。关于KSS-2中的认知评估，蒙特利尔认知评估的日本版本（MoCA-J）由熟练的护士进行。
表1 鹿岛扫描研究2的研究方案
| 基线 | 第2年 | 第4年 | … | 第10年
--- |---|---|---|---|---
知情同意 | X | | | |
临床评估 | X | | | |
脑MRI | X | | | |
MoCA-J | X | | | |
血液和尿液检测，心电图 | X | | | |
基因测试（ALDH2、ADH1B、APOE） | X | | | |
关于脑心血管事件的问卷* | | X | X | … | X
关于MCI状态的问卷 | | | | | X
ADH1B，乙醇脱氢酶1B基因；ALDH2，醛脱氢酶2基因；APOE，载脂蛋白E基因；ECG，心电图；MCI，轻度认知障碍；MoCA-J，蒙特利尔认知评估的日本版本；MRI，磁共振成像。
*参与者将被分为两组，其中一半在奇数年收到调查，另一半在偶数年收到调查，这意味着每个参与者每两年会收到一次关于过去两年发生事件的调查。
MRI结果评估
所有脑MRI将使用1.5-T扫描仪进行。我们将在MRI上评估以下SVD标记物：腔隙、CMBs、WMH、PVH、cSS和脑萎缩。个体SVD标记物将根据验证过的评分方法和评分系统进行评估。腔隙定义为直径3至15毫米的局灶性、边界清晰的病灶，在T2加权图像（WI）上显示高强度，在T1WI上显示低强度。CMBs定义为在T2*梯度回波上的圆形信号丢失区域，直径2–10毫米。软脑膜血管的流空伪影和因钙化导致的苍白球对称性低信号被排除在外。T2WI和FLAIR成像上的WMH或PVH严重程度根据Fazekas量表进行评级（WMH：1级，点状；2级，早期融合；3级，融合；PVH：1级，帽状或线状；2级，带状；3级，延伸至深部白质的不规则分布）。PVS在轴向T2加权MRI上使用验证过的视觉评分量表进行评级。PVS被定义为小型、边界清晰的结构，具有与脑脊液相同或非常相似的信号强度，测量值为3毫米，并沿穿通或髓质血管走行。PVS在基底节和半卵圆中心（CSO）区域进行评估。对于这两个区域，PVS评分如下：0 = 无PVS；1 = 1–10个PVS；2 = 11–20个PVS；3 = 21–40个PVS；4 = 40个或更多PVS。数字指一侧大脑的PVS数量：在审查所有相关切片以评估解剖区域后，记录具有最高PVS数量的切片和侧面的评分。cSS被定义为表面皮层上或覆盖其上的慢性血液产物。cSS的严重程度和分布被分类为局灶性（限制在≤3个沟）或弥散性（≥4个沟）。
关于总SVD负担，还将评估总SVD评分。它范围从0到4，根据先前开发的评分系统进行评估。腔隙或CMBs的存在定义为存在一个或多个焦点（各1分）；中度至重度WMH或PVH的存在定义为融合的深部WMH（Fazekas评分2或3）和/或延伸至深部白质的不规则PVH（Fazekas评分3）（1分）；中度至重度PVS的存在（1分）。为了计算总CAA MRI SVD评分，范围从0到6分，我们还将评估叶状CMBs、cSS、CSO-PVS和WMH。叶状CMBs的评分标准如下：1 = 2–4个CMBs；2 = ≥5个CMBs。如果cSS是局灶性的则得1分，如果是弥散性的则得2分。CSO-PVS中度至重度PVS（等级3或4）得1分。如果Fazekas评分为≥2，则WMH得1分。
个体SVD标记物将由认证的卒中神经科医生评估。这些变量的评定者间信度值将使用Cohen’s kappa值表示。特定协议的更多细节见表S4。
生物材料
在健康筛查检查时采集外周血样本进行血液检测和随机尿样本进行尿液检测。剩余的血清（约6毫升）被冷冻并储存在佐贺大学医学院内科系神经病学科。尿液检测包括检测尿糖和蛋白质水平。
基因检测
我们使用从颊粘膜提取的DNA通过实时PCR评估ALDH2、ADH1B和APOE的多态性。将收集颊拭子并浸入蒸馏水中。离心去除上清液后得到的沉淀物将溶解在Direct PCR裂解试剂（VIAGEN生物技术公司，洛杉矶，加利福尼亚州，美国）和蛋白酶K中，于55°C孵育过夜，然后在85°C孵育45分钟，并用作PCR模板。TaqMan® SNP基因分型试验将使用由引物和探针组成的混合试剂（C__11703892_10，C___3084793_20，C___904973_10，分别用于ALDH2 rs671（G>A）、ADH1B rs1229984（A>G）、APOE rs429358（T>C）和rs7412（C>T））按照制造商（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）提供的协议进行。APOE基因型将根据表S5确定。从参与者获得的DNA可用于二次用途。
随访计划
受试者将从进入研究起随访10年。为了获取有关脑心血管事件和全因死亡的信息，我们将每两年发送一次调查问卷（表S6）给所有受试者（表1）。我们将脑心血管事件定义为脑血管事件（即脑梗死、短暂性脑缺血发作[TIA；定义为在24小时内恢复且弥散加权成像上无明显异常的暂时性神经功能缺损]、脑出血或住院治疗的蛛网膜下腔出血）和心血管事件（即心肌梗死、心绞痛、主动脉夹层或住院治疗的急性心力衰竭）。当报告任何事件时，作者将访问治疗参与者的医院并获取医疗记录。从随访问卷中信息不完整的受试者将被排除。随访期将根据从受试者处收到有效回复的时间段估算。进入研究10年后，将向家庭成员发送有关认知下降（如老年人认知下降告知者问卷）的问卷，或通过电话采访参与者、他们的家人和他们的初级保健医生，以检查是否转变为轻度认知障碍或痴呆。
主要结果
认知障碍、脑心血管疾病和死亡
次要结果
SVD进展和肾功能受损
样本量估算
我们之前曾报告了一项横断面研究的证据，该研究涉及KSS参与者的一个子集（N = 518，平均年龄56.1岁；范围33至85岁；包括35名CMBs参与者），表明CMBs（解释变量）对轻度认知障碍（简易精神状态检查评分<27）的比值比为5.44。基于该研究，KSS-2中检测到类似关联所需的样本量为518，功效为0.9，α误差为0.05。此外，我们报告了KSS中1349名参与者（平均年龄57.7岁；范围22至85岁）的生存分析，其中包括96名基线SVD≥2的参与者。经过平均6.7年的随访，发生了35例脑血管事件，给出的样本量估算为620，随访时间为5年，功效为0.9，α误差为0.05。考虑到9.0%的脱落率，需要690人来重现该关联。年龄在确定样本量方面至关重要，因为其对事件发生的影响，由于KSS-2是在与先前KSS相同的机构进行的，我们预计年龄分布相似，但KSS-2参与者的平均年龄大约高出6至8岁，因此预计会有更多事件。另一方面，ALDH2和APOE基因的交互作用尚未报告，难以确定所需的样本量。鉴于这种情况，我们设定了850至900的最大可实现样本量。
统计分析
统计分析将使用SAS软件（版本9.4；SAS Institute，卡里，北卡罗来纳州，美国）进行。单变量分析将根据适当情况使用Fisher精确检验、t检验、Mann-Whitney U检验和方差分析进行。生存分析将主要使用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型进行。解释变量将重点关注SVD效应以及SVD和基因背景（rs671、rs1229984、rs429358、rs7412）的交互效应。此外，还将考虑生活方式与SVD或基因背景之间的交互作用，以生成有助于个性化疾病预防的证据。将根据适当情况进行横断面和分层分析。此外，将使用包括结构方程建模在内的方法进行变量间的关联分析。
研究组织
KSS由佐贺大学和关西医科大学（KMU）组织。
讨论
KSS-2将确定基因型（例如，ALDH2、ADH1B和APOE）、SVD负担和/或生活方式因素如何与认知障碍、脑心血管疾病和死亡相互作用。在次要分析中，我们将评估目标基因型、SVD负担和/或生活方式因素是否与SVD进展和肾功能受损相互作用。
先前的一项研究报道了东西方人群中CMBs解剖分布的差异。东亚人群具有较高的深部和幕下或混合CMBs患病率，暗示不同种族之间在年龄、高血压或与生活方式相关的SVD（即1型SVD）方面存在差异。醛脱氢酶2基因的缺陷等位基因ALDH22在东亚的频率高于西方国家。几乎一半的日本人携带ALDH22。KSS-2将从基因和东亚生活方式或文化视角探索不同种族之间散发性SVD病理的原因差异。
结论
KSS-2是一项针对健康日本人群的前瞻性区域性观察性研究，将阐明根据不同基因型从中年开始维持大脑健康的最佳生活方式。
缩写词
ADH1B 乙醇脱氢酶1B
ALDH2 醛脱氢酶2
APOE 载脂蛋白E
CMBs 脑微出血
cSS 皮质浅表性铁沉积
KSS 鹿岛扫描研究
MoCA-J 蒙特利尔认知评估的日本版本
PVH 脑室周围高信号
PVS 血管周围间隙
SVD 脑小血管病
WMH 白质高信号
声明
伦理批准和参与同意
在研究开始前，所有受试者均提供了书面知情同意。本研究根据《赫尔辛基宣言》、《人类基因组和基因研究伦理准则》以及《涉及人类受试者的医学和生物科学研究伦理准则》进行。协议首先于2018年8月获得佐贺大学医学院机构审查委员会的批准（批准号30-11和R4-24）。由于主要研究者（Y.Y.）的调动，本研究最终获得了KMU（当前代表机构）机构审查委员会的批准（批准号2021345）。友爱会大田医院的批准也在2024年6月获得（批准号20240618）。
出版同意
所有参与者均提供了书面同意。
数据和材料的可用性
支持本研究发现的数据可从通讯作者处合理请求获得。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
资金
这项工作得到了科学研究补助金（C类）、JSPS KAKENHI（资助号22K17328和24K13494）以及佐贺大学的地区未来创造项目（Chiiki-Mirai-Sosei项目）的支持。
作者贡献
概念化，Y.Y.；研究设计，Y.Y.；调查，K. Suzuyama, T.H., A.O., J.N., T.H., S.I., T.D., M.M., Y.G., Y.K., K.K., 和 Y.O.；数据整理，K. Suzuyama 和 A.M.；统计分析，K. Suzuyama, M.T., 和 A.M.；撰写—原始草稿准备，K. Suzuyama；撰写—审阅和编辑，A.M., H.K., 和 Y.Y.；可视化，K. Suzuyama, A.M. 和 Y.Y.；监督，A.M., H.K., 和 H.H. 所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。
致谢
不适用。
参考文献
(全文结束)
